夏閑期種植翻壓綠肥作物對麥田土壤細菌多樣性的影響

呂卓呈，李廷亮，2，謝英荷，2，李 順，王嘉豪

（1.山西農業(yè)大學資源環(huán)境學院，山西太谷 030801；2.山西農業(yè)大學資源與環(huán)境國家級實驗教學示范中心，山西太谷 030801）

綠肥作為一種養(yǎng)分豐富的生物肥料，在目前我國化肥零增長計劃以及土壤有機質提升戰(zhàn)略中，是一種重要的化肥替代肥源[1]。綠肥腐解過程中養(yǎng)分的釋放過程緩慢，可滿足作物生長過程養(yǎng)分的逐步需求，不僅能有效提高作物產量和養(yǎng)分利用效率，還可以降低養(yǎng)分淋溶損失的風險[2]。綠肥在微生物作用下產生大量腐殖質，增加了土壤中水穩(wěn)定性團粒結構數(shù)量，起到改善土壤通氣、保水和保肥等作用，也能為土壤微生物代謝提供大量碳源和氮源，使土壤細菌Shannon 指數(shù)與Simpson 指數(shù)明顯提高，改變了土壤細菌多樣性以及群落組成，促進了細菌對固有有機質的分解和利用，從而使土壤的有機質處于一個動態(tài)平衡和不斷更新的過程中[3]。

我國綠肥資源豐富，已發(fā)現(xiàn)禾本科、豆科、十字花科、莧科等10 個科共計1 000 多個綠肥作物。我國不同生態(tài)種植區(qū)由于氣候環(huán)境條件差異，適宜種植的綠肥作物種類不一，但大量研究表明，種植翻壓綠肥對提升土壤養(yǎng)分含量和微生物多樣性均具有積極促進作用[4]。林葉春等[5]研究表明，種植翻壓綠肥能夠使土壤全氮、水解氮和有機質含量增加，且土壤pH 值也隨之發(fā)生改變，其中，土壤pH 值和有機質含量對于土壤細菌群落結構變化具有重要影響。萬水霞等[6]在安徽雙季稻種植區(qū)研究表明，種植翻壓紫云英配施化肥7 a 后，土壤微生物數(shù)量顯著增加了58.09%～86.86%，其中細菌數(shù)量增加了77.93%～112.76%。張珺穜等[7]研究表明，在水稻土種植紫云英并翻壓還田還可以顯著提高土壤放線菌、氨化細菌和纖維素分解菌數(shù)量。高嵩涓等[8]研究表明，種植翻壓紫云英可提高土壤微生物量碳和土壤微生物量氮含量，晚稻收獲后相對冬閑分別提高了21.12%和98.45%，全年平均值分別提高了15.92%和36.49%。陳曉波等[9]在云南紅壤煙草地研究表明，種植翻壓光葉紫花苕增加了土壤細菌、放線菌數(shù)量，變化差異均達到顯著水平（P＜0.05）。另外，通過對馬鈴薯和綠肥輪作的研究發(fā)現(xiàn)，輪作增加了土壤革蘭氏陽性細菌和真菌的多樣性，導致土壤微生物群落的改變，從而增加了土壤微生物活性[10]。綜上，綠肥對土壤微生物特征影響的研究多集中在水稻和煙草種植區(qū)，而在黃土高原旱作麥區(qū)的報道相對較少。通過研究種植并翻壓綠肥對土壤細菌群落結構的變化，探討綠肥腐解養(yǎng)分釋放過程的微生物機制，有助于在黃土旱塬麥區(qū)構建系統(tǒng)完整的綠肥生產體系。

黃土高原一年一作的旱地冬小麥種植區(qū)，每年的7—9 月是冬小麥夏閑期，也是當?shù)氐乃疅豳Y源豐沛期，期間種植翻壓綠肥作物對提高土壤肥力和小麥產量具有重要意義，但目前有關旱地冬小麥夏閑期適宜綠肥作物種植研究相對較少。本研究從土壤微生物代謝角度，利用高通量測序技術分析了旱地冬小麥夏閑期種植翻壓不同綠肥作物對土壤細菌多樣性及其功能的影響，以期為該區(qū)域旱地土壤培肥和適宜綠肥作物篩選提供一定依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于黃土高原東南部的山西省臨汾市洪洞縣冬小麥種植區(qū)（36.3°N，111.4°E，海拔648 m）。試驗區(qū)屬于溫帶大陸季風性氣候，四季干濕冷暖分明，年平均日照時數(shù)2 491 h，積溫3 300 ℃，無霜期180～210 d，年平均降水量500 mm 左右，60%～70%集中在6—9 月，為典型旱地雨養(yǎng)農業(yè)區(qū)。供試土壤類型為石灰性褐土，質地為中壤。試驗田0～20 cm土壤基本理化性質為：有機質含量14.6 g/kg，全氮含量0.87 g/kg，硝態(tài)氮含量10.4 mg/kg，銨態(tài)氮含量12.2 mg/kg，速效磷含量10.4 mg/kg，速效鉀含量168.2 mg/kg，陽離子交換量27.3 cmol/kg。

1.2 試驗材料

供試大豆品種為晉豆47 號，綠豆品種為中綠1 號，由優(yōu)種網(wǎng)（北京）商貿有限公司提供；供試黑豆為小黑豆，品種未知，由洪洞縣農業(yè)農村局提供；供試烏豇豆為農民自留種，品種未知；供試草木樨品種為庫明諾（Cumino）黃花草木樨，檉麻品種為皖檉1 號，由北京正道生態(tài)科技有限公司提供。

1.3 試驗設計

2019 年在旱地冬小麥夏閑期（6—9 月）種植6 種豆科綠肥作物，分別為黑豆（GL）、綠豆（VW）、烏豇豆（VS）、大豆（GM）、檉麻（CJL）、草木樨（MP），以農戶傳統(tǒng)休閑模式為對照（CK）。小區(qū)面積42 m2（6 m×7 m），采用隨機區(qū)組設計，每個處理3 個重復。綠肥的播種時間為2019 年7 月11 日，各小區(qū)綠肥作物基本苗保證在30.0 萬～37.5 萬株/hm2，綠肥粉碎翻壓時間為2019 年9 月20 日，綠肥翻壓后于2019 年10 月20 日播種冬小麥。

1.4 樣品采集與制備

于2019 年11 月15 日在黑豆、綠豆、烏豇豆、檉麻、草木樨、大豆和對照處理對應的小區(qū)，用5 點法采集耕層土壤（0～20 cm）樣品，將每個小區(qū)的土壤混合樣品置于密封性較好的無菌自封袋中放入保溫箱中，用冰袋冷藏帶回實驗室。土壤樣品過2 mm 篩，混勻后取部分土壤樣品于無菌離心管中，在-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 土壤細菌群落結構分析

將過2 mm 篩的鮮土經(jīng)-80 ℃低溫處理后，干冰儲藏送往北京奧維森基因科技有限公司進行基于細菌16S rDNA 的高通量測序分析，用正向338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和反向806R（5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）的通用引物擴增細菌16SrRNA基因的V3-V4 區(qū)。PCR 采用Trans-Gen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase。每個樣本3 個重復，將同一樣本的PCR 產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 產物，Tris HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。采用Qiime 軟件對高通測序結果進行有效化處理和Alpha-多樣性指數(shù)分析，并對97%相似水平下的OTUs（Operational Taxonomic Units）進行基于Silva 數(shù)據(jù)庫的分類學分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 和R 語言對高通測序數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析后，繪制花瓣圖及PCA 分析。

2 結果與分析

2.1 種植翻壓綠肥后土壤Illumina 測序結果

不同處理土樣Illumina MiSeq 高通量測序結果如表1 所示。

表1 樣品序列數(shù)統(tǒng)計

由表1 可知，7 個處理共獲得1 649 541 條序列，過濾掉低質量的序列，優(yōu)化后得到1 611 976 條序列。統(tǒng)計各個樣品在不同OTU 中的豐度信息，共產生40 136 個OTU。各處理的序列優(yōu)質率均在97%以上。各綠肥處理的OTU 數(shù)量均高于農戶模式，增幅在2.3%～8.8%，具體表現(xiàn)為草木樨＞綠豆＞檉麻＞大豆＞黑豆＞烏豇豆＞農戶。

從圖1 可以看出，各綠肥處理與農戶模式的共有OTU 數(shù)量為3 754，農戶模式特有的OTU 數(shù)量為1 706，綠肥處理中特有的OTU 數(shù)量以草木樨最高，為2 185；以烏豇豆最低，為1 834。

2.2 種植翻壓綠肥后土壤細菌Alpha-多樣性分析

Alpha-多樣性分析包括一系列統(tǒng)計學分析指數(shù)，可以反映微生物群落的豐度和多樣性。從圖2可以看出，Chao1 指數(shù)為菌種豐富度指數(shù)，各綠肥處理的Chao1 指數(shù)均高于農戶模式，增幅為0.1%～7.1%（P＜0.05），其中，草木樨和綠豆處理的Chao1指數(shù)顯著高于農戶休閑對照。Observed species 表示隨測序深度的增加實際觀測到OTU 的個數(shù)，本試驗中綠肥處理的Observed species 值較農戶模式均有不同程度的提高，其中，草木樨和綠豆處理的Observed species 值較高，分別較農戶模式高8.1%和8.0%（P＜0.05）。PD whole tree 指數(shù)是譜系多樣性指數(shù)，兼顧了物種豐度及群落多樣性，不同處理的譜系多樣性指數(shù)同樣以草木樨和綠豆處理最高，較農戶模式分別高10.1%和9.1%（P＜0.05）。Shannon 指數(shù)是對群落結構的綜合反映，其值的大小可以說明群落多樣性的高低，各綠肥處理的Shannon 值較農戶模式高0.5%～2.2%（P＜0.05），其中以綠豆處理的Shannon 指數(shù)最高。從Alpha-多樣性總體來看，不同處理之間土壤微生物多樣性表現(xiàn)為綠豆＞草木樨＞大豆＞檉麻＞黑豆＞烏豇豆＞農戶。

2.3 種植翻壓綠肥后土壤細菌群落組成主成分分析

主成分分析（Principal component analysis，PCA）可以用來分析土壤微生物的OTU 組成差異。由圖3可知，第1 主成分貢獻率達30.44%，第2 主成分貢獻率達18.74%，因子1 和因子2 代表總變量的49.18%。以這2 個主成分為坐標軸構建的二維坐標系中，各個處理在PC 軸上存在差異，說明不同綠肥處理中土壤細菌群落的結構特征存在明顯差異。綠豆（VW）和草木樨（MP）處理分布在第1 象限，烏豇豆（VS）處理分布在第2 象限，農戶傳統(tǒng)模式（CK）和黑豆（GL）處理分布在第3 象限，檉麻（CJL）、大豆（GM）處理分布在第4 象限。可知，種植草木樨與種植綠豆的土壤細菌群落組成相似，大豆與檉麻處理的土壤細菌群落組成相似，黑豆與農戶傳統(tǒng)模式的土壤細菌群落組成相似，烏豇豆與其他處理的土壤細菌群落組成差異較大。

2.4 土壤細菌群落組成分析

Illumina MiSeq 高通量測序獲得的數(shù)據(jù)在97%相似水平上進行分類。經(jīng)過高通量測序和OTU 注釋，本試驗檢測出細菌共40 門130 綱212 目374 科652 屬。

2.4.1 細菌在門水平上的群落組成 由圖4 可知，所有樣品共檢測出放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）等12 個門類的細菌（相對豐度大于1%）。其中，酸桿菌門（21.4%～31.8%）、放線菌門（18.6%～26.1%）、變形菌門（16.1%～23.7%）的相對豐度之和在7 個處理中均占到細菌總量的65%以上，為優(yōu)勢菌門。綠彎菌門（Chloroflexi，10.5%～15.7%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，4.8%～7.4%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，2.9%～4.9%）為次級優(yōu)勢菌門。除烏豇豆處理，其他綠肥處理較農戶模式均增加了土壤中變形菌門細菌的相對豐度，烏豇豆處理更有利于土壤中酸桿菌門和綠彎菌門細菌相對豐度的增加，各綠肥處理的放線菌門細菌相對豐度則較農戶模式均有不同程度的降低。

2.4.2 細菌在綱水平上的群落組成 本試驗得到的土壤細菌分屬130 個綱，Other 指平均豐度小于0.4%的細菌。從綱的分類水平上看（圖5），綱水平細菌豐度大于1%的有27 種，優(yōu)勢綱類（相對豐度＞3.0%）有10 種，包括Subgroup_6、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）、Blastocatellia、嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）、芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）和酸微菌綱（Acidimicrobiia）。不同處理間，除烏豇豆處理外，其他綠肥處理較農戶處理均提高了α-變形菌綱、β-變形菌綱和δ-變形菌綱相對豐度，烏豇豆處理則較其他處理提高了土壤中Subgroup_6、Blastocatellia 細菌的相對豐度，各綠肥處理放線菌綱、嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）相對豐度較農戶模式有不同程度的降低。

3 討論

土壤細菌作為土壤中最重要的活性組分，其多樣性水平是反映土壤質量變化的最重要指標[11-12]。本研究中，不同綠肥處理土壤細菌OTU 數(shù)量及Alpha-多樣性指數(shù)的變化趨勢相同，土壤細菌多樣性和豐富度較農戶模式均有所增加，與李文廣等[13]在黃土高原旱區(qū)的研究結論一致，將綠肥合理還田對于土壤細菌群落多樣性有明顯的改善作用。另LONGA 等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，綠肥是土壤微生物多樣性的主要來源，種植翻壓綠肥后，土壤細菌Alpha-多樣性指數(shù)都有所增加。

本研究中，綠豆和草木樨處理的土壤細菌群落組成相似，檉麻和大豆處理的土壤細菌群落組成相似，而烏豇豆與農戶傳統(tǒng)模式處理的細菌群落組成相似，與其他綠肥處理差異較大。種植烏豇豆的土壤細菌群落變化總是與其他5 種綠肥處理呈相反趨勢或更極端趨勢，對于這一結果的影響機理，仍需深入研究。

土壤細菌群落在門、綱分類水平上的物種組成分析顯示，本試驗條件下酸桿菌門、放線菌門、變形菌門平均細菌相對豐度之和占到細菌總量的68%以上，為優(yōu)勢菌門。劉爽等[15]在黃土高原半干旱區(qū)和沙區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，土壤細菌在門水平上的優(yōu)勢菌門分別為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門，相對豐度分別為21.4%～23.0%、18.7%～23.0%和17.5%～19.9%，與本試驗結果一致。王伏偉等[16]也有相似的研究結果，砂姜黑土中細菌類群豐富，優(yōu)勢細菌門為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和擬桿菌門，其中，變形菌門相對豐度最大，為38.5%～43.2%。徐冰等[17]、SAPP 等[18]、LIU 等[19]的研究結果也與本試驗結果一致。還有研究表明，酸桿菌存在于各種生境，其數(shù)量一般約占細菌總量20%～50%，對土壤生態(tài)系統(tǒng)的構建具有重要作用[20-24]。

在本研究中，各綠肥處理的放線菌門細菌相對豐度則較農戶模式均有不同程度的降低。劉平靜等[25]在關中平原麥區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，有機肥配施化肥處理降低了土壤放線菌門的相對豐度。這可能是在有機物質分解過程中產生的一些中間產物會抑制放線菌門細菌的生長，也可能與綠肥翻壓后土壤C/N 改變有關。本研究中烏豇豆處理較其他處理提高了土壤中Subgroup_6、Blastocatellia 的相對豐度，且所有處理中Subgroup_6 豐度的變化與酸桿菌門的豐度變化趨勢一致，說明Subgroup_6 是導致酸桿菌門豐度發(fā)生變化的主要原因。

變形菌門為細菌中最大的一個門，變形菌門屬于需營養(yǎng)類群，對易分解的碳源反應敏感[26]，其相對豐度通常隨著土壤氮素和有機質含量的增加而增加[27]。本研究中，種植翻壓黑豆、大豆、綠豆、檉麻、草木樨均提高了變形菌門的豐度，可能是綠肥還田為變形菌門提供了豐富的有機養(yǎng)分，而種植翻壓烏豇豆并沒有提高變形菌門豐度，且存在一定抑制作用，具體原因有待進一步研究。

4 結論

本研究表明，冬小麥夏閑期種植翻壓綠肥可增加土壤細菌的OTU 數(shù)量，不同綠肥作物之間具體表現(xiàn)為草木樨＞綠豆＞檉麻＞大豆＞黑豆＞烏豇豆＞農戶對照，且種植翻壓草木樨和綠豆較其他綠肥作物更有利于提高土壤細菌的Chao1、Observed species、PD whole tree 和Shannon 指數(shù)，提高了土壤細菌豐度和多樣性。主成分分析表明，種植翻壓草木樨和綠豆的細菌群落組成相似，而種植翻壓烏豇豆與其他綠肥處理土壤細菌群落組成差異較大。在細菌分類的門水平上，烏豇豆處理有利于土壤中酸桿菌門和綠彎菌門細菌相對豐度的增加，而其他綠肥作物更有利于土壤中變形菌門細菌的相對豐度的增加；在細菌分類的綱水平上，烏豇豆處理有利于提高了土壤中Subgroup_6、Blastocatellia 細菌的相對豐度，其他綠肥處理可提高土壤中α-變形菌綱、β-變形菌綱和δ-變形菌綱細菌的相對豐度。各綠肥處理的放線菌門細菌相對豐度較農戶模式均有不同程度的降低。綜上，本研究條件下，冬小麥夏閑期種植翻壓綠豆和草木樨可有效改善旱地麥田土壤細菌群落結構和多樣性，對土壤培肥改良起到一定作用。