精氨酸功能化磁性納米材料的制備及在磷酸化肽富集中的應用

鄭海嬌，姜麗艷，賈 瓊

（1.吉林大學化學學院,2.生命科學學院,長春130012）

蛋白質不同的翻譯后修飾（PTM）在生命活動調節(jié)中發(fā)揮著不同作用，據統(tǒng)計迄今已發(fā)現超過300種的蛋白質PTM.作為最常見和重要的蛋白質PTM之一，可逆磷酸化修飾一直是研究的熱點和重點［1～3］.目前，對磷酸化蛋白或磷酸化肽的鑒定主要依靠生物質譜技術［4，5］.質譜技術雖然發(fā)展迅速，但在蛋白質磷酸化的鑒定方面仍面臨難題，主要是由于生物體內磷酸化蛋白的表達量很低.樣品在未經過前處理的前提下很難消除基質的干擾，實現對低豐度的磷酸化蛋白準確而可靠的質譜（MS）直接檢測.因此，發(fā)展對磷酸化蛋白或磷酸化肽具有較強捕獲能力的富集材料是磷酸化修飾準確鑒定的基礎需求.磁性固相萃?。∕SPE）是一種常見的前處理技術，被廣泛應用于生物分離領域［6，7］.MSPE技術通常選用Fe3O4微球作為載體，在外加磁場的作用下實現溶劑與材料的分離.另外，可以在Fe3O4微球表面修飾特定的功能性基團或物質，以提高材料對目標分析物的捕獲能力.目前，已有多種基于不同磷酸化肽富集機理的功能化磁性材料被合成并用于富集樣品中目標肽段［8～10］.但是，很多材料仍然不能很好地避免非目標肽段的干擾.因此，發(fā)展新型的對磷酸化肽具有高捕獲能力、高選擇性和高靈敏度的適用于MSPE技術平臺的功能化磁性載體材料十分必要.

精氨酸殘鏈中的胍基在含磷酸酯的酶和非催化性蛋白質的活性位中起到重要作用［11，12］.精氨酸（Arg）分子中的胍基與磷酸基之間存在一種類似共價鍵的靜電相互作用，可形成“高能磷酸鍵”N—P鍵，并且精氨酸邊鏈上的胍基與磷酸基更容易產生穩(wěn)定的相互作用，形成更強的鹽橋連接.此外，胍基和磷酸基之間還存在穩(wěn)定的氫鍵相互作用，處于平面結構的胍基可與磷酸根的每個氧原子分別成鍵，胍基獨具的兩性強氫鍵結構也是專一選擇性的保證［13，14］.本文利用水熱法合成Fe3O4微球，以硅酸四乙酯（TEOS）對其進行包覆后，再以3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）對硅烷化的磁性微球進行第一步后修飾，使磁性微球表面帶有氨基；然后通過簡單的交聯反應將Arg包覆到氨基化的磁性微球上，得到Arg功能化的磁性材料（簡稱Mag-Arg）.實驗涉及的有機合成步驟簡單且產率高，合成材料具有成本低、易制備、耗時短等優(yōu)點.并以標準磷酸化蛋白酶解產物作為研究模型建立MSPE-MS平臺，考察了Mag-Arg材料對目標分析物的富集能力和方法的應用性.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SU8020型冷場場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；Zetasizer Nano ZS ZEN3600型納米粒度儀和Zeta電位分析儀（英國Malvern公司）；SQUID-VSM型磁學性能測試系統(tǒng)（美國Quantum Design公司）；Nicolet is5型傅里葉變換紅外光譜儀（德國Bruker公司）；X射線衍射儀（荷蘭PANalytical B.V.公司）；AB Sciex 5800型飛行時間質譜儀（美國AB SCIEX公司）；Milli-Q型超純水儀（美國Millipore公司）.

三氟乙酸（TFA，98%）、硅酸四乙酯（TEOS，99%）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，99%）、碳酸氫銨（NH4HCO3，99%）、乙腈（ACN，98%）、2，5-二羥基苯甲酸（DHB，98%）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，97%）、1-羥基苯并三唑（HOBT，97%）、β-酪蛋白（β-casein，≥98%）、胰蛋白酶（Trypsin）、卵清白蛋白（OVA，≥98%）、牛血清蛋白（BSA，≥98%）、精氨酸（Arg，≥95%）、二硫蘇糖醇（DTT，99%）、碘乙酰胺（IAA，99%）、N，N-二異丙基乙胺（DIPEA，99%）和甲酸（99%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯化鐵（FeCl3·6H2O，98%）、乙二醇（EG，99%）、醋酸鈉（NaAc，99%）、氨水（NH3·H2O，25%）、磷酸（H3PO4，85%）、醋酸（HAc，96%）、尿素（99%）、乙醇（≥98%）和甲醇（≥98%）購于北京化學試劑公司.實驗用水均為Milli-Q超純水儀制備的高純水.

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的前處理 標準樣品的處理：稱取1 mgβ-casein或OVA凍干粉標準品溶解于1 mL NH4HCO3緩沖溶液（50 mmol/L）中，在100℃金屬浴中加熱10 min使蛋白質發(fā)生熱變性.隨后冷卻至室溫，加入1 mg/mL的Trypsin［m（β-casein）∶m（Trypsin）=50∶1］，在37℃水浴中酶解16～18 h.待樣品溶液冷卻至室溫后，加入2μL甲酸終止酶解反應.稱取1 mg BSA凍干粉標準品溶解于含有8 mol/L尿素的1 mL NH4HCO3緩沖溶液（50 mmol/L）中，混合均勻后在室溫下靜置1 h.加入100μL DTT（1 mol/L），在60℃下加熱1 h，冷卻至室溫，隨后加入37 mg IAA，室溫下避光反應45 min.經還原及烷基化處理后的蛋白質用NH4HCO3緩沖溶液（50 mmol/L）稀釋，直至其中尿素濃度小于1 mol/L后，加入1 mg/mL Trypsin［m（BSA）∶m（Trypsin）=50∶1］，在37℃水浴中酶解16～18 h，加入甲酸終止反應.將制備的酶解液保存于-20℃冰箱中備用［15，16］.

實際樣品的處理：在1 mL脫脂牛奶中加入5倍量的NH4HCO3緩沖溶液（25 mmol/L），在3500g的離心力下離心20 min，取上層清液，在100℃金屬浴中保持10 min后，冷卻至室溫.加入1 mg/mL Trypsin［m（底物）∶m（Trypsin）=50∶1］，在37℃水浴中酶解16～18 h，加入甲酸終止反應.用NH4HCO3緩沖溶液（25 mmol/L）稀釋，以備后續(xù)分析［17］.

1.2.2 Mag-Arg材料的合成 稱取1.35 g FeCl3·6H2O溶于75 mL EG中，攪拌均勻后加入3.60 g NaAc，繼續(xù)攪拌至產生黃色黏稠溶液.將混合液移至高壓水熱反應釜中，在200℃下加熱16 h.產物依次用乙醇和純水分別沖洗3次，經磁吸分離得到Fe3O4微球［18］.稱取350 mg Fe3O4微球均勻分散于含220 mL乙醇、55 mL水和1.4 mL NH3·H2O（質量分數25%）的混合溶劑中，向混合液中加入1 mL TEOS，室溫下攪拌12 h，經磁吸分離得到硅烷化的磁性微球（簡稱Mag-TEOS）.取100 mg Mag-TEOS分散到30 mL乙醇中，加入1.3 mL APTES，室溫下攪拌1 h，經磁吸分離得到氨基化的磁性微球（簡稱Mag-APTES）［19，20］.稱取100 mg Arg，345 mg EDC和243 mg HOBT，依次加入到10 mL DMF和400μL DIPEA混合溶液中，混合均勻后加入Mag-APTES，室溫下攪拌24 h.依次用DMF和高純水清洗產物，經磁吸分離得到終產物—Arg修飾的磁性微球（簡稱Mag-Arg）.

1.2.3 MSPE富集磷酸化肽 稱取5 mg Mag-Arg，用1 mL水和1 mL溶劑A（50% ACN+0.1 mol/L HAc）分別洗滌3次，再將其分散在1 mL溶劑A中備用.實驗采用典型的MSPE前處理步驟，依次為上樣、清洗和解吸.首先，取20μL上述樣品儲備液加入到100μL樣品溶液中（所需的不同濃度的樣品均用溶劑A進行稀釋），在室溫下振蕩45 min后，經磁吸分離樣品與材料.除去溶劑后，每次用100μL溶劑A對樣品反復洗滌3次，以去除非磷酸化肽段.最后，向清洗過的樣品中加入30μL溶劑B（50% ACN+2% TFA），于室溫下振蕩20 min，經磁吸分離材料并收集洗脫液以用于后續(xù)分析.

1.2.4 MALDI-TOF MS的質譜條件 樣品測試采用AB Sciex 5800型飛行時間質譜儀，選用正離子模式，基質采用含25 mg/mL DHB的70% ACN+1% H3PO4溶液.測試前，取待測樣品與DHB基質溶液各0.5μL，混合均勻后滴于質譜儀的靶板表面.質譜儀的其它參數設置如下：離子源溫度110℃；電噴霧電壓2.3 kV；掃描范圍m/z1000～3500；毛細管電壓3500 V；碰撞解離能量10 eV.

2 結果與討論

2.1 Mag-Arg的合成與表征

Mag-Arg的合成及萃取流程如圖1所示.通過SEM表征了制備的Fe3O4微球和Mag-Arg的形貌和尺寸.如圖2（A）所示，Fe3O4微球呈規(guī)則的球狀形貌，但微球存在聚集現象；如圖2（B）所示，對Fe3O4微球進行修飾，可有效降低粒子間的磁性偶極吸引，使磁性微球的分散性更好.

Fig.1 Synthetic route of Mag-Arg(A)and workflow of phosphopeptides enrichment by Mag-Arg(B)

Fig.2 SEM images of Fe3O4(A)and Mag-Arg(B)

對Fe3O4微球和Mag-Arg進行了粒度分析（DLS）和Zeta電位測試，結果表明，制備的Fe3O4微球和Mag-Arg在水溶液中的尺寸分別集中在（550±2.5）nm和（560±2.0）nm，此結果SEM結果基本吻合.圖3（A）示出了pH=7.4條件下測得的粒子的表面電性.Fe3O4微球表面的多羥基使其Zeta電位為負值；與之對比，Mag-Arg表面修飾的Arg富含游離的氨基，質子化后表面帶正電荷，有利于與帶負電荷的磷酸根結合，這驗證了材料的吸附機理.圖3（B）為Fe3O4微球和Mag-Arg的振動樣品磁強計（VSM）曲線，可見修飾前/后的微球均表現出明顯的超順磁性，不存在剩磁、磁滯和矯頑磁力現象.修飾前/后磁性微球的飽和磁通量分別為77.8和63.9 A·m2·kg-1，均達到磁性分離要求.圖3（B）中插圖表明在外界磁場作用下，Mag-Arg可以在約30 s的時間內迅速地與溶液分離.

Fig.3 Zeta potentials(A)and VSM curves(B)of Fe3O4(a)and Mag-Arg(b),FTIR spectra(C)and XRD patterns(D)of Mag-TEOS(a),Mag-APTES(b)and Mag-Arg(c)

采用紅外光譜（FTIR）對Mag-Arg及中間產物Mag-APTES和Mag-TEOS進行了表征.由圖3（C）可見，Mag-Arg，Mag-APTES及Mag-TEOS在1080和789 cm-1處均有相似的特征吸收峰，分別歸屬于Fe—O鍵的彎曲振動、Si—O—Si鍵的不對稱伸縮振動和Si—O鍵的彎曲振動，說明Fe3O4微球已被硅烷化.與圖3（C）譜線a相比，譜線b在3479和1565 cm-1處出現歸屬于N—H的特征吸收峰，同時，1299 cm-1處出現C—N伸縮振動吸收峰，證實APTES已成功修飾.與圖3（C）譜線b相比，譜線c中增加了1181 cm-1處的吸收峰，歸屬于Arg中C=N的伸縮振動，說明Mag-Arg已成功制備.另外，采用X射線衍射分析對Mag-Arg，Mag-APTES及Mag-TEOS的晶體結構進行了表征.由圖3（D）可見，3種材料均出現6個明顯的衍射峰（2θ=30.3°，35.6°，43.4°，53.6°，57.3°，63.0°）.對比JCPDS粉末衍射標準聯合委員會磁鐵數據庫中的數據發(fā)現，這些衍射峰完全匹配Fe3O4微球的（220），（311），（400），（422），（511）和（440）晶面，說明材料的有機合成過程沒有破壞Fe3O4微球的晶格結構.

2.2 Mag-Arg對磷酸化肽的富集能力

以Trypsin酶解的20 pmolβ-casein產生的磷酸化肽為標準樣品，考察了Mag-Arg對磷酸化肽的富集能力.由于在不同酸度條件下，吸附劑對磷酸化肽的吸附選擇性會隨之改變，本實驗采用控制單一變量法，分別優(yōu)化樣品緩沖液和洗脫液的酸度.選取樣品緩沖液中HAc濃度分別為0.01，0.1和1 mol/L進行實驗，結果如圖4（A）和（B）所示，當樣品緩沖液中HAc濃度為0.01 mol/L時，多磷酸化肽的信號弱；當HAc濃度為1 mol/L時，單磷酸化肽的信號弱，且質譜圖中雜峰多.選取洗脫液中TFA的體積分數分別為2%，4%和6%進行實驗發(fā)現，當TFA體積分數為4%和6%時，多磷酸化肽的信號增強，但單磷酸化肽的富集能力欠佳［圖4（C）和（D）］.最終，確定溶劑A（50% ACN+0.1 mol/L HAc）和溶劑B（50% ACN+2% TFA）為最佳的緩沖液和解吸液組合.

在最佳實驗條件下，對比了直接質譜分析與經Mag-Arg富集后磷酸化肽的質譜圖.如圖5（A）所示，在相同的質譜條件下，直接分析所得質譜圖中未見磷酸化肽的信號峰，主要由于樣品溶液中存在高豐度的非磷酸化肽導致.如圖5（B）所示，經Mag-Arg富集后磷酸化肽的信號峰十分明顯，背景干凈，雜峰極少，說明Mag-Arg對磷酸化肽具有較高捕獲能力，能有效屏蔽樣品中非磷酸化肽的干擾.富集到的磷酸化肽的詳細信息見表1.為了對比Mag-Arg，Mag-APTES和Mag-TEOS對磷酸化肽富集的效果，將Mag-APTES和Mag-TEOS也分別用于相同β-casein酶解液中磷酸化肽的富集.如圖5（C）和（D）所示，Mag-TEOS未捕獲到磷酸化肽，而Mag-APTES僅捕獲到1條磷酸化肽（m/z2061.4），表明Arg的后修飾顯著提高了材料對磷酸化肽的捕獲能力.

Fig.4 MALDI mass spectra ofβ-casein digests at different acidity conditions

Fig.5 MALDI mass spectra ofβ-casein digests

Table 1 Detailed information of the observed phosphopeptides obtained fromβ-casein tryptic digests enriched by Mag-Arg after different times

為了考察材料的重復利用性，選用20 pmolβ-casein酶解液作為標準品，在相同實驗條件下，將材料第1次、第7次和第14次富集后的結果進行對比發(fā)現，該材料在重復使用14次后仍保持對磷酸化肽的高富集能力，如表1所示，所富集到的目標肽段的數量與第1次使用時無差.為了考察所建立的基于Mag-Arg的MSPE-MALDI-TOF MS方法的靈敏度，將β-casein標準品分別稀釋至50，5，0.5和0.1 fmol用于檢測.由圖6可見，當樣品濃度稀釋至0.1 fmol時，仍能檢測到2條磷酸化肽（m/z2061.6和2556.7），表明本方法對磷酸化肽檢測具有較高的靈敏度.

Fig.6 MALDI MS spectrum of 0.1 fmolβ-casein digests after enrichment by Mag-Arg

2.3 復雜樣品的分析

為了考察所建立方法對磷酸化肽的選擇性，將2種標準磷酸化蛋白β-casein和OVA與典型的非磷酸化蛋白BSA按摩爾比1∶2000∶2000混合作為復雜樣品.質譜分析結果表明，在直接分析所得質譜圖中未觀察到磷酸化肽的信號峰［圖7（A）］；而在經Mag-Arg富集后的質譜圖［圖7（B）］中，非磷酸化肽的信號被顯著抑制，出現6條明顯的磷酸化肽的信號峰和1條去磷酸化肽信號峰，說明Mag-Arg在復雜樣品中對磷酸化肽具有較高的選擇性.富集到的磷酸化肽的詳細信息見表2.

Fig.7 MALDI MS spectra of composite samples(A,B)and nonfat milk samples(C,D)

Table 2 Detailed information of the observed phosphopeptides obtained from composite samples and nonfat milk samples enriched by Mag-Arg

為了驗證所制備材料在實際生物樣品分析中的富集效果，選擇處理過的脫脂牛奶（均購于本地超市）為實際樣品，富集條件與富集標準樣品時的相同.由于牛奶中含有大量的蛋白質，其中磷酸化蛋白含量較低，在未經富集的質譜圖中，背景復雜，非目標肽段干擾大，幾乎檢測不到磷酸化肽［圖7（C）］；與之相比，經Mag-Arg富集后，可以檢測到14條磷酸化肽［圖7（D）］，其中包括6條單磷酸化肽和8條多磷酸化肽.富集到的磷酸化肽的詳細信息見表2.同時，在圖7（D）中可以觀察到非磷酸化肽的信號豐度相對較弱，說明所制備的Mag-Arg具備應用于實際樣品分析的能力.對比文獻［17，21～25］報道的基于胍基材料富集磷酸化肽的方法（見表3），本文方法檢出限較低，在復合樣品和實際牛奶樣品中對磷酸化肽的選擇性均較高.

Table 3 Comparison of the determination of phosphopeptides based on different materials

3 結 論

制備了精氨酸功能化的磁性微球吸附劑，通過SEM，DLS，VSM，FTIR和XRD對其進行了表征.結果表明，Mag-Arg的結構均勻且分散性良好，其平均粒徑約為560 nm，具有晶型結構穩(wěn)定、磁感應強等優(yōu)點，其飽和磁化強度高達63.9 A·m2·kg-1.制備的Mag-Arg表面富含大量的帶正電荷的胍基，與溶液中呈負電性的磷酸根之間存在較強的相互作用，適用于高選擇性捕獲磷酸化肽.將Mag-Arg應用于MSPE前處理技術，以標準磷酸化蛋白的酶解產物作為樣品，結合MALDI-TOF MS平臺，成功捕獲到樣品中磷酸化肽的信號峰，且方法的檢出限低至0.1 fmol，證明方法具有較高的靈敏度.最后，將建立的基于Mag-Arg和MSPE-MS的聯用方法用于復雜樣品和牛奶樣品中磷酸化肽的分析，均取得了較好結果，證明該方法具有較高的選擇性和適用于實際樣品分析的能力.