基于鏈替代信號放大靈敏檢測端粒酶活性的電化學(xué)方法

馬艷蓉，江勝男，金 燕

（1.北方民族大學(xué)預(yù)科教育學(xué)院,銀川750021；2.陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,陜西省生命分析重點實驗室,西安710062）

端粒酶（Telomerase）能夠以其RNA作為模板，在染色體末端合成端粒重復(fù)序列（TTAGGG）n，從而維持端粒的長度穩(wěn)定，使細胞永生化.研究表明，端粒酶在85%以上的人類腫瘤細胞中高表達，而在正常體細胞中的表達量則極低甚至不表達.因此，端粒酶是一種廣譜性的腫瘤標志物［1～8］，靈敏可靠檢測其活性對于腫瘤的早期診斷和抗癌藥物的研發(fā)具有重要意義.基于聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）的端粒重復(fù)序列擴增法（TRAP）是檢測端粒酶活性的經(jīng)典方法，但其操作過程復(fù)雜、費時，會因為PCR過程帶來假陽性結(jié)果，而且無法區(qū)分細胞內(nèi)端粒酶活性的差異.為了實現(xiàn)端粒酶活性的靈敏、便捷檢測，熒光法［9～12］、比色法［13，14］、化學(xué)發(fā)光法［15，16］及電化學(xué)法等方法不斷涌現(xiàn).由于具有設(shè)備簡單、低廉、檢測快速及響應(yīng)靈敏等優(yōu)點，電化學(xué)法已經(jīng)成為生物分析的重要手段之一［17，18］.Shao等［19］提出了一種基于端粒重復(fù)序列中鳥嘌呤電化學(xué)響應(yīng)檢測端粒酶活性的電化學(xué)方法.Wang等［20］基于DNA磷酸基團與鉬酸鹽反應(yīng)合成了一種具有電化學(xué)活性的磷鉬酸鹽來檢測端粒酶活性.Liu等［21］建立了一種基于T7核酸外切酶輔助循環(huán)反應(yīng)用于檢測癌細胞中端粒酶活性的電化學(xué)方法.Liu等［22］利用端粒酶延長產(chǎn)物形成的G-四鏈體DNAzyme催化苯胺，以合成具有電化學(xué)活性的聚苯胺來檢測端粒酶活性.Lei等［23］以亞甲基藍和對苯二酚為信號分子，構(gòu)建了比率型電化學(xué)法用于檢測端粒酶活性.Yang等［24］建立了一種基于金納米棒（AuNRs）富集引起電化學(xué)響應(yīng)檢測端粒酶活性的方法.本文以標記二茂鐵的T-DNA分子為信號探針，發(fā)夾型DNA探針（H-DNA）為捕獲探針，基于端粒酶延長端粒DNA引物鏈來引發(fā)鏈替代反應(yīng)，構(gòu)建了一種簡捷、靈敏檢測端粒酶活性的電化學(xué)新方法.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度＞99.9%）購于Solarbio公司；無水氯化鎂購于天津市光復(fù)精細化工研究所；高氯酸鉀（純度≥98%）購于成都市科龍化工試劑廠；鹽酸購于上海活凱生物技術(shù)有限公司；實驗用水為美國Pall Corporation實驗室超純水（18.2 MΩ·cm）；DEPC水和上樣緩沖液購于生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內(nèi)切酶NtBbvCI購于New England Biolabs公司（美國）；dNTPs、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰、β-巰基乙醇、EGTA和Tween 20均購自Sigma公司（美國）；Taq DNA Ploymerase產(chǎn)自寶生物公司（日本）；所用DNA均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，序列如表1所示.

Table 1 Sequences of DNA probes

CHI440A型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司），采用三電極系統(tǒng)：金電極作為工作電極（面積為3.14 mm2），飽和Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極；超微量分光光度計（美國DeNovix公司）；5424R型小型離心機（德國Eppendorf公司）；PowerPac Basic型電泳儀（美國伯樂BIO-RAD公司）；LS型超純水機（美國PALL公司）；pH酸度計（梅特勒儀器有限公司）.

1.2 實驗過程

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將宮頸癌（HeLa）細胞培養(yǎng)于含10%（體積分數(shù)）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中（含有100 U/mL青霉素、0.01 mg/mL鏈霉素和10%胎牛血清），傳代后在37℃，95%（體積分數(shù)）空氣和5% CO2條件下培養(yǎng)，直至貼壁細胞的豐度大于60%.

1.2.2 端粒酶提取 待細胞生長到對數(shù)生長期時，用胰蛋白酶消化細胞2 min，使貼壁的細胞從壁上脫落下來，收集1.0×106個HeLa細胞至1.5 mL的無菌離心管中.于800 r/min轉(zhuǎn)速及4℃條件下離心4 min，并用冷的PBS緩沖液洗滌2次，棄掉上層清液.加入200μL CHAPS裂解液［包含10 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5），1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，0.1 mmol/L PMSF，5 mmol/Lβ-巰基乙醇，8.13 mmol/L CHAPS和1.41 mol/L甘油），在冰浴上孵育30 min；在12000 r/min轉(zhuǎn)速及4℃條件下離心20 min；取上層清液至無菌離心管中，儲存在-80℃冰箱中.

1.2.3 TRAP法驗證端粒酶活性 將1μL端粒酶裂解液（200 cells）加入含有200 nmol/L TS和0.2 mmol/L dNTPs的TRAP緩沖溶液中，終體積為20μL，將管口用封口膜包裹，于30℃水浴1.5 h.然后依次加入TS，ACX，dNTPs和Taq DNA聚合酶，放入PCR擴增儀中進行擴增.取10μL PCR擴增產(chǎn)物加入上樣緩沖液中，混合均勻后取2μL加至濃度為12.5%的聚丙烯酰胺凝膠泳道上；依次加入固定液、銀染液及甲醛液進行銀染，在凝膠成像儀上進行拍照、分析.

1.2.4 鏈替代反應(yīng) 將1μL端粒酶裂解液加入含有200 nmol/L TS和0.2 mmol/L dNTPs的TRAP延長緩沖溶液中，終體積為20μL.將混合物于37℃孵育3 h.將被端粒酶延長后產(chǎn)物與10μL 0.5μmol/L AT-DNA在37℃水浴下反應(yīng)1 h，使延長產(chǎn)物與AT-DNA中的A-DNA結(jié)合，從而替換出帶有二茂鐵基團的T-DNA.

1.2.5 T-DNA與H-DNA的雜交反應(yīng) 依次用1.0，0.3和0.05μm的α-Al2O3將金電極拋光后，分別用超純水和75%乙醇超聲5 min，置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在-0.3～1.5 V范圍內(nèi)以100 mV/s的速度進行循環(huán)伏安（CV）掃描，直至得到穩(wěn)定的CV曲線，然后用超純水沖洗電極表面.將20μL 1.0μmol/L巰基標記H-DNA滴加在干凈的金電極表面，置于4℃冰箱中密封放置12 h，然后用1 mmol/L MCH在室溫下反應(yīng)3 h以封閉裸露的金電極表面，并用超純水沖洗電極表面.取10μL鏈替代反應(yīng)產(chǎn)物滴于電極表面，常溫下放置90 min充分反應(yīng)后沖洗干凈.最后，將此電極置于0.1 mol/L KClO4溶液中，進行微分脈沖伏安（DPV）測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

基于鏈替代反應(yīng)構(gòu)建了一種檢測端粒酶活性的電化學(xué)方法，原理如Scheme 1所示.以5′端標記二茂鐵基團的DNA（T-DNA）為信號探針，輔助DNA（A-DNA）與T-DNA部分互補雜交形成雙鏈AT-DNA；當存在端粒酶時，端粒酶在TS的3′末端合成TTAGGG的重復(fù)序列，形成一條長的DNA單鏈；這條延長單鏈DNA含有多個TTAGGG的重復(fù)序列，能夠與多條A-DNA雜交，釋放出多條T-DNA鏈；T-DNA可與固定在金電極表面的H-DNA雜交，打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使得二茂鐵基團靠近電極表面，從而產(chǎn)生電化學(xué)信號.基于電流的變化，該方法可簡單、快捷地檢測端粒酶活性.

Scheme 1 Schematic diagram of the electrochemical detection of telomerase activity

2.2 凝膠電泳分析

凝膠電泳常用來表征核酸和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的變化.因此，利用凝膠電泳對HeLa細胞中提取的端粒酶活性進行了驗證.圖1（A）中泳道1～4分別為細胞裂解液、熱失活端粒酶、HeLa細胞中提取的端粒酶及正常細胞中的提取物與TS，dNTP反應(yīng)并經(jīng)PCR擴增后的產(chǎn)物.可以看出，在其它條件一致時，泳道1，2和4沒有出現(xiàn)TS延長擴增產(chǎn)物條帶，只有泳道3出現(xiàn)TS延長擴增后的DNA條帶，表明從HeLa細胞中提取的端粒酶是有活性的，可以延長TS.

Fig.1 Verification of telomerase activity(A)and strand displacement reaction(B)by polyacrylamide gel electrophoresis

鏈替代反應(yīng)的效率和特異性直接影響電化學(xué)測定端粒酶活性的性能.因此，采用凝膠電泳成像驗證了鏈替代反應(yīng)的效率和特異性.圖1（B）中泳道1～3分別為T-DNA，H-DNA和A-DNA，泳道4為A-DNA與T-DNA于37℃反應(yīng)30 min后的產(chǎn)物.可見，當A-DNA與T-DNA混合后，二者對應(yīng)的DNA條帶顏色變淺，并在其上方出現(xiàn)了一條分子量更大的新條帶，說明A-DNA與T-DNA發(fā)生了雜交反應(yīng)（泳道4）.由泳道5可以看出，當H-DNA與T-DNA在37℃反應(yīng)30 min后，在H-DNA位置的上方出現(xiàn)新的條帶，說明T-DNA可以打開發(fā)夾H-DNA而發(fā)生雜交反應(yīng).泳道6為H-DNA與A-DNA的混合物，沒有新的DNA條帶產(chǎn)生，表明A-DNA不能與H-DNA發(fā)生雜交反應(yīng).電泳結(jié)果表明，DNA探針設(shè)計合理，鏈替代反應(yīng)可如Scheme 1所示特異性發(fā)生.T-DNA能夠與H-DNA發(fā)生雜交反應(yīng)，致使二茂鐵分子靠近電極表面，從而產(chǎn)生電化學(xué)信號.此外，利用IDT在線Oligo分析工具Oligo Analyzer計算了DNA探針發(fā)生雜交反應(yīng)的吉布斯自由能（ΔG）.結(jié)果表明，A-DNA與T-DNA反應(yīng)的ΔG1=-129.47 kJ/mmol，A-DNA與端粒酶延長產(chǎn)物（CST）反應(yīng)的ΔG2=-153.91 kJ/mmol，H-DNA與T-DNA反應(yīng)的ΔG3=-170.41 kJ/mmol.ΔG值均小于0，表明反應(yīng)可以自發(fā)進行，ΔG2＜ΔG1，說明端粒酶延長產(chǎn)物可以替代出AT-DNA復(fù)合物中的T-DNA.

2.3 電化學(xué)檢測端粒酶活性的原理驗證

由Scheme 1可知，本工作是基于端粒酶特異性延長TS來引發(fā)鏈替代反應(yīng)，從而將電化學(xué)信號探針富集到H-DNA修飾金電極表面.分別將CHAPS裂解液、失活端粒酶、正常細胞提取液及端粒酶依次與TS，ATDNA和H-DNA修飾電極反應(yīng)后，測定金修飾電極的微分脈沖伏安（DPV）響應(yīng)，結(jié)果［圖2（A）］表明，只有在端粒酶存在時才檢測到明顯的DPV峰電流.這是由于CHAPS裂解液、失活端粒酶和正常細胞提取液均不能使引物TS延長，因而不能發(fā)生鏈替代反應(yīng)置換出T-DNA，H-DNA不能與T-DNA雜交，因此就檢測不到二茂鐵的DPV電流.圖2（A）結(jié)果表明，該電化學(xué)方法可以特異性地檢測端粒酶活性.為了進一步驗證原理，測定了金電極在5 mmol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］溶液中的循環(huán)伏安（CV）曲線，結(jié)果如圖2（B）所示.圖2（B）中曲線a為裸金電極的CV曲線，曲線b為MCH/H-DNA/Au修飾電極的CV曲線.比較曲線a和b可以看出，修飾電極氧化還原峰電流明顯降低，峰電位間距增大.這是由于DNA修飾和MCH封閉阻礙了K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］在電極表面的氧化還原反應(yīng)，說明H-DNA和MCH固定在了金電極表面.CV曲線c和d分別表示熱失活端粒酶和端粒酶與TS、ATDNA和H-DNA修飾電極反應(yīng)后的CV曲線.CV曲線c與b基本重合，說明失活端粒酶無法延長TS來置換出T-DNA.因此，MCH/H-DNA/Au修飾電極表面基本沒有變化.而當端粒酶存在時，經(jīng)過鏈替代反應(yīng)后，曲線d的峰電流增大，且氧化還原峰間距減小.這是由于端粒酶延長TS將T-DNA置換出來，T-DNA打開H-DNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，形成剛性的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，DNA間隙增大，使得K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］易于靠近電極表面發(fā)生循環(huán)伏安反應(yīng).這進一步驗證了端粒酶延長TS所引發(fā)的鏈替代和雜交發(fā)應(yīng)對電化學(xué)信號產(chǎn)生直接影響，表明用此方法檢測端粒酶活性是可行且可靠的.

Fig.2 Proof-of-principle by DPV and CV

2.4 電化學(xué)交流阻抗表征

在5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6溶液中，利用電化學(xué)交流阻抗法表征了電極的不同狀態(tài)，結(jié)果如圖3所示.圖3譜線a為裸金電極的阻抗譜圖，該譜圖僅出現(xiàn)一個較小半圓，表明此時電極上幾乎不存在阻擋電子轉(zhuǎn)移的物質(zhì)，［Fe（CN）6］4-/3-非常容易到達電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)；譜線b和c分別為H-DNA/Au電極和MCH/H-DNA/Au電極的阻抗譜圖，其高頻部分出現(xiàn)明顯的半圓，且半圓的直徑隨組裝層數(shù)增加而依次增大［25］，表明H-DNA和MCH在電極表面的自組裝阻礙了電子傳遞，而且隨著組裝層數(shù)的增加逐漸增強，［Fe（CN）6］4-/3-越來越難以到達電極表面；而當MCH/H-DNA/Au電極與T-DNA反應(yīng)后，由譜線d可見半圓部分直徑減小，表明T-DNA能特異性地打開H-DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，形成剛性較強的雙鏈DNA，有更大的空隙利于［Fe（CN）6］4-/3-到達電極表面，阻抗值減小.交流阻抗測試結(jié)果與循環(huán)伏安測試結(jié)果一致，驗證了H-DNA和MCH在金電極的自組裝及T-DNA與H-DNA的雜交反應(yīng).

Fig.3 Electrochemical impedance spectroscopy of Au electrode under different conditions in 0.1 mol/L KCl aqueous solution containing 5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6

2.5 實驗條件優(yōu)化

2.5.1 H-DNA濃度的優(yōu)化 考察了H-DNA濃度對電化學(xué)信號的影響，測得的DPV峰電流隨H-DNA濃度變化情況如圖4（A）所示.可以看出，在0.1～1μmol/L之間時，隨著H-DNA濃度的增加，DPV峰電流逐漸增大；當H-DNA濃度增大到1μmol/L時，峰電流達到最大值；而繼續(xù)增大H-DNA濃度，峰電流降低.H-DNA作為捕獲探針，可與T-DNA雜交，致使二茂鐵分子靠近金修飾電極表面，從而檢測到二茂鐵的DPV峰電流.H-DNA濃度越大，可捕獲的T-DNA越多，峰電流就越高.然而，當H-DNA濃度高于1μmol/L時，H-DNA在金電極表面過于密集，空間位阻會影響H-DNA與T-DNA的雜交效率，導(dǎo)致峰電流反而降低.因此，H-DNA的最佳濃度為1μmol/L.

Fig.4 Effect of H-DNA concentration(A)and T-DNA concentration(B)on the peak current

2.5.2 T-DNA濃度的優(yōu)化 T-DNA作為探針分子，其濃度直接影響檢測結(jié)果.T-DNA濃度的優(yōu)化結(jié)果如圖4（B）所示.T-DNA濃度在0.1～1μmol/L范圍內(nèi)，DPV峰電流隨其增加而逐漸增大.這是由于隨著T-DNA濃度增大，通過與H-DNA雜交而捕獲到電極表面的二茂鐵分子增多，電流值就增大.當T-DNA濃度大于1μmol/L時，峰電流基本保持不變.因此T-DNA的最佳濃度為1μmol/L.

2.5.3 鏈替代反應(yīng)時間的優(yōu)化 端粒酶延長產(chǎn)物與AT-DNA發(fā)生鏈替代反應(yīng)的時間對于鏈替代反應(yīng)效率至關(guān)重要.實驗中分別選擇鏈替代反應(yīng)時間為15，30，60，90和120 min進行了優(yōu)化，結(jié)果如圖5（A）所示.隨著反應(yīng)時間延長，鏈替代反應(yīng)的效率增大，峰電流增加.反應(yīng)60 min鐘時峰電流達到最大，再延長反應(yīng)時間，峰電流無明顯變化.因此，最佳鏈替代反應(yīng)時間為60 min.

Fig.5 Effects of SDR reaction time(A)and hybridization time(B)on the DPV peak current

2.5.4 雜交反應(yīng)時間的優(yōu)化 電極表面H-DNA與T-DNA雜交反應(yīng)時間會影響檢測性能.因此，考察了H-DNA與T-DNA雜交反應(yīng)30，60，90，120和150 min后的電化學(xué)信號，結(jié)果如圖5（B）所示.隨著雜交反應(yīng)時間延長，雜交反應(yīng)的效率增大，峰電流增加.反應(yīng)90 min時峰電流達到最大.因此，雜交反應(yīng)的最佳時間為90 min.

2.6 端粒酶活性檢測

在最佳實驗條件下，測定了0.1 mol/L pH=7.0的KClO4溶液中不同濃度的端粒酶對應(yīng)的DPV峰電流值.結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著細胞個數(shù)的增加，峰電流逐漸增強，線性關(guān)系如圖6所示.可以看出，HeLa細胞數(shù)目在5～100個之間時，峰電流值與細胞個數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低可實現(xiàn)對5個HeLa細胞中端粒酶活性的檢測.

Fig.6 DPV peak current plotted against the number of HeLa cells

3 結(jié) 論

利用二茂鐵分子作為電化學(xué)探針，基于端粒酶特異性延長TS引發(fā)的鏈替代反應(yīng)，建立了靈敏檢測端粒酶活性的電化學(xué)方法，最低可檢測5個HeLa細胞中端粒酶的活性.該方法是一種高選擇性、低成本、靈敏檢測端粒酶活性的電化學(xué)新方法.