浙江省溫嶺地區(qū)帕金森病患者DJ-1 基因g.168_185del 的多態(tài)性研究

李紅娟，郭潔潔，王琳琳

帕金森?。≒D）是一種常發(fā)生于老年人的錐體外系疾病[1]，大部分為散發(fā)，5%～10%為早發(fā)型[2]，隨年齡的增長，其發(fā)病率和患病率也相應(yīng)增加。近年來基因成為PD 致病原因的研究熱點，且研究表明不同基因所致PD 患者的表現(xiàn)具有異質(zhì)性[3]。DJ-1 基因即PARK7，有剪切位點突變、截短突變和大片段缺失等10 余種不同的突變[4]。本研究探討浙江省溫嶺地區(qū)DJ-1 基因位點g.168_185del的多態(tài)性與PD 發(fā)病的關(guān)系，報道如下

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016 年11 月至2018 年12 月就診于浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及康復(fù)科的原發(fā)性PD 患者109 例（PD 組），其中男60 例，女49 例；年齡31 ～85 歲，平均（64.4±11.8）歲。另選同期來本院體檢中心無PD的健康者105 例（對照組），其中男56例，女49 例；年齡33 ～87 歲，平均（65.6±12.4）歲。兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）。

1.2 診斷及排除標準 以英國Brain-Bank 診斷標準進行篩查[5]，有條件者可做顱腦CT 或MRI 檢查。排除標準：其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、繼發(fā)性PD、帕金森疊加綜合征及甲狀腺功能亢進等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取 抽取受試者靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，使用北京天根中量血提取試劑盒提取DNA。檢測DNA 純度均在1.7 ～1.9，濃度均≥15 ng/ l。抽血前應(yīng)根據(jù)知情自愿的原則簽署同意書。

1.3.2 引物設(shè)計與合成 運用primer3設(shè)計聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增引物，擴增片段長度為277 bp。擴增的上下游引物詳見文獻[6]。

1.3.3 PCR 擴增 PCR 反應(yīng)條件為：在Biometr熱循環(huán)儀上95℃先預(yù)變性5min，再95 ℃變性40 s，再58 ℃退火30 s，后72 ℃變性30 s，再72 ℃10 min，使其得到充分的延伸。PCR 總反應(yīng)體積為20 l。

1.3.4 PCR擴增產(chǎn)物基因型鑒定 鑒定所擴增259 ～277 bp 部分，該片段如出現(xiàn)TGTGCTGGACGGTGTCCC 18 個堿基序列，判定為g.168_185del 多態(tài)位點的插入/插入型，見封三彩圖2；該片段18個堿基中1 至多個被其他堿基替換，判定為插入/缺失型，見封三彩圖3；如在259 bp18 個堿基完全消失，判定為缺失/缺失型，本研究未見到此種基因型。等位基因頻率的計算公式為2n1+n2/2N（n1 為純合型等位基因數(shù)，n2 為雜合型等位基因數(shù)，N 為總個體數(shù)）。

1.4 統(tǒng)計方法 使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料比較采用2檢驗；采用遺傳平衡檢驗基因型資料。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 平衡定律吻合度檢驗 病例組與對照組進行缺失/插入型、插入/插入型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），兩組基因型分布吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg 平衡定律。

2.2 g.168_185del等位基因頻率分布比較 兩組多態(tài)性位點g.168_185del等位基因頻率、基因型頻率分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），見表1。PD 組與對照組g.168_185del多態(tài)性在≤50 歲和＞50 歲間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2；g.168_185del多態(tài)性在男性和女性間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），見表3。

3 討論

據(jù)最新流行病學(xué)統(tǒng)計，我國65 歲以上人群中PD 發(fā)病率與西方發(fā)達國家相似，約為1.7%[2]，且發(fā)病率隨著年齡的增加而增加，但目前對于PD 的確切發(fā)病機制尚不明確。

DJ-1 定位于1p36，全長約24 kb，為常染色體隱性遺傳致病基因。Eerola 等[7]研究表明病例組和對照組在等位基因頻率及基因型頻率上均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。郭紀鋒等[8]研究發(fā)現(xiàn)在我國PD 患者中DJ-1 基因突變的突變率非常罕見。柳四新等[9]對早發(fā)組與晚發(fā)組的研究未發(fā)現(xiàn)DJ-1 基因差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究顯示PD組與對照組間DJ-1 基因g.168_185del的基因型頻率及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮 g.168_185del多態(tài)性與浙江沿海溫嶺地區(qū)PD 無明顯相關(guān)性。缺失型等位基因頻率在PD組為6.4%，PD組等位基因缺失型在早發(fā)性大于在對照組的頻率，分別為5.8%和4.2%。本研究顯示PD 組與對照組g.168_185del 多態(tài)性在年齡、性別間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這表明其多態(tài)性與年齡、性別關(guān)系不大。

表1 兩組g.168_185del 等位基因頻率和基因型頻率分布 例（%）

表2 兩組不同年齡間g.168_185del 多態(tài)位點基因型頻率和等位基因頻率比較 例（%）

表3 兩組不同性別間g.168_185del 多態(tài)位點基因型頻率和等位基因頻率比較 例（%）

除Hedrick 等[10]報道的DJ-1 基因l～5 號外顯子的純合缺失突變，以及5～7 號的雜合缺失突變外，DJ-1 基因外顯子的重排突變很少有報道。Hedrick等通過對100 例早發(fā)型PD患者的研究，發(fā)現(xiàn)只有2 例有DJ-1 的改變，而17 例患者有Parkin 的突變。蔡苗等[11]研究表明EOPD 組與對照組、家族性及散發(fā)性EOPD組與對照組間，g.168_185del多態(tài)的基因型頻率和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究示缺失/插入型突變較缺失/缺失型較多相比，前者相對稍多，后者罕見，而DJ-1 基因g.168_185del在早發(fā)PD 中的確切致病作用還有待進一步闡明。由于樣本量以及抽樣誤差等原因，有待擴大樣本量進一步研究驗證。