趨化因子CXCL13及其受體CXCR5在1型糖尿病DPNP中的作用機制

周澤麟?李巧云?李雅?汪雯?趙忠球?梅之南

【摘要】目的 探討趨化因子CXCL13及其受體CXCR5在1型糖尿病引發(fā)的糖尿病性周圍神經(jīng)病理性疼痛（DPNP）中的作用機制。方法 將36只C57BL/6小鼠隨機分為C57BL/6空白對照組和C57BL/6模型組（每組18只）。C57BL/6模型組采用腹腔注射鏈脲佐菌素（60 mg/kg）構建1型糖尿病模型。每周觀測小鼠的體質量、血糖、機械痛和熱痛閾值。于第15周檢測2組脊髓中趨化因子、趨化因子受體和促炎因子水平的變化以及血清中炎癥因子的變化。在上述試驗基礎上，再分別取12只C57BL/6小鼠和12只CXCR5-/-小鼠按前述方法分別設立對照組和模型組（每組6只），于第4周檢測各組機械痛敏、第6周檢測熱痛敏。結果 C57BL/6模型組小鼠的脊髓中CXCL13和CXCR5等趨化因子及其受體的mRNA明顯上調（P均< 0.05）。C57BL/6模型組小鼠血糖升高、體質量減少，第4周的機械痛閾值降低、第6周的熱痛閾值降低（P均< 0.05），但CXCR5-/-模型組小鼠機械痛和熱痛閾值無變化。與C57BL/6空白對照組比較，C57BL/6模型組小鼠的星形膠質細胞標志物膠質纖維酸性蛋白、小型膠質細胞標志物離子鈣結合銜接分子1以及炎癥因子標志物環(huán)氧化酶-2、IL-1β以及磷酸化的絲裂原活化蛋白激酶（ERK）和信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）的水平升高（P均< 0.05）;血清中炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β蛋白水平升高（P均< 0.01）。結論 趨化因子CXCL13及其受體CXCR5的激活或可促使1型糖尿病DPNP的發(fā)生，相關機制可能是通過激活膠質細胞與磷酸化的ERK、STAT3和炎癥因子表達實現(xiàn)的。

【關鍵詞】CXCL13;CXCR5;1型糖尿病;糖尿病性周圍神經(jīng)病理性疼痛;膠質細胞

Role and mechanism of chemokine CXCL13 and its receptor CXCR5 in type 1 diabetic neuropathic pain Zhou Zelin， Li Qiaoyun， Li Ya， Wang Wen， Zhao Zhongqiu， Mei Zhinan. School of Pharmacy， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074， China

Corresponding author， Mei Zhinan， E-mail： meizhinan@ 163. com

【Abstract】Objective To explore the role of chemokine CXCL13 and its receptor CXCR5 in diabetic peripheral neuropathic pain （DPNP） induced by type 1 diabetes. Methods Thirty six C57BL/6 mice were randomly divided into the C57BL/6 blank control group （n = 18） and C57BL/6 model group （n = 18）. The animals in the model group were intraperitoneally injected with streptozotocin （60 mg/kg） for consecutive 4 days to induce DPNP. The body weight， blood glucose level and pain threshold were observed every week in two groups. After 15 weeks， the expression changes of chemokine CXCL13， chemokine receptor Cxcr5 and pro-inflammatory factors at the mRNA and protein levels in the spinal cord tissue were detected in two groups. Twelve C57BL/6 mice and 12 CXCR5-/- mice were randomly divided into the blank control group （both n = 6） and model group （both n = 6）. The experimental procedures and detection indexes were the same as those of 36 C57BL/6 mice. Results The expression levels of CXCL13 and its receptor CXCR5 mRNA in the C57BL/6 model group were significantly higher than those in the C57BL/6 blank control group （both P < 0.05）. Compared with the C57BL/6 blank control group， the blood glucose level was significantly higher and the body mass was remarkably less in the? C57BL/6 model group （both P < 0.05）. In the C57BL/6 model group， threshold of mechanical abnormal pain decreased at the 4th week， and threshold hot pain was decreased at the 6th week. CXCR5-/- mice did not show significant changes in pain sensitivity. In the C57BL/6 model group， astrocyte-specific glial fibrillary acidic protein （GFAP） and microglia marker ionized calcium binding adapter molecule 1 （IBA1） in the spinal cord tissues were activated. Compared with the C57BL/6 blank control group， the expression levels of COX-2， IL-1β， phosphorylated extracellular signal-regulated kinase （pERK）， phosphorylated protein kinase B （pAKT） and phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3 （pSTAT3） were remarkably up-regulated， and the serum levels of IL-6、 TNF-α and IL-1β were significantly increased （all P < 0.05）. Conclusions CXCL13 and CXCR5 can induce DPNP? of type 1 diabetic， probably by activating the glial cells， pERK， pSTAT3 and inflammatory factors.

【Key words】CXCL13;CXCR5;Type 1 diabetes;Diabetic peripheral neuropathic pain;Glial cells

糖尿病是一種常見的代謝性疾病，可引發(fā)許多相關并發(fā)癥。糖尿病性周圍神經(jīng)病理性疼痛（DPNP）是一種慢性疼痛綜合征，機械痛和熱痛覺過敏是其主要臨床表現(xiàn)[1-2]。糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病機制十分復雜，目前認為，趨化因子通過脊髓中不同形式的神經(jīng)元-膠質細胞相互作用來引發(fā)DPNP[3]。最近有研究表明，趨化因子參與2型糖尿病DPNP的發(fā)病過程[4]。在外周組織炎癥和神經(jīng)損傷引起的慢性疼痛的病理過程中，趨化因子CXCL13及其受體CXCR5（CXCL13/CXCR5）參與了三叉神經(jīng)痛和脊髓神經(jīng)結扎（SNL）誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛[5]。本課題組的前期研究表明，在db/db小鼠模型中，CXCL13/CXCR5有引發(fā)2型糖尿病DPNP的作用[6]。但是，1型糖尿病引起的DPNP與CXCL13 /CXCR5的關系我們尚未見報道。鑒于此，本課題組通過鏈脲佐菌素（STZ）構建1型糖尿病小鼠模型，探討CXCL13/CXCR5在1型糖尿病DPNP中的作用機制。

材料與方法

一、材 料

1.實驗動物

雄性7周齡無特定病原體級的健康清潔C57BL/6小鼠48只，體質量（22±2）g，購自北京維通利華動物科技有限公司，實驗動物生產許可證：SYXK （Beijing） 2016-0006，實驗單位使用許可證號：SYXK （E） 2016-0089。CXCR5-/-小鼠[B6.129S2 （Cg）-CXCR5tm1Lipp/J]12只，購自美國Jackson Laboratory。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±2）℃，濕度（55±15）%，光照間隔12 h。小鼠在整個實驗過程中自由飲水攝食。實驗操作嚴格遵循中南民族大學實驗動物中心的管理指南和行為規(guī)范，所有操作均符合實驗動物倫理要求。對小鼠的分組均采用隨機數(shù)字表法。

2.試 劑

STZ購自美國Sigma。蛋白激酶B（AKT）抗體

（#4685）、磷酸化的AKT（pAKT，Ser473，#4060）、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3，#12640）、磷酸化的STAT3（pSTAT3，Tyr705，#52075）、絲裂原活化蛋白激酶1/2抗體p44/42 MAPK （ERK， #4695）、p-p44/42 MAPK（ERK， Thr202/Tyr204， #4370）購自美國 Cell Signaling Technology。CXCL13 （orb 101825） 購自英國Biorbyt。CXCR5 （EPR8837）購自美國Abcam。內參蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，#6176106）購自美國Affinity。小鼠IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA檢測試劑盒、定量逆轉錄PCR試劑盒購自美國Thermo。Trizol購自日本Takara。引物由北京擎科生物公司合成。

二、方 法

1. 1型糖尿病小鼠模型的構建

使用檸檬酸緩沖溶液（pH = 4.5）溶解STZ，C57BL/6模型組小鼠（18只）連續(xù)4 d接受腹腔注射STZ，劑量為60 mg/kg;C57BL/6空白對照組（18只）注射等劑量的檸檬酸緩沖溶液。C57BL/6模型組注射STZ 1周后，隨機血糖平均水平> 16.7 mmol/L，即造模成功。注射STZ 8周后，C57BL/6模型組小鼠表現(xiàn)出DPNP。在此實驗基礎上，另取CXCR5-/-小鼠（6只）和同周齡的C57BL/6小鼠（6只）注射STZ以構建1型糖尿病模型;再取CXCR5-/-小鼠（6只）和同周齡的C57BL/6小鼠（6只）設為對應的空白對照組，注射等劑量的檸檬酸緩沖液。

2.行為學測試

于每周同一日8：00 ～ 9：00測量所有小鼠的體質量和空腹血糖，并于注射STZ后第4周檢測小鼠機械痛敏，第6周檢測熱痛敏。機械痛敏測試：使用von Frey細絲（0.16、0.4、0.6、1.0、1.4和2.0 g），以升序均速刺激小鼠后爪，直到小鼠后爪有明顯的縮回動作算作有效刺激。在此閾值上下各刺激5次，用中位數(shù)法計算50%的反應閾值。熱痛敏測試：采用熱源從底部玻璃透射到小鼠后爪，從開始投射熱源至小鼠縮回后爪的時間定義為后爪縮回潛伏時間（截止時間15 s），每只小鼠在熱刺激強度相同情況下測定5次熱痛敏，取平均值為有效閾值。

3.定量逆轉錄PCR實驗檢測趨化因子及趨化因子受體的mRNA

注射STZ 15周后用異氟烷麻醉C57BL/6小鼠并取出其脊髓，用Trizol法提取脊髓RNA，按照試劑盒說明將其逆轉錄成互補DNA，反應體系為 20 μl，反應條件為42℃ 60 min，70℃ 5 min。根據(jù)定量逆轉錄PCR試劑盒說明，檢測30種趨化因子及13種趨化因子受體mRNA的相對表達量，反應體系為 20 μl，反應條件為：先95℃ 2 min，后95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 1 min，共44個循環(huán)。

4.蛋白免疫印跡法檢測相關蛋白

注射STZ 17周后用異氟烷麻醉處死C57BL/6小鼠，將其脊髓組織放入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中勻漿。使用BCA蛋白測定法對樣品進行相關蛋白的定量，包括：星形膠質細胞標志物膠質纖維酸性蛋白（GFAP），小型膠質細胞標志物離子鈣結合銜接分子1（IBA1），炎癥因子相關蛋白環(huán)氧合酶-2（COX-2）、IL-1β以及CXCR5等。接著將蛋白質通過10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h后，結合一抗4℃過夜，然后將PVDF膜用TBST洗滌3次，避光結合二抗孵育2 h。通過BeyoECL Plus （中國，Beyotime，P0018）使蛋白條帶成像，并在成像系統(tǒng)上進行光密度分析。

5. ELISA法檢測血清炎癥因子

注射STZ 17周后用異氟烷麻醉C57BL/6小鼠并通過眼眶取血，將血液室溫放置2 h后離心得到血清。使用ELISA試劑盒檢測炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表達情況。

三、統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 5.0分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均以表示，2組間比較使用獨立樣本t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、趨化因子及其受體在C57BL/6小鼠脊髓中的變化情況

注射STZ 15周后，與C57BL/6空白對照組小鼠相比，C57BL/6模型組小鼠脊髓中的趨化因子CCL2、CCL11、CCL8、CCL17、CCL19、CCL24、CXCL1、CXCL4、CXCL5、CXCL11和CXCL13的mRNA水平（相對表達量、t值及P值依次為0.687±0.439，t = 2.673，P = 0.023;0.844±0.203， t = 3.541，P = 0.005; 1.116±0.343， t = 2.472，P = 0.033;0.793±0.338， t = 2.698，P = 0.022;1.027±0.118，t = 5.970，P < 0.001;1.101±0.241，t = 3.341，P = 0.007;0.960±0.284，t = 2.752，P = 0.020;0.973±0.238，t = 3.111，P = 0.013;0.983±0.372，t = 4.244，P = 0.002;0.898±0.643，t = 2.732，P = 0.026;0.699±0.481，t = 2.586，P = 0.027;每組6只）均升高（圖1A）。與C57BL/6空白對照組小鼠相比，C57BL/6模型組小鼠脊髓中的趨化因子受體CXCR2、CXCR3、CXCR5、CCR1和CCR10的mRNA水平（相對表達量、t值及P值依次為0.753±0.483，t = 3.088，P = 0.011;0.936±0.332，t = 2.661，P = 0.031;0.736±0.394，t = 2.792，P = 0.021;1.551±0.655，t = 3.131，P = 0.011;0.959±0.289，t = 2.520，P = 0.036;每組6只）均升高（圖1B）。

二、C57BL/6小鼠體質量、血糖、機械痛敏和熱痛敏變化情況

注射STZ 2周后，與C57BL/6空白對照組小鼠相比，C57BL/6模型組小鼠體質量減少（圖2A）、血糖升高（圖2B）。注射STZ后第4周開始，C57BL/6模型組小鼠出現(xiàn)了DPNP，與C57BL/6空白對照組小鼠相比，前者的機械痛閾值降低（圖2C），注射STZ后第6周開始，前者的熱痛閾值降低（圖2D）。

三、CXCR5-/-小鼠痛覺變化情況

為探討1型糖尿病小鼠痛覺敏感開始發(fā)生顯著變化與趨化因子受體CXCR5的關系，我們也對CXCR5-/-小鼠進行了STZ誘導，與CXCR5-/-空白對照組小鼠相比，CXCR5-/--模型組小鼠注射STZ后第4周機械痛閾值（圖3A）和第6周的熱痛閾值（圖3B）未出現(xiàn)顯著變化;而相較于C57BL/6空白對照組小鼠，C57BL/6模型組小鼠的機械痛和熱痛閾值降低（圖3A、B）。

四、C57BL/6小鼠脊髓蛋白變化情況

與C57BL/6空白對照組小鼠相比，C57BL/6模型組小鼠的脊髓中，星形膠質細胞標志物GFAP（2.581±0.477，t = 4.286，P = 0.013;每組3只）和小型膠質細胞標志物IBA1（1.312±0.214，t = 2.880，P = 0.045;每組3只）被激活，炎癥因子相關蛋白COX-2、IL-1β（3.127±1.074，t = 2.982，P = 0.041;1.958±0.200，t = 3.133，P = 0.035;每組3只）以及趨化因子受體CXCR5（2.798±0.870，t = 3.467，P = 0.026;每組3只） 的蛋白水平均增加，但CXCL13差異不明顯（圖4A、B）。與C57BL/6空白對照組小鼠相比，C57BL/6模型組pERK/ERK和pSTAT3/STAT3（3.068±0.063，t = 4.141，P = 0.014;2.057±0.482，t = 3.439，P = 0.026;每組3只）升高（圖4C、D）。C57BL/6模型組的pERK/ERK和pSTAT3/STAT3與C57BL/6空白對照組比較有差異，而pAKT/AKT（2.013±0.487，t = 2.053，P = 0.109）比較無差異（圖4D）。

五、C57BL/6小鼠血清中炎癥因子變化情況

與C57BL/6空白對照組小鼠相比，C57BL/6模型組小鼠炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β水平（39.01±4.173，t = 4.990，P = 0.001;85.410± 8.626，t = 4.326，P = 0.001;143.200±8.866，t = 5.898，P < 0.001;每組6只）均升高（圖5）。

討論

DPNP是糖尿病患者神經(jīng)病變中最常見的一種形式，通常表現(xiàn)為病變部位灼燒感，難以忍受的刺痛、麻木，甚至喪失感覺[7]。目前仍然缺乏預防或治療DPNP的藥物[8]。探討DPNP的發(fā)病機制并開發(fā)針對發(fā)病機制靶點的藥物具有重要意義[9]。

趨化因子最初被認為是外周免疫細胞運輸?shù)恼{節(jié)劑，并且表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞[3]。STZ是一種亞硝基脲類似物，它通過破壞胰腺分泌胰島B細胞的DNA而對其產生毒性。經(jīng)STZ誘導的糖尿病小鼠能夠表現(xiàn)出DPNP的行為學特征[10-11]。我們使用定量逆轉錄PCR對STZ誘導的糖尿病小鼠脊髓中趨化因子及其受體進行了篩選，結果顯示，相對于C57BL/6空白對照組小鼠，C57BL/6模型組小鼠部分趨化因子和趨化因子受體上調，CXCR5蛋白水平也有顯著變化。

研究顯示，向野生型小鼠和CXCR5-/-小鼠鞘內注射CXCL13，前者會出現(xiàn)熱痛覺過敏，而CXCR5-/-小鼠無此現(xiàn)象，同時CXCL13也誘發(fā)了野生型小鼠強烈的機械痛，但在CXCR5-/-小鼠中的程度有所減輕[12]。與相關的研究類似，我們的研究顯示，C57BL/6模型組小鼠出現(xiàn)了血糖升高、體質量減少，隨后機械痛（4周） 和熱痛（6周）閾值降低。但在經(jīng)STZ誘導相同周數(shù)的CXCR5-/-小鼠中并未出現(xiàn)類似變化[13-14]。這表明，趨化因子CXCL13足以通過其受體CXCR5引起疼痛超敏反應，且在STZ誘導的1型糖尿病DPNP中，CXCL13/CXCR5是產生痛覺過敏的重要分子。

GFAP和IBA1分別是星形膠質細胞和小膠質細胞的標志物[14-15]。本研究蛋白免疫印跡結果表明星形膠質細胞和小膠質細胞標志物在STZ誘導的小鼠脊髓中被激活。在外周神經(jīng)損傷后，pERK和pSTAT3會積聚在脊髓中，它們均可被CXCL13/CXCR5激活并引起db/db小鼠機械性異常性疼痛[16-18]。本研究顯示C57BL/6模型組小鼠脊髓中pERK和pSTAT3均被激活，星形膠質細胞、小膠質細胞標志物蛋白水平增加。盡管本課題組的前期研究顯示pAKT和CXCL13在db/db小鼠的脊髓中蛋白含量顯著上調，但在本研究中pAKT和CXCL13在C57BL/6模型組小鼠脊髓中的變化不明顯，這可能與不同糖尿病模型的作用機制有關[6]。我們還發(fā)現(xiàn)C57BL/6模型組IL-6、TNF-α和IL-1β的水平升高，由此推測是激活的CXCR5、膠質細胞和炎癥因子導致了1型糖尿病引發(fā)的DPNP。

我們的研究表明，CXCL13/CXCR5通過激活脊髓中星型膠質細胞和小膠質細胞刺激pERK和pSTAT3介導的促炎細胞因子的產生，參與了STZ誘導的1型糖尿病引發(fā)的機械痛敏和熱痛敏改變。因此，靶向脊髓中的CXCL13/CXCR5或可成為治療DPNP的新方法。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-08-22）

（本文編輯：洪悅民）