IKKα調(diào)控子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞cyclin D1的表達(dá)及其蛻膜化過程

楊殊琳 姚君寧 隋 聰 章漢旺 白 劍 饒 群

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院(武漢，430000)

人類子宮內(nèi)膜蛻膜化并不是由胚胎著床發(fā)動(dòng)，但小鼠內(nèi)膜蛻膜化必須依賴胚胎著床過程[1-2]。蛻膜細(xì)胞通過影響子宮內(nèi)膜的容受性而影響胚胎著床和妊娠。臨床上很多疾病如著床失敗、反復(fù)流產(chǎn)、子宮內(nèi)膜異位癥和子癇前期均與基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化異常相關(guān)[3-7]。目前證實(shí)核因子(NF)-κB轉(zhuǎn)錄因子家族在細(xì)胞生長中發(fā)揮重要作用。核因子kappa-B激酶抑制劑(IKK)α和β在多種應(yīng)激條件下決定細(xì)胞的存活或凋亡。細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)在細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期過程中影響細(xì)胞周期進(jìn)程[8]。對(duì)IKKα基因敲除細(xì)胞的研究顯示，IKKα可介導(dǎo)cyclin D1 Thr286的磷酸化，使cyclin D1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)并被降解，從轉(zhuǎn)錄后途徑下調(diào)cyclin D1的表達(dá)[9]。IKKα缺乏將導(dǎo)致cyclin D1過表達(dá)從而參與多種癌癥的發(fā)生過程[10-11]。IKKα可從轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控cyclin D1的表達(dá)，但是在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中對(duì)cyclin D1的調(diào)控方向并不清楚，對(duì)蛻膜化和胚胎著床的影響還需進(jìn)一步研究。為了研究IKKα對(duì)cyclin D1的調(diào)控作用、對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化過程和容受性的影響，本研究以人和小鼠的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞為對(duì)象，建立了體外和體內(nèi)子宮內(nèi)膜蛻膜化研究模型，從人和小鼠兩方面探討IKKα對(duì)cyclin D1的調(diào)控作用，以及在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖、蛻膜化和胚胎著床過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1人原代細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)增生期子宮內(nèi)膜均取材于2018年11月—2019年5月本院女性患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡25～30歲；②因男方因素導(dǎo)致不孕；③月經(jīng)周期規(guī)律；④輸卵管繼發(fā)不孕。滿足②/④+①+③即可納入。排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮內(nèi)膜病變；②內(nèi)分泌異常；③近3個(gè)月內(nèi)服用激素。病理檢查結(jié)果均符合月經(jīng)周期增生期時(shí)象改變。提取人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(hESCs)置于10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM/F12培養(yǎng)基，在5%CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作程序均符合NIH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南。6周齡雌、雄SPF級(jí)昆明小鼠各15只，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：42000600007146、42000600006595、42000600006807；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SYXK(鄂)2014-0049。小鼠體質(zhì)量22～24 g，飼養(yǎng)于本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫22～26℃，相對(duì)濕度50%～80%，每日給予12 h光照模擬晝夜變化，標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

1.1.3藥物與試劑DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM、lipofectamine2000購自美國Life Technologies公司；無水乙醇、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PBS粉劑、50×蛋白酶抑制劑Cocktail、蛋白上樣緩沖液、脫脂奶粉、青鏈霉素混合液、DEPC水、Tween-20、甘氨酸、氯化鈉、氯化鉀、濃鹽酸、Tris-base、SDS、甲醇、RNAse、碘化丙啶(PI)、ECL試劑盒、Western blotting配膠套裝、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、RIPA裂解液均購于武漢谷歌生物科技有限公司；IV型膠原酶(LS004188)購于美國Worthington Biochemical Corporation；8-Br-cAMP 粉劑、MPA粉劑均購于美國 Sigma 公司; I型DNA酶(04536282001)購于美國Roche Applied Science公司；10-170KD蛋白Marker 購于美國Thermo Fisher公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TRIZOL、SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)購于日本Takara公司；IKKα(CHUK)/NC siRNA購于中國廣州銳博銳博生物科技有限公司；β-actin兔抗小鼠/人多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購于武漢谷歌生物科技有限公司；IGFBP1兔抗人多克隆抗體購于美國GeneTex公司；IKKα兔抗小鼠/人單克隆抗體、Cyclin D1兔抗小鼠/人單克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.4體外轉(zhuǎn)染相關(guān)siRNA序列由中國廣州銳博銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)及合成。①IKKα(CHUK)siRNA 序列：正向 5’-UGUUCAUAGCCAUUUCUUC-3’；反向 5’-GAAGAAAUGGCUAUGAACA-3’。②siRNA NC序列：正向 5'-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'；反向 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。③siRNA NC-FAM序列：正向 5'-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'，修飾方式5'-FAM；反向 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’, 修飾方式5'-FAM。

1.1.5體內(nèi)轉(zhuǎn)染相關(guān)siRNA序列由中國廣州銳博銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)及合成。①IKKα(Chuk)siRNA 序列：Sense 5’-CAGCAACUCAAAGCUAAAUTT-3’；Anti-sense 5’-AUUUAGCUUUGAGUUGCUGTT-3’。②siRNA NC序列：Sense 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；Anti-sense 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。③siRNA NC-FAM序列：Sense 5'-UUCUCCGAACGUGUUCACGUTT-3'；Anti-sense 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’,修飾方式5'-FAM。

1.1.6Real-time引物從NCBI查找核酸序列，用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物序列的設(shè)計(jì)，引物由武漢奧科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列及預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小見表1。

表1 引物序列(5’-3’)

1.2 人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)和蛻膜化模型建立

1.2.1hESCs原代分離培養(yǎng)傳代培養(yǎng)至第三代時(shí)接種至6孔板，3孔采用配置好的8-Br-cAMP溶液40 μl、MPA 溶液2 μl和蛻膜化培養(yǎng)基1.96 ml(2%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)4 d誘導(dǎo)hESCs蛻膜化;另3孔使用蛻膜化培養(yǎng)基(2%FBS)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)作為對(duì)照組。顯微鏡下觀察蛻膜化干預(yù)第4日時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化。Real-time PCR方法檢測蛻膜化細(xì)胞中PRL和IGFBP1 mRNA表達(dá)。用LightCycler 96分析。

1.2.2Westernblotting檢測PRL和IGFBP1蛋白表達(dá)恒定電流300mA轉(zhuǎn)膜1h，兔抗人/鼠β-actin 多克隆抗體稀釋比例為1:800，其余一抗稀釋比例均為1：1000，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗稀釋比例為1：4000。用GENESys軟件進(jìn)行圖片處理及分析。以 β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件進(jìn)行灰度值測定，GraphPad行灰度值半定量分析。

1.2.3流式細(xì)胞分選技術(shù)檢測蛻膜化細(xì)胞周期變化①收集細(xì)胞離心；②用1 X PBS重懸洗滌細(xì)胞，離心棄上清(重復(fù)2次)；③用1.2ml 1 X PBS重懸細(xì)胞，加入2.8ml-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定液，充分吹打混勻后-20 ℃過夜保存；④離心去上清，加入0.5 ml PBS重懸細(xì)胞(重復(fù)2次)。用0.1ml 1 X PBS細(xì)胞重懸；⑤向離心管中加入2.5μl RNAse(10ug/ml)置37℃恒溫?fù)u床消化1h；⑥向離心管中加入50 μl PI(0.1mg/ml)，4℃避光靜置30min。根據(jù)細(xì)胞密度添加1 X PBS調(diào)整最終體積為400～500μl；⑦立即用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；⑧用LuxScan 軟件分析檢測結(jié)果。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4IKKα通過cyclinD1調(diào)控人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化構(gòu)建合成IKKα(CHUK)siRNA、陰性對(duì)照NC siRNA和FAM連接的NC siRNA，轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)hESCs中(CHUK組和NC組各3孔)，8 h終止轉(zhuǎn)染并用8-Br-cAMP和MPA蛻膜化干預(yù)96 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。Real-time PCR方法檢測IKKα、cyclin D1、PRL和IGFBP1 mRNA表達(dá)，Western blotting檢測IKKα、cyclin D1和IGFBP1蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞分析儀分析細(xì)胞周期(方法同1.2.1)。比較轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞周期改變及cyclin D1、PRL和IGFBP1表達(dá)變化。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化模型建立性成熟雌性昆明鼠與輸精管結(jié)扎后的雄性昆明鼠合籠，見陰栓標(biāo)記為D1(3只)。在第4日對(duì)一側(cè)宮角注射蓖麻油模擬胚胎著床誘導(dǎo)蛻膜化，對(duì)側(cè)宮角注射等量生理鹽水作為自身對(duì)照。D7處死小鼠，HE染色顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和內(nèi)膜腺管，免疫組織化學(xué)觀察IGFBP1的表達(dá)，Real-time PCR和Western blotting檢測內(nèi)膜細(xì)胞中IGFBP1、PRL的mRNA和蛋白表達(dá)(方法同1.2.1)。

1.2.6IKKα通過cyclinD1對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程及胚胎著床的影響性成熟雌性KM鼠與輸精管結(jié)扎后雄性KM鼠合籠，見陰栓(D1)宮角注射(3只)IKKα(Chuk)/NC siRNA,在第4日再次雙側(cè)宮角注射蓖麻油模擬胚胎著床誘導(dǎo)蛻膜化。于D7處死小鼠，HE染色顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和子宮內(nèi)膜腺管，免疫組織化學(xué)觀察IGFBP1表達(dá)，Real-time PCR和Western blotting分別檢測小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞中IKKα、cyclin D1、PRL和IGFBP1的表達(dá)。(方法同1.2.1)將性成熟雌性昆明鼠與正常雄性昆明鼠合籠，見陰栓(D1)宮角注射(3只)IKKα(Chuk)/NC siRNA,D6處死小鼠，記錄雙側(cè)子宮受精卵著床位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graph Pad分析。組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 8-Br-cAMP和MPA體外誘導(dǎo)hESCs蛻膜化

與對(duì)照組相比，8-Br-cAMP和MPA 蛻膜化組第4日hESCs形態(tài)由原本的長梭形變成多角形，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞形狀變圓，細(xì)胞核變大顏色變淡，細(xì)胞界限變模糊(圖1A4，2247頁)；而對(duì)照組hESCs形態(tài)則維持長梭形未發(fā)生變化(圖1A2，2247頁)。Real-time PCR檢測第4日蛻膜化組細(xì)胞PRL mRNA水平(339.00±52.25 fold)高于對(duì)照組(1.00±0.07 fold)，IGFBP1(199.62±9.36 fold)高于對(duì)照組(1.00±0.29 fold)(均P<0.0001)。Western blotting檢測第4日蛻膜化組細(xì)胞IGFBP1的蛋白水平高于對(duì)照組(4.86±0.30 比1.23±0.16)(P<0.0001)(圖1B，2247頁)。體外蛻膜化過程中hESCs發(fā)生了G0-1到S期的阻滯，G0-1期細(xì)胞蛻膜化組(88.12±0.10)%比對(duì)照組(82.98±0.42)%(P=0.0003)，S期細(xì)胞蛻膜化組(1.36±0.13)%比對(duì)照組(7.36±1.12)%(P=0.00061)(圖1C，2247頁)。

2.2 下調(diào)IKKα后Cyclin D1過表達(dá)及hESCs體外蛻膜化

轉(zhuǎn)染NC siRNA-FAM組轉(zhuǎn)染效率見圖2A(2248頁)，hESCs形態(tài)由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?，?xì)胞體積變大變圓，細(xì)胞核變大顏色變淡，細(xì)胞界線變模糊(圖2B4，2248頁)；IKKα siRNA轉(zhuǎn)染的基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化(圖2B2，2248頁)。轉(zhuǎn)染IKKα(CHUK)siRNA組，Real-time PCR和Western blotting檢測到hESCs中cyclin D1的表達(dá)水平均提高，mRNA水平IKKα轉(zhuǎn)染組(11.00±0.13 fold)高于對(duì)照組(1.15±0.18 fold)(P<0.0001)；蛋白水平IKKα轉(zhuǎn)染組(3.69±0.22)高于對(duì)照組(2.26±0.23)(P=0.0112)，PRL、IGFBP1表達(dá)水平均低于對(duì)照組(PRL mRNA 1.00±0.33 fold比405.31±101.10 fold)(P=0.0161)，(IGFBP1 mRNA 1.00±0.33 fold比 637.81±194.00 fold)(P=0.0304)；IGFBP1 蛋白水平灰度IKKα轉(zhuǎn)染組0.96±0.11比2.62±0.15(P=0.0008)(圖2C，2248頁)。與轉(zhuǎn)染組相比，對(duì)照組S期細(xì)胞比例從(12.68±0.70)%下降至(2.87±0.03)%(P=0.0001)，G0-G1期細(xì)胞比例從(78.74±1.03)%升高至(86.74±0.47)%(P=0.0021)，發(fā)生了G0-1到S期的阻滯(圖2D，2248頁)。

2.3 假孕小鼠宮角注射蓖麻油誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜蛻膜化

小鼠子宮大體觀示，注射蓖麻油側(cè)宮角明顯增粗，如圖3A(2248頁)。HE染色可見注射蓖麻油側(cè)宮角子宮內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增大變圓且內(nèi)膜腺體明顯增生擴(kuò)張。免疫組化結(jié)果顯示，與注射生理鹽水側(cè)相比，注射蓖麻油側(cè)宮角內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞均高表達(dá)IGFBP1，如圖3B(2248頁)。Real-time PCR檢測到注射蓖麻油側(cè)PRL(338.99±52.25 flod)和IGFBP1(199.62±9.36 flod)表達(dá)高于對(duì)照側(cè)(1.00±0.07 fold, 0.99±0.30 fold)(P=0.0029、P<0.0001)；Western blotting檢測到注射蓖麻油側(cè)IGFBP1表達(dá)(灰度6.47±0.66)高于對(duì)照側(cè)(灰度1.90±0.26)(P=0.0030)(圖3C，2248頁)。

2.4 下調(diào)IKKα表達(dá)Cyclin D1過表達(dá)及小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化和胚胎著床

在假孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化模型的基礎(chǔ)上干擾IKKα的表達(dá)，并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，不同激發(fā)波長下的轉(zhuǎn)染效率如圖4B(2249頁)。轉(zhuǎn)染側(cè)宮角和對(duì)照側(cè)宮角均增粗，內(nèi)膜增厚(圖4A，2249頁)。HE染色顯示NC轉(zhuǎn)染側(cè)宮角腺管增生擴(kuò)張，基質(zhì)細(xì)胞核增大深染。IKKα轉(zhuǎn)染宮角基質(zhì)細(xì)胞核大深染，未見增生擴(kuò)張的腺管。免疫組織化學(xué)檢測IKKα轉(zhuǎn)染側(cè)宮角IGFBP1表達(dá)量低于對(duì)照側(cè)(圖4C，2249頁)。轉(zhuǎn)染側(cè)IKKα(CHUK)、PRL和IGFBP1表達(dá)低于對(duì)照側(cè)(IKKα1.33±0.31 fold比8.10±1.18 fold，P=0.0052,灰度IKKα0.41±0.29比2.32±0.15，P=0.004；PRL 1.00±0.33 fold比471.97±54.89 fold，P=0.0010；IGFBP1 0.99±0.33 fold比671.14±74.00 fold，P=0.0008，灰度0.98±0.40比6.33±0.76，P=0.0033)，cyclin D1表達(dá)高于對(duì)照側(cè)(10.00±0.59 fold 比2.49±0.21 fold，P=0.0003，灰度2.64±0.67 比 0.97±0.29，P=0.0427)(圖4D，2249頁)。真孕小鼠IKKα轉(zhuǎn)染側(cè)胚胎著床數(shù)少于NC轉(zhuǎn)染側(cè)(5.33±0.49比9.67±0.33，P<0.0001)(圖4E，2249頁)。

3 討論

蛻膜化是子宮內(nèi)膜獲得容受性的必要過程。當(dāng)胚胎著床發(fā)生時(shí)，蛻膜化的基質(zhì)細(xì)胞包繞胚胎與之建立起直接聯(lián)系，并產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子活化血管內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞，在胚胎的識(shí)別和選擇中發(fā)揮作用。子宮內(nèi)膜蛻膜化過程伴隨著細(xì)胞周期改變，cyclin D1作為G0-G1期關(guān)鍵蛋白，在細(xì)胞周期的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[12-13]。研究顯示，IKKα在哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中可通過RANK/RANKL介導(dǎo)的NF-κB活化促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D表達(dá)[9]。IKKα基因敲除小鼠表皮細(xì)胞的失控增殖也提示了IKKα在細(xì)胞增殖中作用[14-15]。提示IKKα與細(xì)胞周期的關(guān)系。Cyclin D1在細(xì)胞中分布具有細(xì)胞周期特異性。新合成的cyclin D1與CDK4/6結(jié)合被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核介導(dǎo)pRb磷酸化。在細(xì)胞周期的S期，cyclin D1僅存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[16]。研究顯示，在IKKα-/-細(xì)胞中，cyclin D1穩(wěn)定存在于細(xì)胞核中，當(dāng)回補(bǔ)IKKα?xí)r，cyclin D1的這種分布特性消失。研究證實(shí)IKKα可通過 T細(xì)胞因子(Tcf)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)cyclin D1 Thr286的磷酸化[17]。因此，IKKα可介導(dǎo)cyclin D1 Thr286的磷酸化，使其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)并降解，從而從轉(zhuǎn)錄后途徑下調(diào)了cyclin D1的表達(dá)[18]。

為研究IKKα介導(dǎo)的cyclin D1下調(diào)是否在蛻膜化過程中具有調(diào)控作用，本研究以hESCs體外培養(yǎng)為基礎(chǔ)，給予8-Br-cAMP和MPA干預(yù)誘導(dǎo)體外蛻膜化過程。結(jié)果顯示，在體外hESCs蛻膜化干預(yù)4 d時(shí)細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槊黠@的蛻膜化細(xì)胞狀態(tài)，IGFBP1和PRL水平升高，hESCs細(xì)胞發(fā)生G0-G1到S期的阻滯。為明確IKKα對(duì)cyclin D1表達(dá)的調(diào)控在hESCs蛻膜化過程中的影響，本研究構(gòu)建了IKKα的siRNA，通過體外轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，并給予8-Br-cAMP和MPA誘導(dǎo)蛻膜化。檢測干擾IKKα RNA后蛻膜化干預(yù)96h時(shí)cyclin D1、IGFBP1和PRL的表達(dá)，結(jié)果顯示下調(diào)IKKα?xí)r，cyclin D1表達(dá)顯著上調(diào)，IKKα siRNA轉(zhuǎn)染組IGFBP1和PRL表達(dá)水平低于NC siRNA轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞周期結(jié)果顯示IKKα siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期未發(fā)生明顯變化，而NC siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期發(fā)生了G0-G1到S期阻滯。以上結(jié)果提示，下調(diào)IKKα通過過表達(dá)cyclin D1促進(jìn)hESCs增殖抑制其分化，導(dǎo)致其無法發(fā)生蛻膜化。

在動(dòng)物試驗(yàn)中，本研究利用蓖麻油宮角注射技術(shù)成功建立體內(nèi)蛻膜化模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射蓖麻油側(cè)宮角明顯增粗，內(nèi)膜增厚，形態(tài)學(xué)觀察見子宮內(nèi)膜大量腺管增生擴(kuò)張，基質(zhì)細(xì)胞核大深染，發(fā)生蛻膜化樣變化。腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞廣泛高表達(dá)IGFBP1，GFBP1和PRL表達(dá)高于對(duì)照側(cè)。說明本研究建立的小鼠體內(nèi)蛻膜化模型是成功的。為進(jìn)一步研究IKKα對(duì)cyclin D1表達(dá)的調(diào)控在體內(nèi)蛻膜化過程中的影響，我們利用IKKα siRNA轉(zhuǎn)染一側(cè)宮角并雙側(cè)宮角注射蓖麻油誘導(dǎo)蛻膜化過程，結(jié)果顯示雙側(cè)宮角均增粗，內(nèi)膜增厚，HE染色顯示IKKα siRNA轉(zhuǎn)染側(cè)基質(zhì)細(xì)胞增生核變大深染，但未見增生擴(kuò)張的腺體，IGFBP1表達(dá)量未升高。NC siRNA轉(zhuǎn)染側(cè)腺體明顯增生擴(kuò)張，基質(zhì)細(xì)胞核增大變圓深染發(fā)生蛻膜化樣改變，IGFBP1表達(dá)量升高，廣泛表達(dá)于內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞。與NC siRNA轉(zhuǎn)染側(cè)相比，IKKα轉(zhuǎn)染側(cè)內(nèi)膜中cyclin D1表達(dá)水平上調(diào)，IGFBP1和PRL表達(dá)水平低于NC轉(zhuǎn)染側(cè)。蛋白表達(dá)水平與RNA表達(dá)水平趨勢一致。IKKα siRNA轉(zhuǎn)染側(cè)胚胎著床數(shù)少于NC siRNA轉(zhuǎn)染側(cè)。提示NC轉(zhuǎn)染側(cè)宮角蛻膜化成功，IKKα轉(zhuǎn)染側(cè)宮角基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了蛻膜化(因活體是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，單一的干預(yù)因素造成的改變可被其他途徑代償)但是內(nèi)膜腺體和血管均未完成蛻膜化過程，IGFBP1和PRL等蛻膜化相關(guān)因子分泌低于對(duì)照組。子宮內(nèi)膜這種不完全的蛻膜化改變最終影響了胚胎著床。故認(rèn)為，干擾IKKα的表達(dá)使cyclin D1過表達(dá)，可影響小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中腺體改變，最終造成蛻膜化過程不完全，從而影響胚胎著床。

綜上所述，本研究建立了體外和體內(nèi)子宮內(nèi)膜蛻膜化研究模型，從人和小鼠兩方面進(jìn)行論證，探討了IKKα對(duì)cyclin D1的調(diào)控作用對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化過程和胚胎著床的影響。下調(diào)IKKα的表達(dá)導(dǎo)致cyclin D1過表達(dá)，可以抑制子宮內(nèi)膜蛻膜化并影響胚胎著床。該結(jié)論有望揭示部分反復(fù)著床失敗和早期流產(chǎn)患者的病理生理機(jī)制，為輔助生殖技術(shù)提供新的治療靶點(diǎn)。