ACAT1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與預(yù)后評(píng)估價(jià)值

周慧?李文超?黃少卓?蕭展毅?哈睿南?熊志勇?劉波?胡昆鵬

【摘要】目的 分析乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶1（ACAT1）在肝癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法 從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載371例肝癌患者癌組織和50例癌旁組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床信息，使用t檢驗(yàn)分析ACAT1在肝癌組織與癌旁組織的表達(dá)情況，利用方差分析檢驗(yàn)ACAT1與患者腫瘤分期[2017年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）分期標(biāo)準(zhǔn)]、病理分級(jí)間的關(guān)系;根據(jù)ACAT1表達(dá)量中位值將患者分為ACAT1高、低表達(dá)2組，采用Kaplan-Meier法分析ACAT1對(duì)肝癌的預(yù)后價(jià)值;Cox回歸分析探討ACAT1是否為判斷肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;采用實(shí)時(shí)定量PCR法驗(yàn)證76例肝癌患者癌組織和癌旁組織ACAT1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異，蛋白免疫印跡法驗(yàn)證4例肝癌患者癌組織和癌旁組織ACAT1蛋白水平的表達(dá)差異。結(jié)果 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示在371例肝癌患者的癌組織中，ACAT1的mRNA表達(dá)水平降低（P < 0.001），并隨著腫瘤臨床分期（StageⅠ ～ Ⅲ期）及病理分級(jí)（G1 ～ G4級(jí)）的升高而降低（P均< 0.001），ACAT1低表達(dá)組肝癌患者的總生存率低于高表達(dá)組（P < 0.001），且ACAT1表達(dá)可成為判斷肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子（P = 0.029）。經(jīng)PCR法和蛋白免疫印跡法驗(yàn)證，無(wú)論是在mRNA轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白表達(dá)水平上，肝癌組織ACAT1的表達(dá)量都低于癌旁組織。結(jié)論 ACAT1在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下降，可作為肝癌臨床診斷及預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶1;肝癌;診斷;預(yù)后

The expression pattern and prognostic value of ACAT1 in hepatocellular carcinoma Zhou Hui， Li Wenchao， Huang Shaozhuo， Xiao Zhanyi， Ha Ruinan， Xiong Zhiyong， Liu Bo， Hu Kunpeng. Department of General Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Hu Kunpeng， E-mail： hkpdhy918@ 126. com

【Abstract】Objective To evaluate the expression level of acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 1 （ACAT1） and its clinical significance in hepatocellular carcinoma （HCC）. Methods RNAseq and clinical information of 371 HCC and 50 paracancerous samples were obtained from The Cancer Genome Atlas （TCGA） database. The expression pattern of ACAT1 in the HCC and paracancerous samples was statistically compared by t-test. The relationship among ACAT1， tumor staging （AJCC staging criteria） and pathological grading was analyzed by using ANOVA. All patients were classified into the low-and high-ACAT1 expression groups according to the median value of ACAT1 mRNA expression. The prognostic value of ACAT1 for HCC was assessed by Kaplan-Meier method. Whether ACAT1 could be an independent prognostic factor of HCC patients was evaluated by Coxs regression analysis. The expression profile of ACAT1 mRNA between 76 paired HCC and paracancerous tissues was analyzed by real-time quantitative PCR （qRT-PCR）. The expression pattern of ACAT1 protein between 4 paired HCC and paracancerous tissues was analyzed by Western blot. Results TCGA database revealed that the expression levels of ACAT1 were significantly down-regulated in 371 HCC tissues （all P < 0.001）， and remarkably decreased along with the higher tumor clinical staging （stage Ⅰ-stage Ⅲ） and pathological grading （G1-G4） （all P < 0.001）. The overall survival of HCC patients with low ACAT1 expression was significantly lower compared with that of those with high ACAT1 expression （P < 0.001）. The expression of ACAT1 could serve as an independent risk factor for predicting the prognosis of HCC patients （P = 0.029）. qRT-PCR and Western blot demonstrated that the expression of ACAT1 in the HCC samples was significantly lower than that in the paracancerous samples at the mRNA and protein levels. Conclusion The expression level of ACAT1 is down-regulated in HCC tissues， which can be a molecular biomarker for clinical diagnosis and prognosis assessment for HCC.

【Key words】Acetyl-coenzyme A acetyltransferase 1;Hepatocellular carcinoma;Diagnosis;Prognosis

肝細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌，現(xiàn)已成為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。肝細(xì)胞癌的主要致病因素為慢性乙型肝炎和黃曲霉毒素B1中毒，中國(guó)屬于肝癌高發(fā)地區(qū)，隨著慢性肝臟疾病的患病率逐年上升，肝細(xì)胞癌的發(fā)病率也將不斷增加，盡管肝細(xì)胞癌的預(yù)防、檢測(cè)、診斷和治療手段取得了很大進(jìn)步，但由于肝癌復(fù)雜的病理機(jī)制以及易侵襲、轉(zhuǎn)移的特性，使得患者的預(yù)后仍不盡人意[2]。因此，尋找新的分子生物標(biāo)志物，對(duì)肝癌具有重要的臨床意義。

乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶（ACAT），又稱(chēng)乙酰乙酰輔酶A硫解酶、β-酮硫解酶，在哺乳動(dòng)物中存在2種亞型，分別為ACAT1和ACAT2，ACAT1位于線(xiàn)粒體上，ACAT2位于細(xì)胞質(zhì)里[3]。線(xiàn)粒體ACAT1主要參與體內(nèi)酮體和異亮氨酸的代謝，催化兩分子乙酰輔酶A合成乙酰乙酰輔酶A的可逆過(guò)程，在肝內(nèi)主要參與酮體生成，而在肝外組織主要參與酮體分解。ACAT1缺乏或突變是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，臨床上，輕度患者無(wú)明顯癥狀或?yàn)閲I吐、腹瀉、脫水等代謝性酸中毒癥狀，重度患者則可能出現(xiàn)昏迷、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育落后甚至死亡[4-6]。近年來(lái)，有研究者發(fā)現(xiàn)ACAT1在前列腺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌中，參與了腫瘤耐藥和細(xì)胞增殖過(guò)程，亦有研究者發(fā)現(xiàn)ACAT1的下調(diào)可能是腎透明細(xì)胞癌的保護(hù)因素[7-9]?？梢?jiàn)，ACAT1基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥等方面可能存在密切聯(lián)系，ACAT1有望成為腫瘤治療潛在的重要分子靶點(diǎn)。然而，ACAT1在肝癌中的研究鮮有報(bào)道，因此，我們將分析ACAT1在肝癌中的表達(dá)情況，評(píng)估其在肝細(xì)胞癌中的診斷、預(yù)后評(píng)估價(jià)值。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

研究中使用的76對(duì)肝癌組織和癌旁組織標(biāo)本來(lái)源于2003年1月至2019年12月期間在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院行肝癌切除術(shù)的患者，所有標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)過(guò)石蠟包埋、HE染色并有明確病理診斷，其中男50例、女26例。所有患者均簽署知情同意書(shū)。

二、數(shù)據(jù)下載

研究中使用的371例肝癌患者（其中有50例包含癌組織和癌旁組織，其余321例僅包括癌組織）ACAT1基因測(cè)序信息及臨床信息來(lái)源于美國(guó)腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究分析了上述343例（剔除臨床信息不全病例后）肝癌患者腫瘤組織（n = 343）和癌旁組織（n = 50）ACAT1的mRNA表達(dá)水平及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。最后以ACAT1的mRNA表達(dá)量中位值為界，將這343例肝癌患者分為ACAT1高表達(dá)組和ACAT1低表達(dá)組，分析ACAT1對(duì)肝癌患者的預(yù)后價(jià)值。

三、實(shí)時(shí)定量PCR

使用Trizol-RNA提取試劑（Sigma）提取76例新鮮冷凍肝癌組織樣本及癌旁組織樣本的總RNA，并使用Transcriptor cDNA Synth.Kit2逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（羅氏）將1.0 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以PCR儀（頂部加熱型）65℃加熱10 min，添加剩余成分后25℃10 min→55℃30 min。最后使用SYBR GREEN I MASTER （羅氏）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)（10 μl反應(yīng)體系）。β-actin作為內(nèi)參基因。PCR設(shè)置程序?yàn)椋旱谝徊?5℃ 5 min，第二步95℃ 10 s→60℃ 20 s→72℃ 20 s 40個(gè)循環(huán)，第三步95℃ 5 s→65℃ 1 min→97℃ 5 min→40℃ 10 s。采用Log2-△△Ct （△Ct = CtACAT1-Ctβ-actin）公式算出肝癌組織與癌旁組織間ACAT1的mRNA相對(duì)表達(dá)量，以ACAT1的mRNA表達(dá)量中位值為界，將患者分為ACAT1高表達(dá)組和ACAT1低表達(dá)組。實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列如下，ACAT1上游引物序列：5-GAGGTGCTTCTGCCATGCTA-3，ACAT1下游引物序列：5-TGGTCACATAGGGTTGTCTCCT-3，β-Actin上游引物序列：5-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3，β-Actin下游引物序列：5-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3。

四、蛋白免疫印跡法

使用RIPA裂解液提取4例肝癌患者腫瘤組織和癌旁組織蛋白，BCA法（Thermo scientific）測(cè)定蛋白濃度，取50 μg蛋白制備樣品;將上述樣品上樣至10% SDS-PAGE凝膠，恒壓60 V電泳30 min將樣品壓至分離膠，改換恒壓120 V至電泳結(jié)束;隨即恒壓100 V下轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白轉(zhuǎn)至0.22 μm PVDF膜上;5%脫脂牛奶封閉2 h，目的條帶置于ACAT1一抗稀釋液中（1∶1000，Abcam），內(nèi)參條帶置于β-actin一抗稀釋液（1∶ 1000，ABclonal）中4℃孵育過(guò)夜;室溫孵育兔二抗（1∶5000，ABclonal）1 h，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，分析ACAT1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 7.0處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，等級(jí)資料以例（%）表示。采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中50例肝癌患者癌組織與對(duì)應(yīng)的癌旁組織ACAT1的表達(dá)差異，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)從整體水平分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中343例肝癌組織與50例癌旁組織ACAT1的表達(dá)差異;配對(duì)t檢驗(yàn)分析76例肝癌患者癌組織和癌旁組織ACAT1的表達(dá)差異;ACAT1表達(dá)量與臨床分期 [2017年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）分期標(biāo)準(zhǔn)]、病理分級(jí)間的關(guān)系采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn);采用受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)評(píng)價(jià)ACAT1對(duì)肝癌的診斷價(jià)值;用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，組間比較用log-rank 檢驗(yàn);采用單因素與多因素Cox回歸分析（進(jìn)入法）肝癌患者預(yù)后的影響因素。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、ACAT1基因TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)所獲得的343例肝癌患者中，與50例癌旁組織的正常肝組織相比，ACAT1在肝癌組織中表達(dá)下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.001），見(jiàn)圖1A。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)所獲得的50例肝癌患者中，與癌旁正常組織相比，ACAT1在肝癌組織中表達(dá)下降（P < 0.001），見(jiàn)圖1B。隨著患者腫瘤臨床分期（StageⅠ期 ～ Ⅲ期）及病理分級(jí)（G1 ～ G4級(jí)）升高，ACAT1的轉(zhuǎn)錄水平不斷下降（總體P均< 0.001），見(jiàn)圖2。以ACAT1 mRNA表達(dá)水平的中位值（42.473905）為界，將患者分為ACAT1高表達(dá)組和ACAT1低表達(dá)組。Kaplan-Meier分析顯示，ACAT1高表達(dá)組總生存率高于ACAT1低表達(dá)組（HR = 0.437， 95% CI= 0.289 ～ 0.585，P < 0.001），見(jiàn)圖3。

單因素Cox回歸分析顯示，肝癌患者術(shù)后總生

存率的影響因素包括臨床分期（P < 0.001）、腫瘤T分期（P < 0.001）、ACAT1 mRNA表達(dá)量（P = 0.002），進(jìn)一步多因素Cox回歸分析顯示，ACAT1 mRNA的表達(dá)量跟肝癌患者術(shù)后總生存率相關(guān)，是肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子（HR = 0.991， 95%CI = 0.982 ～ 0.999， P = 0.029），見(jiàn)表1。

二、肝癌組織和癌旁組織mRNA和蛋白分析結(jié)果

76例肝癌患者的癌組織與癌旁組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，肝癌組織中ACAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織（P < 0.001），見(jiàn)圖4A。此外，本中心4對(duì)肝癌患者癌組織與癌旁組織蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，肝癌組織中ACAT1蛋白表達(dá)水平低于癌旁組織，見(jiàn)圖4B。

討論

在過(guò)去幾十年里，全球原發(fā)性肝癌的發(fā)病率一直在上升，肝細(xì)胞癌為肝癌的主要類(lèi)型[10]。治療上，早期肝癌患者可采用手術(shù)切除或肝癌局部消融治療;中期肝癌患者可采用局部化學(xué)治療栓塞等;而到了晚期，患者雖可采用索拉非尼、雷格拉非尼等激酶抑制劑治療，但治療手段及效果都非常有限。目前，甲胎蛋白是肝癌里應(yīng)用最廣泛的生物標(biāo)志物，但由于靈敏度不高，其診斷價(jià)值有限[11]。由此可見(jiàn)，尋找新的分子生物標(biāo)志物，提高肝癌的診斷及預(yù)后判斷能力顯得尤為重要。

ACAT1是位于細(xì)胞線(xiàn)粒體上的酮體代謝酶，催化酮生成和酮解過(guò)程中乙酰輔酶A和兩個(gè)乙酰輔酶A分子之間的可逆轉(zhuǎn)換。在肝臟的酮生成過(guò)程中，ACAT1催化兩分子乙酰輔酶A生成乙酰乙酰輔酶A，而在肝外組織的酮分解過(guò)程中，ACAT1促進(jìn)乙酰乙酰輔酶A分解為兩分子乙酰輔酶A[12]。有研究者發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中，ACAT1的表達(dá)量較正常前列腺細(xì)胞增加，且ACAT1的上調(diào)與前列腺癌的低分化、高侵襲性以及較差的預(yù)后相關(guān)[13-14]。在乳腺癌中，ACAT1可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)展[15]。在子宮癌的阿霉素治療過(guò)程中，ACAT1可通過(guò)增加細(xì)胞增殖能力、減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞形成對(duì)阿霉素耐藥性[16]。ACAT1促進(jìn)了還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸和脂肪的生成，促進(jìn)了結(jié)直腸癌的發(fā)生[8]。以上研究結(jié)果提示，ACAT1可能作為促癌基因，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。

本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中371例肝癌患者的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中，ACAT1的mRNA表達(dá)水平明顯低于正常肝組織，并且在對(duì)76例肝癌患者PCR分析與4例患者的蛋白免疫印跡分析中，我們驗(yàn)證了ACAT1在肝癌中的這種差異表達(dá)。TCGA分析還顯示，隨著肝癌患者腫瘤的臨床分期（StageⅠ ～ Ⅲ期）及病理分級(jí)（G1 ～ G4級(jí)）的升高，ACAT1的轉(zhuǎn)錄水平不斷下降。由于Stage Ⅳ期的樣本量較?。╪ < 10），與Stage Ⅰ期相比，ACAT1的表達(dá)量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們還發(fā)現(xiàn)，ACAT1對(duì)診斷肝癌和非肝癌患者預(yù)后有良好的提示作用，在ACAT1表達(dá)量低的肝癌患者中，其總生存率遠(yuǎn)低于ACAT1表達(dá)量高的肝癌患者，且ACAT1表達(dá)量低是肝癌患者低生存率的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。綜上所述，我們推測(cè)ACAT1可能作為一個(gè)抑癌基因在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起作用。與我們的研究結(jié)果相似的是有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在腎透明細(xì)胞癌中，ACAT1在癌組織中的表達(dá)較癌旁正常組織明顯減少且與不良預(yù)后相關(guān)[9， 17]。

ACAT1在不同腫瘤中的表達(dá)情況不盡相同，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展作用也并未得到一致的結(jié)論。由于肝細(xì)胞內(nèi)缺乏分解酮體的反應(yīng)酶體系，肝內(nèi)ACAT1主要參與酮體生成，在肝外ACAT1主要參與酮體分解，許多體內(nèi)外研究表明，酮體能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，生酮飲食能減少小鼠腫瘤體積，增加生存時(shí)間[18-19]。我們認(rèn)為，可能由于ACAT1在肝內(nèi)外組織中參與的酮體代謝過(guò)程的差異，導(dǎo)致ACAT1在肝內(nèi)外腫瘤中的表達(dá)情況與作用不一致。因此，需要更進(jìn)一步地探索ACAT1在腫瘤尤其是在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-10-10）

（本文編輯：楊江瑜）