超聲微泡聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植對脊髓損傷大鼠的神經(jīng)保護作用研究

陳宇 張智 汪凡棟 宋昭君 劉元彬 唐龍 廖偉 鄭佳狀△

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是由外創(chuàng)傷引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。大多數(shù)脊髓損傷伴有生理生化異常和結(jié)構(gòu)損傷，會導致神經(jīng)損傷和神經(jīng)再生，從而引起嚴重的運動和感覺通路功能障礙，且這些影響均是不可逆的[2]。SCI創(chuàng)傷后立即引起原發(fā)性損傷，后續(xù)發(fā)展為繼發(fā)性損傷，此時受損神經(jīng)組織發(fā)生一系列的病理過程，包括氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡與自噬等[3-4]，使得神經(jīng)功能出現(xiàn)障礙。通過預防或減輕繼發(fā)性損傷來盡可能地保留受損組織或挽救脊髓中受損細胞是脊髓損傷治療的關(guān)鍵措施。

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)來源于骨髓，具有多向分化的潛能，目前已運用于多種組織修復中。BMSCs分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子可以為神經(jīng)組織和神經(jīng)元提供營養(yǎng)和保護。例如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在軸突生長和神經(jīng)元分化中起重要作用，可以促進BMSCs的神經(jīng)元分化和神經(jīng)組織再生[5]。超聲介導的微泡破壞可增強向腫瘤的藥物輸送，是一種新型、可耐受的靶向治療策略，超聲技術(shù)中探頭的中心頻率通常為1～5 MHz，聲壓范圍為0.1～0.5 MPa，從而引起聲空化。作為氣泡的核心，微泡在超聲場中不斷壓縮、膨脹和塌陷，從而增強了聲音的氣泡效應并產(chǎn)生了一系列機械效應，增加了細胞膜和微血管的滲透性，從而有助于藥物遞送[6-8]。因此，本研究通過構(gòu)建大鼠SCI模型，觀察BMSCs和超聲微泡單獨或聯(lián)合移植對脊髓損傷后神經(jīng)恢復的作用，為BMSCs移植治療脊髓損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 分組與處理

將造模成功的50只大鼠隨機分為5組，包括：假手術(shù)組、模型組、超聲微泡組、BMSCs 組、超聲微泡+BMSCs組。制模后第2天，超聲微泡組和超聲微泡+BMSCs組大鼠經(jīng)尾靜脈注入1 mL濃度約2×108個/mL的超聲微泡溶液，并經(jīng)胸診斷超聲輻照10 min(頻率5 MHz，機械指數(shù)為1.3，輻照5 s)，每次間隔5 s，第4天和第6天重復超聲輻照微泡操作，共3次。同時制模后第2天假手術(shù)組、模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注入1 mL生理鹽水，BMSCs 組和超聲微泡+BMSCs組大鼠經(jīng)尾靜脈注入干細胞懸液(1×107個細胞混懸于2 mL PBS中)于2 min內(nèi)緩慢注入。

1.2 動物模型制作

參照文獻[9]方法構(gòu)建SD大鼠SCI模型。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠俯臥固定于實驗臺上，碘伏消毒后，沿大鼠背部正中逐層皮膚組織，暴露T9～T11椎板，在T10錐板顯露脊髓，做長約2.5 cm 的正中切口，分離椎旁肌肉，將T9～T11的棘突和椎板完全切除暴露脊椎，在實驗臺上安裝固定打擊器，將直徑為2 mm 的10 g打擊錘從5 cm的高度處自由落下撞擊T10脊髓，擊打后迅速移開打擊錘，觀察錐擊瞬間鼠尾痙攣性擺動，雙后肢及軀體出現(xiàn)回縮撲動視為造模成功。大鼠傷口處常規(guī)消毒表面，并逐層縫合皮膚和肌肉，將其放置在37 ℃動物飼養(yǎng)箱內(nèi)直至麻醉完全清醒，每天早晚對大鼠的膀胱進行按摩，以便于排尿，連續(xù)3 d 給予大鼠腹腔注射青霉素預防感染。假手術(shù)組大鼠僅暴露脊柱，不進行錐擊 T10脊髓。

1.3 實驗材料

DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，聲諾維超聲微泡造影劑購于意大利博萊科公司，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑和尼氏染色試劑購自北京康為世紀生物公司，IL-1β，TNF-α，IL-6 ELISA試劑盒購自上海碧云天生物研究所，RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄及實時定量 PCR試劑盒均購于日本TaKaRa 公司，抗體Nestin和GFAP購自美國Santa Cruz 公司，Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG與Alexa Fluor 594標記山羊抗小鼠IgG購自美國 Cell Signaling公司。

1.4 細胞培養(yǎng)與分離

脫臼法處死SD大鼠，在無菌條件下分離取出大鼠的股骨和脛骨，應用DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，尼龍網(wǎng)過濾，緩慢加入等體積的Percoll分離液(1.077 g/mL)，在離心機中以2 000 r/min離心20 min，收集細胞，PBS洗滌后再次離心，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，按1×106/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液，將有粘附于培養(yǎng)底壁的細胞棄掉。之后每3 d更換1次培養(yǎng)液，當細胞基本長滿瓶底壁時，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，滴加0.25%胰蛋白酶消化細胞，并以1∶2比例傳代，待細胞融合度達到80%后，繼續(xù)消化并傳代。

1.5 BBB評分

分別于術(shù)后第1，7，21天對各組大鼠的后肢運動功能進行BBB(Basso Beattie and Bresnahan)評分[10]，分為22個等級。評分均采用雙人雙盲獨立觀察與記錄，對實驗結(jié)果進行平均以減少誤差。

1.6 HE染色

評分結(jié)束后，采用10%水合氯醛麻醉大鼠并處死。其中，5只大鼠脊髓組織標本置于4%多聚甲醛中固定，另外5只大鼠脊髓組織標本在液氮迅速冷凍后，于-80 ℃下保存。將脊髓組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，切成約4 μm 的切片，進行HE染色。將石蠟切片置于55 ℃烤箱烘烤30 min，二甲苯脫蠟，酒精水化，蘇木精染色液染色5 min，伊紅染色液染色1 min，PBS洗滌后以梯度酒精脫水，二甲苯中透明10 min，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察脊髓組織病理損傷程度。

1.7 ELISA 法

取100 mg脊髓組織，加入裂解緩沖液(pH7.4)后研磨勻漿，4 ℃低溫離心機中以1 500 r/min離心15 min，獲取上清液，根據(jù)ELISA試劑盒檢測脊髓組織中IL-1β，TNF-α，IL-6的表達，操作步驟按照試劑盒說明書進行，用酶標儀檢測450 nm處吸光度值，并計算各因子含量。

1.8 尼氏染色

將固定后的脊髓組織進行常規(guī)石蠟包埋，切成30 μm厚的切片，蒸餾水洗滌，梯度酒精脫水，尼氏染色檢測尼氏體形態(tài)變化。將切片浸入0.1%甲苯酚紫溶液染色5 min，蒸餾水洗滌，使用乙醇脫水分化，二甲苯中透明5 min，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體形態(tài)學變化。

1.9 免疫熒光染色

將骨髓組織石蠟切片置于室溫下干燥2 h，PBS洗滌后，滴加0.3% TritonX-100 于37 ℃下孵育15 min，PBS洗滌后，加入5%山羊血清封閉1 h，之后加入稀釋后的一抗抗體Nestin(1∶500)和GFAP(1∶500)，4 ℃ 孵育過夜，次日PBS洗滌，加入相應的稀釋的熒光二抗(1∶250)，37 ℃ 孵育2 h，PBS再次洗滌，加入DAPI染色10 min，中性樹膠封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照，使用ImageJ2x軟件對熒光圖片進行測定分析，記錄染色陽性區(qū)域面積占總面積的百分比。

1.10 實時熒光定量PCR

將保存于-80 ℃冰箱的脊髓組織取出并剪碎，用RNA 提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行操作將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過實時熒光定量PCR試劑盒進行qRT-PCR實驗，以 GAPDH 作為內(nèi)參，檢測BDNF，NT3，Caspase-3，Bax，Bcl-2 mRNA 的表達情況，PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性20 s，60 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 45 s，循環(huán) 40 次，實驗重復 3 次。結(jié)果采用2ΔΔCt法計算各基因的表達水平。采用Primer Premier5軟件設(shè)計基因引物序列(見表1)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點BBB評分比較

對各組大鼠進行BBB評分的檢測結(jié)果顯示：在術(shù)后第1，7，21天，模型組、超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組大鼠BBB評分均顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術(shù)后第1天超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組大鼠BBB評分與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05 )；術(shù)后第7天和第21天，超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組大鼠BBB評分與模型組比較顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且超聲微泡+BMSCs組大鼠BBB評分顯著高于超聲微泡組和BMSCs組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠術(shù)后第1，7，21天BBB運動功能評分比較

2.2 各組大鼠檢測脊髓組織形態(tài)學變化

HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥細胞浸潤現(xiàn)象；模型組脊髓組織結(jié)構(gòu)明顯損傷，出現(xiàn)脊髓充血、水腫等現(xiàn)象，脊髓空洞較大，炎癥細胞浸潤增多；超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織病理損傷較模型組明顯得到改善，炎癥細胞浸潤得到抑制，見圖1。

圖1 HE染色檢測大鼠脊髓組織形態(tài)學變化(×100)

2.3 各組大鼠脊髓組織中炎性因子表達比較

ELISA檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組、超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織中IL-1β，TNF-α及IL-6含量均顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組中IL-1β，TNF-α及IL-6含量均顯著減少(P<0.05)，且超聲微泡+BMSCs組中IL-1β，TNF-α及IL-6含量較超聲微泡組和BMSCs組顯著減少(P<0.05)，見表 3。

表3 各組大鼠脊髓組織中IL-1β，TNF-α及IL-6含量比較

2.4 各組大鼠脊髓組織中尼氏小體形態(tài)觀察比較

尼氏染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組脊髓組織中尼氏小體形態(tài)清晰，模型組尼氏小體出現(xiàn)模糊不清、變小甚至消失的現(xiàn)象；超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織中尼氏小體形態(tài)有所恢復，融合現(xiàn)象減少，且超聲微泡+BMSCs組比超聲微泡組和BMSCs組尼氏小體融合更少，形態(tài)恢復更為明顯，見圖2。

圖2 尼氏染色檢測大鼠脊髓組織尼氏小體形態(tài)變化(×100)

2.5 各組大鼠脊髓組織中Nestin和GFAP表達比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組脊髓組織Nestin和GFAP標記的熒光表達強度較高，而模型組中少有Nestin和GFAP標記的熒光表達；超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織中Nestin和GFAP標記的熒光表達較模型組增加，且超聲微泡+BMSCs組比超聲微泡組和BMSCs組的表達增加更多，見圖3。

圖3 免疫熒光染色檢測大鼠脊髓組織Nestin和GFAP表達(×200)

2.6 各組大鼠脊髓組織中BDNF，NT3，Caspase-3，Bax及Bcl-2 的mRNA表達比較

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組、超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織中BDNF，NT3及Bcl-2 mRNA相對表達量均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Bax及Caspase-3 mRNA相對表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組中BDNF，NT3及Bcl-2 mRNA相對表達量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Bax及Caspase-3 mRNA相對表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同時，與超聲微泡組和BMSCs組比較，超聲微泡+BMSCs組中BDNF，NT3及Bcl-2 mRNA相對表達量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而Bax及Caspase-3 mRNA相對表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠脊髓組織BDNF，NT3，Caspase-3，Bax及Bcl-2 mRNA相對表達量

3 討論

在脊髓損傷中由于原發(fā)性損傷已經(jīng)發(fā)生，因此大多數(shù)療法的目標是防止因繼發(fā)性損傷機制而造成的損害，這種損害在初次傷害后的數(shù)小時至數(shù)周內(nèi)發(fā)生，機制主要包括血管功能障礙、水腫、局部缺血、炎癥、電解質(zhì)轉(zhuǎn)移、自由基產(chǎn)生和細胞凋亡[3-4]。減輕繼發(fā)性損傷脊髓中受損的細胞是脊髓損傷治療的一項措施。為了實現(xiàn)這一措施，有效的策略是改善病變部位的微環(huán)境，從而進一步抑制神經(jīng)元的損失。

近年來，隨著對SCI發(fā)病機制的進一步研究，BMSCs移植已成為SCI治療領(lǐng)域的一項突破。盡管研究表明，BMSCs可以減輕損傷和促進軸突再生，但依靠干細胞在損傷區(qū)的歸巢能力來治療的療效一般。已有研究表明，通過將目的基因與超聲微泡結(jié)合后導入機體內(nèi)，超聲輻照后生的空化效應，可以使目的基因更容易進入細胞，實現(xiàn)靶向治療的目的[11]。超聲微泡可以使組織血管壁或其他屏障產(chǎn)生微孔，來促進血液和組織進行物質(zhì)交換，使得藥物更容易穿過血脊髓屏障[12]。此外，超聲微泡聯(lián)合干細胞移植在心肌梗死中可以促進VEGF來刺激血管新生，并改善心肌微環(huán)境[13]。本研究結(jié)果顯示，在術(shù)后第7天和第21天，超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組大鼠BBB評分較模型組均明顯增加，且超聲微泡+BMSCs組BBB評分要高于超聲微泡組和BMSCs組，同時脊髓組織病理現(xiàn)象較模型組明顯得到改善，尼氏小體形態(tài)有所恢復。因此，推測超聲微泡聯(lián)合BMSCs對大鼠脊髓損傷具有明顯的改善作用。

脊髓受到損傷后外源性和內(nèi)源性有害物質(zhì)會通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而導致一系列的并發(fā)癥，嚴重危害脊髓損傷的恢復。脊髓損傷中繼發(fā)性損傷伴隨著多種病理生理機制，其中炎癥反應能夠大大促進脊髓損傷的發(fā)展[14]。Paterniti等[15]研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后幾小時內(nèi)，促炎性細胞因子TNF-α，IL-1β和iNOS的水平明顯升高；Okada[16]揭示脊髓損傷繼發(fā)性損傷的級聯(lián)引起病變部位的炎癥反應不斷擴大并擴散到周圍組織，導致細胞死亡，同時抑制了組織再生與功能恢復。本研究結(jié)果顯示：模型組脊髓組織中IL-1β，TNF-α及IL-6含量均增加，超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組中IL-1β，TNF-α及IL-6含量均減少，且超聲微泡+BMSCs組中IL-1β，TNF-α及IL-6含量較超聲微泡組和BMSCs組減少更為明顯。由此表明超聲微泡聯(lián)合BMSCs能夠抑制脊髓損傷大鼠脊髓組織內(nèi)炎癥反應。

引起運動和感覺神經(jīng)元繼發(fā)性死亡最多的神經(jīng)損傷之一是細胞凋亡，脊髓損傷后神經(jīng)微環(huán)境失衡，細胞凋亡增加，神經(jīng)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用，并參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展，神經(jīng)細胞的死亡能夠加劇神經(jīng)退行性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織中Nestin和GFAP標記的熒光表達較模型組增加，且超聲微泡+BMSCs組比超聲微泡組和BMSCs組的表達增加更多。Nestin是神經(jīng)干細胞的標志性蛋白，GFAP通常被用于鑒定分化的星形膠質(zhì)細胞。此外，本研究結(jié)果還顯示：超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組中BDNF，NT3及Bcl-2 mRNA相對表達量較模型組明顯升高，Bax及Caspase-3 mRNA相對表達量下降，且超聲微泡+BMSCs組中這些基因表達升高或下降程度較超聲微泡組和BMSCs組更為明顯。BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達的神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有促進神經(jīng)元分化、增殖和成熟的作用，也是突觸可塑性和記憶形成的主要驅(qū)動力[5，17]。NT3是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一個活性營養(yǎng)因子，可以特異性作用于急性受損的脊髓組織，以維持神經(jīng)元存活，促進增殖和分化，誘導神經(jīng)軸突生長并促進神經(jīng)損傷的修復[18]。Bcl-2具有抑制凋亡的功能，可通過影響線粒體膜的通透性來調(diào)控細胞凋亡，而Bax可以與Bcl-2結(jié)合形成異二聚體，從而促進細胞凋亡。在線粒體凋亡途徑中，釋放到胞漿中的Cyt-c能夠與凋亡誘導因子相互作用激活Caspase，其中Caspase-3是多種細胞凋亡途徑中的關(guān)鍵因子之一[19]。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)超聲微泡聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠脊髓損傷發(fā)揮著神經(jīng)保護作用，這對超聲微泡聯(lián)合BMSCs臨床治療脊髓損傷提供了實驗依據(jù)，并對全面研究脊髓損傷的修復機制具有重要意義。

致謝 感謝川北醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院劉天橋老師在動物實驗中給予的指導和幫助。