黑曲霉DR12 菌株固體產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化及菌劑制備

張育銘，孫卓楠，王 勇，郭潔心，張寶俊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷 030801）

農(nóng)作物秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的一類富含有機(jī)質(zhì)、具有多用途的可再利用生物質(zhì)資源。開(kāi)展秸稈還田再利用，可減少秸稈污染、改善土壤結(jié)構(gòu)、增加田間肥力，使農(nóng)作物獲得增產(chǎn)。農(nóng)作物秸稈由大量的有機(jī)物和少量的無(wú)機(jī)物及水組成，其有機(jī)物的主要成分為纖維素類物質(zhì)。纖維素的降解需要一系列細(xì)胞壁降解酶（cell wall degradingenzymes，CWDEs）的水解、裂解等催化反應(yīng)。土壤或其他生境中存在多種假單胞桿菌、芽孢桿菌、木霉菌、青霉菌、黑曲霉及放線菌中的諾卡氏菌等[1-3]，它們可產(chǎn)生內(nèi)切-β-1，4 葡聚糖酶（Cx）、外切-β-1，4 葡聚糖酶（C1）、β-1，4 葡萄糖苷酶等一種或多種纖維素酶，促進(jìn)秸稈纖維素的降解[4-6]。因此，高效降解菌的篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化，是提高菌株生物量、提高秸稈降解率，加速生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的基礎(chǔ)。李林超等[7]從玉米秸稈堆肥中分離到多株均具有纖維素酶活性、濾紙酶活性和木聚糖酶活性的高效降解纖維素的菌株。崔秀秀等[8]對(duì)1 株耐冷纖維素降解細(xì)菌HQ 產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定發(fā)酵條件是30 g/L CMC-Na 為碳源、40 g/L 1∶1 牛肉膏-蛋白胨為氮源、0.11%吐溫-80 為促進(jìn)因子、pH 值5.35、溫度40 ℃、接種量為6.42%時(shí)效果最優(yōu)，可使內(nèi)切β-1，4 葡聚糖酶活達(dá)到32.5 U/mL，比優(yōu)化前提高2.96 倍。鄭國(guó)香等[9]對(duì)1 株奧爾森青霉菌L-11 的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，產(chǎn)酶最優(yōu)條件為麩皮11.05g/L、豆粉2.32 g/L、初始pH 值5.23、卵磷脂2.30 g/L，可使其羧甲基纖維素酶活（CMCase）達(dá)48.809 U/mL。

黑曲霉DR12 菌株是山西省植物內(nèi)生菌服務(wù)共享平臺(tái)從山西省太谷縣富含腐殖質(zhì)的農(nóng)田土壤5～10 cm 處采集并分離的1 株具有纖維素降解酶活性的纖維素降解菌，為充分發(fā)揮該菌株的產(chǎn)酶活性，分別通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其營(yíng)養(yǎng)條件、發(fā)酵條件和助劑添加量進(jìn)行優(yōu)化，并制備微生物菌劑，旨在為纖維素降解菌的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及試劑

黑曲霉DR12 菌株由山西省植物內(nèi)生菌服務(wù)共享平臺(tái)保藏并提供。

PDB 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1 000 mL，pH＝7。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 0.1 g，NaNO32.5 g，CaCl20.1 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eCl30.01 g，秸稈纖維素20 g，pH＝7。

3，5 二硝基水楊酸（DNS）、苯酚、硫酸銨等試劑購(gòu)自上海生工工程有限公司。

1.2 單因素試驗(yàn)

以固體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別使用谷子秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈、麥麩及玉米芯作為該培養(yǎng)基的碳源，在PDB 液體培養(yǎng)基中接種DR12 菌株培養(yǎng)3 d，取2 mL 作為發(fā)酵液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，在含水量為60%、30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)10 d，通過(guò)DNS 法[10]測(cè)定各處理組濾紙酶（FPA 酶）活性，分析不同碳源對(duì)DR12 菌株產(chǎn)酶活力的影響。同樣最佳氮源的篩選分別以硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨、豆粕、尿素作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氮源，其他條件同最佳碳源的篩選。各進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.3 正交試驗(yàn)

1.3.1 最佳發(fā)酵條件篩選 將溫度、含水量、pH、接種量、N%作為發(fā)酵條件試驗(yàn)因素，建立5 因素3 水平的正交試驗(yàn)（表1），培養(yǎng)10 d 后采用DNS 方法[10]測(cè)定FPA 酶的活力，以篩選出最佳的發(fā)酵條件。

表1 發(fā)酵條件篩選正交試驗(yàn)的因素與水平

1.3.2 最佳助劑添加量篩選 使用1.3.1 篩選出的最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件，建立以中微量元素、表面活性劑、保水劑、生物酶制劑作為助劑的4 因素3 水平正交試驗(yàn)（表2），篩選最佳助劑添加量。

表2 助劑添加量篩選正交試驗(yàn)的因素與水平

1.4 DR12 腐熟菌劑的制備及活性測(cè)定

將菌株接種到PDB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)制成菌液，在前面試驗(yàn)的基礎(chǔ)上將各配方按照篩選出的最佳條件加入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，將其置于恒溫恒濕條件下培養(yǎng)10 d。采用GB 20287—2006 農(nóng)用微生物菌劑標(biāo)準(zhǔn)[11]，測(cè)定所制備菌劑有效活菌數(shù)、纖維素酶活、含水量、pH 值等，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)采用Excel 2019 和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和顯著性差異檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源和氮源對(duì)DR12 菌株濾紙酶活力的影響

由圖1 可知，5 種碳源的濾紙酶活力在6.75～11.12 U/mL，其中，以谷子秸稈、玉米芯為碳源時(shí)，濾紙酶活性分別為11.12、9.83 U/mL，與其他處理組差異顯著。因此，谷子秸稈為最優(yōu)碳源。

由圖2 可知，5 種氮源的濾紙酶活力在12.27～20.89 U/mL，由大到小依次為硫酸銨＞硝酸鈉＞硝酸銨＞尿素＞豆粕，其中，硫酸銨、硝酸鈉為氮源時(shí)，濾紙酶活力分別為20.89、19.38 U/mL，與其他處理間差異顯著。因此，硫酸銨適合作為菌劑發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的氮源。

2.2 不同發(fā)酵條件對(duì)DR12 菌株濾紙酶活力的影響

由表3 分析可知，影響DR12 菌株分泌濾紙酶發(fā)酵水平主次因素依次為：溫度＞初始pH＞含水量＞N＞接種量，通過(guò)正交試驗(yàn)分析結(jié)果，可得出菌株生長(zhǎng)活性和產(chǎn)酶活性最優(yōu)組合為A1B1C1D1E3，即含水量為40%、溫度為25 ℃、初始pH 值5、接種量為1.5 mL、N 為0.8%時(shí)，最有利于濾紙酶活力的提高。

表3 不同發(fā)酵條件篩選正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 不同助劑添加量對(duì)DR12 菌株濾紙酶活力的影響

表4 助劑添加量篩選正交試驗(yàn)結(jié)果

從表4 可以看出，影響DR12 菌株產(chǎn)酶活性的主次因素依次為：中微量元素＞保水劑＞表面活性劑＞生物酶。交互作用最優(yōu)組合為A1B2C2D3，即DR12 腐熟菌劑的最佳助劑添加量為中微量元素0.5 mL/L、保水劑2%、表面活性劑1%、生物酶3 mL/L。

2.4 DR12 腐熟菌菌劑及活性

制備的DR12 腐熟菌菌劑有效活菌數(shù)含量為7.5×108cfu/g，纖維素酶含量63.39 U/g，含水率為27%，pH 值為6.4，各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論與討論

秸稈腐熟劑能夠提高秸稈的腐熟速度和腐熟度[12]，使秸稈中的養(yǎng)分充分分解，釋放為易被植物吸收利用的簡(jiǎn)單有機(jī)物，以提高秸稈利用率。王水順等[13]對(duì)黑曲霉的固體發(fā)酵條件研究表明，（NH4）2SO4對(duì)菌株的產(chǎn)酶活性有很好的促進(jìn)作用，且在最佳發(fā)酵條件下，菌株產(chǎn)纖維素酶提高。王加友等[14]利用以玉米秸稈纖維素為唯一碳源的固體分離培養(yǎng)基，獲得1 株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的真菌SY-403，對(duì)其所產(chǎn)纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，該酶最適反應(yīng)pH 值為6.0、溫度為20 ℃。本研究在最優(yōu)發(fā)酵條件下，通過(guò)對(duì)表面活性劑、中微量元素、生物酶等添料進(jìn)行了最優(yōu)條件篩選，并制得含DR12 菌株微生物的生物菌劑，測(cè)得菌劑各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，與辛銀川[15]所制備菌劑檢測(cè)指標(biāo)相近。下一步將進(jìn)行DR12 菌劑對(duì)谷子秸稈的降解效率及腐解物中腐殖質(zhì)、胡敏酸等有機(jī)質(zhì)含量的研究。