抗條銹病小偃麥附加系CH366 的FISH 鑒定

鄭 瑗，李 欣，賈舉慶，郭慧娟，雷夢(mèng)林，張樹(shù)偉，常利芳，暢志堅(jiān)，喬麟軼，陳 芳，張曉軍

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原 030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030031）

小麥條銹病是由條銹病菌引起的靠風(fēng)力傳播的毀滅性病害，具有傳播迅速、傳播范圍廣、產(chǎn)量損失大的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害了我國(guó)小麥的生產(chǎn)[1]。近年來(lái)，由于種植結(jié)構(gòu)的改變，大量矮稈的小麥品種投入生產(chǎn)，使得株間環(huán)境更適合條銹病原菌傳播，條銹病危害日益嚴(yán)重。由于條銹病小種的變異使得已有的抗條銹病基因逐漸喪失抗性，選育新的小麥抗條銹病基因資源并將其應(yīng)用于育種與生產(chǎn)是解決條銹病危害的有效途徑[2]。

中間偃麥草作為小麥的近緣物種，是小麥改良的三級(jí)基因源之一，抗寒，分蘗能力強(qiáng)，蘊(yùn)含豐富的抗病基因。目前普遍認(rèn)為，中間偃麥草的基因組型為JJJsJsSS，其中，J 基因組、JS基因組與小麥的B 基因組十分接近，因此，容易與小麥雜交，中間偃麥草應(yīng)用十分廣泛[3]。H.B.齊津[4]將小麥與中間偃麥草進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，選育出小冰麥系列新品種；孫善澄[5]利用小麥與中間偃麥草多次雜交后回交并定向選擇的方法選育出中1～中5，在抗病方面的應(yīng)用非常廣泛。CHANG 等[6]利用普通小麥與中間偃麥草雜交獲得TAI7044、TAI7045、TAI8335 等多個(gè)八倍體小麥，并繼續(xù)與小麥雜交、回交，選育出CHadd7001、CHadd7002[7]、CH13-21[8]等多抗性附加系與易位系。石丁溧等[9]選育出抗白粉病和條銹病的異附加系A(chǔ)F-2，并通過(guò)GISH 證明了有2 條染色體來(lái)源于中間偃麥草。

CH366 是山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院利用普通小麥晉太170 與小麥-中間偃麥草部分雙二倍體TAI7045 雜交，F(xiàn)1代與晉太170 再回交，回交后代經(jīng)過(guò)多次自交得到的體細(xì)胞為44 條染色體的小偃麥新品系。本研究通過(guò)細(xì)胞學(xué)方法對(duì)CH366 進(jìn)行了熒光原位雜交（FISH）鑒定，同時(shí)進(jìn)行抗病性分析，以期為小麥遺傳改良與抗病育種提供穩(wěn)定且優(yōu)良的中間材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料CH366、親本晉太170、TAI7045 和對(duì)照品種臺(tái)長(zhǎng)29、SY95-71 均由作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。CH366 是由晉太170 與TAI7045 雜交后回交得到；TAI7045 是由暢志堅(jiān)用普通小麥和中間偃麥草雜交培育的部分雙二倍體；晉太170 是由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所選育的國(guó)審優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種。

1.2 染色體制片

有絲分裂中期染色體制片參考HAN 等[10]的方法，略有改動(dòng)。取50 粒CH366 種子在4 ℃冰箱放置2 d，室溫下晾干。放在5 個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿鋪2 層濾紙潤(rùn)濕后放入10 粒種子，在室溫黑暗環(huán)境下培養(yǎng)2 d。待根尖長(zhǎng)到2 cm 左右，放入4 ℃冰箱處理24 h。在每粒種子上剪取1 cm 左右的根尖分別放到2 mL 噴濕離心管中，然后在0.9 MPa N2O 罐處理2 h。用90%醋酸固定10 min，水洗3 次，切取根尖分生區(qū)置于2%的果膠酶和纖維素酶中，37 ℃水浴60～65 min。取出后用70%乙醇洗2 次，無(wú)水乙醇洗1 次。用解剖針搗碎根尖后，4 000 r/min離心3 min。倒掉乙醇后在室溫下晾干，然后加入適量冰醋酸，攪拌均勻后用移液器吸取6.5 μL 混合液滴于載玻片上，15 min 后用顯微鏡觀察染色體中期分裂相，選取染色體完整且分散好的片子保存。

1.3 熒光原位雜交分析

選取多聚寡核苷酸探針Oligo-pTa535-1 和Oligo-pSc119.2-1[11]進(jìn)行雙色熒光原位雜交，雜交程序參照LANG 等[12]的方法，并參照TANG 等[11]的方法對(duì)分散的染色體進(jìn)行命名。用Leica DM2 熒光顯微鏡進(jìn)行鏡檢，DFC500 CCD 拍照。選擇分裂相明顯且清晰的細(xì)胞進(jìn)行核型分析，以獲得可靠的證據(jù)。

1.4 抗病性鑒定

2019—2020 年度分別在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園和山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽(yáng)試驗(yàn)示范基地種植親本晉太170、TAI7045 和CH366。在四川成都基地人工接種條銹菌最新流行小種條中32、條中33、條中34 混合小種，感病對(duì)照選擇臺(tái)長(zhǎng)29，誘發(fā)品種為川育12，進(jìn)行條銹病抗性鑒定。在東陽(yáng)基地人工接種白粉菌株E09，感病對(duì)照是SY95-71，誘發(fā)品種為SY95-71，進(jìn)行白粉病抗性鑒定。測(cè)試材料對(duì)條銹病和白粉病的抗性均按照6 級(jí)反應(yīng)型進(jìn)行記載[13-14]，分別為0（免疫）、0；（近免疫）、1（高抗）、2（中抗）、3（中感）、4（高感）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CH366 的染色體數(shù)目鑒定

取50 粒CH366 的種子發(fā)芽并取其根尖進(jìn)行有絲分裂中期染色體制片，選取細(xì)胞完整且染色體分散好的片子進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)。由圖1、2 可知，50 粒種子的染色體數(shù)目均為44 條，比普通小麥的42 條染色體多2 條，表明CH366 中可能含有2 條不屬于普通小麥的染色體。

2.2 CH366 的FISH 鑒定

以分別標(biāo)記了紅色和綠色熒光標(biāo)記的Oligo-pTa535-1 和Oligo-pSc119.2-1 探針對(duì)CH366進(jìn)行熒光原位雜交（FISH），并對(duì)其染色體進(jìn)行分組與核型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CH366 中有42 條染色體與小麥親本晉太170[15]染色體結(jié)構(gòu)、熒光信號(hào)基本一致，另2 條染色體在長(zhǎng)臂末端和短臂上接近著絲粒的位置含有較強(qiáng)的紅色雜交信號(hào)，與普通小麥的染色體具有明顯區(qū)別。且這2 條染色體形態(tài)與雜交信號(hào)完全一致，這表明CH366 中含有1 對(duì)來(lái)源于TAI7045 或中間偃麥草的染色體，CH366 可能是一個(gè)小麥-中間偃麥草異附加系。

2.3 CH366 的抗病性鑒定

在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽(yáng)試驗(yàn)示范基地進(jìn)行CH366 成株期白粉病鑒定。結(jié)果顯示，TAI7045 對(duì)白粉病的反應(yīng)型為0 級(jí)，表現(xiàn)為免疫；CH366 和晉太170 的反應(yīng)型均為4 級(jí)，表現(xiàn)為高感白粉??；說(shuō)明CH366 中可能不含有抗白粉病基因。在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園進(jìn)行CH366 成株期條銹病鑒定。結(jié)果顯示，晉太170 對(duì)條銹病的反應(yīng)型為4 級(jí)，表現(xiàn)為高感條銹病。CH366 的反應(yīng)型為0；級(jí)，表現(xiàn)為近免疫；TAI7045 的反應(yīng)型為0 級(jí)，表現(xiàn)為免疫；CH366 與TAI7045 的條銹病抗性基本一致，表明CH366 中的抗條銹病基因可能來(lái)源于其所含有的1 對(duì)外源染色體，即來(lái)源于TAI7045 或中間偃麥草。

3 結(jié)論與討論

小麥的遠(yuǎn)緣雜交可以將外源染色體導(dǎo)入小麥中，豐富小麥的遺傳背景，創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，為發(fā)展小麥產(chǎn)業(yè)做出貢獻(xiàn)。檢驗(yàn)是否有外源染色體最直觀、快速的方法就是原位雜交技術(shù)。建立FISH 核型圖可以一目了然地觀察到外源染色體形態(tài)與數(shù)目。最初，TSITSIN[16]通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)造出小麥-中間偃麥草部分雙二倍體，之后有大批附加系、代換系如雨后春筍般涌現(xiàn)。韓方普等[17]利用原位雜交對(duì)小偃麥異附加系TAI-14 進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)變異的染色體來(lái)自于中間偃麥草，且附加系會(huì)再次發(fā)生變異，產(chǎn)生了雙端體異附加系TAI-14t。杜萬(wàn)里[18]對(duì)一系列小麥-華山新麥草衍生后代進(jìn)行原位雜交，篩選出全套二體附加系。本試驗(yàn)對(duì)小麥-中間偃麥草后代CH366 進(jìn)行了FISH 鑒定和核型分析，證實(shí)CH366 是一個(gè)二體異附加系，包含小麥全套基因組，并添加了2 條外源染色體。添加的2 條外源染色體具體類(lèi)型需要使用分子標(biāo)記鑒定和其他技術(shù)手段來(lái)確定。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)中間偃麥草與小麥雜交選育出多個(gè)對(duì)小麥抗病、抗寒等性狀具有改良作用的基因資源。GAUDERON[19]育成的小麥-中間偃麥草雙二倍體TAF46，對(duì)小麥凍害與春季低溫具有極強(qiáng)的抗性；孫善澄等選育的中4 和中5[5]含有黃矮病的抗性；LIU 等[20]利用普通小麥煙農(nóng)15 與中間偃麥草育成的部分雙二倍體E990256，高抗白粉病。部分雙二倍體由于含有較多的外源染色體，農(nóng)藝性狀普遍較差，難以在育種或生產(chǎn)上直接應(yīng)用。附加系作為外源基因向小麥轉(zhuǎn)移的中間材料，僅含有1 對(duì)外源染色體，減少了外源染色體對(duì)小麥基因組的影響，更易于與小麥雜交，因此，附加系的選育對(duì)創(chuàng)制新的小麥種質(zhì)資源、擴(kuò)展小麥遺傳基礎(chǔ)具有重要意義。本試驗(yàn)選育并鑒定的異附加系CH366 對(duì)條銹病表現(xiàn)為近免疫，其小麥親本晉太170 高感條銹病，因此，推測(cè)其條銹病抗性來(lái)自其所含有的外源染色體，即其抗條銹病基因來(lái)自中間偃麥草。但CH366 作為一個(gè)二體異附加系，仍含有較多的外源染色體，易受外源物種不良基因的影響，不利于在小麥育種中應(yīng)用，因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中，需要利用其與普通小麥再次雜交，利用ph1b 基因誘導(dǎo)或輻射技術(shù)，依次創(chuàng)造出代換系和含有不良外源基因較少的小片段易位系。