基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測痛瀉要方治療炎癥性腸病的作用機(jī)制

索光喜，胡倘瀟，肖天保

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，貴陽 550000）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）為累及回腸、直腸、結(jié)腸的一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。╟rohn disease，CD）〔1〕，兩者主要癥狀均為腹痛、腹瀉，或有便血，目前發(fā)病原因及機(jī)制尚不明確。西醫(yī)藥物治療主要以控制腸道炎癥為目的，雖然療效肯定，但需要長期維持治療，且容易反復(fù)發(fā)作。炎癥性腸病屬于中醫(yī)“泄瀉”范疇，中醫(yī)經(jīng)典方劑“痛瀉要方”已廣泛用于治療炎癥性腸病，諸多臨床研究顯示其療效顯著〔2〕，有實(shí)驗(yàn)研究顯示痛瀉要方可能是通過提高腸道組織的抗氧化能力、調(diào)節(jié)免疫功能以及調(diào)節(jié)腸道血流、促進(jìn)潰瘍愈合等發(fā)揮作用〔3-5〕。但受制于實(shí)驗(yàn)條件限制，目前針對中藥治療機(jī)制的研究多處于觀察層面，在現(xiàn)有研究中，各方面機(jī)制研究較為單一，缺乏整體性認(rèn)識。隨著現(xiàn)代生物化學(xué)對中藥成分及作用靶點(diǎn)研究的不斷完善，根據(jù)相關(guān)作用靶點(diǎn)來系統(tǒng)預(yù)測其作用機(jī)制成為可能。因此，基于現(xiàn)有的大量研究數(shù)據(jù)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理技術(shù)預(yù)測痛瀉要方治療炎癥性腸病的作用機(jī)制，為臨床試驗(yàn)及新藥研發(fā)提供參考。

1 方法及結(jié)果

1.1 痛瀉要方中相關(guān)成分的查詢及篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）檢索痛瀉要方中四味中藥（陳皮、白芍、白術(shù)、防風(fēng)）的化學(xué)成分，以通用參考指標(biāo)口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，篩選各味中藥的有效化學(xué)成分，并查詢對應(yīng)的靶點(diǎn)信息。建立藥物成分及作用靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫。剔除重復(fù)成分及靶點(diǎn)，共篩選出有效藥物成分39 個，其中32 個成分有明確的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，共涉及125個靶點(diǎn)。見表1。

表1 痛瀉要方中藥物化學(xué)成分及靶點(diǎn)情況

1.2 炎癥性腸病相關(guān)靶點(diǎn)的收集在GeneCards（www.genecards.org）及OMIM（omim.org）數(shù)據(jù)庫以“inflammatory bowel disease”為搜索詞搜索與炎癥性腸病相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，建立疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。合并后剔除重復(fù)靶點(diǎn)，共有5 852 個疾病靶點(diǎn)。

1.3 篩選共有靶點(diǎn)利用R 語言，篩選出藥物靶點(diǎn)（125 個）與疾病靶點(diǎn)（5 852 個）的共有靶點(diǎn)（104個），并保存相關(guān)共有靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.4 藥物成分治療網(wǎng)絡(luò)可視化利用R 語言過濾出與共有靶點(diǎn)相關(guān)的藥物成分，并建立“藥物成分-疾病靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫，將數(shù)據(jù)庫文件導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，探究“藥物成分-疾病靶點(diǎn)”之間的相關(guān)性。見圖1。痛瀉要方中有31 個化學(xué)成分可通過作用于炎癥性腸病的104個靶點(diǎn)而發(fā)揮治療作用。

圖1 “藥物成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

1.5 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），篩選核心靶點(diǎn)將“藥物成分-疾病靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫文件中的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING（string-db.org）網(wǎng)站，構(gòu)建PPI，根據(jù)靶點(diǎn)蛋白之間相互作用的度值大小篩選出核心靶點(diǎn)。見圖2。

圖2 “藥物成分-疾病靶點(diǎn)”PPI與連接節(jié)點(diǎn)條形圖

圖2 中蛋白靶點(diǎn)的連接節(jié)點(diǎn)數(shù)越多，表示其在生物過程中發(fā)揮的作用越大，根據(jù)結(jié)果顯示，“藥物成分-疾病靶點(diǎn)”核心蛋白按度值由高至低依次 為：IL6、AKT1、MAPK3、JUN、CASP3、MAPK1、PTGS2、MAPK8、ESR1、HSP90AA1、CAT、CCND1、MMP9、PPARG、MAPK14、CREB1、RELA、AR、CCL2、HMOX1、AHR。由此推斷，痛瀉要方中的化學(xué)成分，可能主要通過影響以上蛋白的表達(dá)來干預(yù)炎癥性腸病的治療。

1.6 GO 功能分析所謂GO 功能分析是對所有已知基因進(jìn)行功能分類，通過R 語言，利用bioconductor 上dose 程序?qū)?04 個“藥物-疾病”共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能分析。見表2。痛瀉要方作用于炎癥性腸病靶點(diǎn)的基因功能主要集中在氨基結(jié)合（amide binding：13 個基因）、核受體活性（nuclear receptor activity：11個基因）、轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity：11 個基因）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding：11 個基因）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity：10 個基因）等生物表達(dá)功能上。

1.7 KEGG 通路富集分析KEGG 通路是目前人類已知的存在于生物體內(nèi)的生物信號通路過程，將篩選到的“藥物-疾病”共有靶點(diǎn)富集在目前已知的信號通路上，可以進(jìn)一步了解相關(guān)藥物成分對生物信號通路的影響。通過R 語言，利用bioconductor 上clusterprofile 程序?qū)ⅰ八幬?疾病”共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集，得到20 條通路富集結(jié)果，結(jié)果顯示，前10 條KEGG 通路主要涉及腫瘤壞死因子信號通路、IL-17（白細(xì)胞介素-17）信號通路、Toll樣受體信號通路等。見表3。

表2 “藥物-疾病”共同靶點(diǎn)GO功能分析結(jié)果

表3 “藥物-疾病”共同靶點(diǎn)KEGG通路富集結(jié)果

2 討論

目前炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制仍不明確，西藥治療主要以控制腸道炎癥為主，主要包括氨基水楊酸類、激素類和免疫抑制劑3 大類〔6〕。雖然療效確切，但需要長期用藥，且產(chǎn)生的副作用較大。中藥痛瀉要方出自《丹溪心法》，常用于治療脾虛肝旺所致的腸鳴腹痛、大便泄瀉，療效確切。大量現(xiàn)代研究表明，痛瀉要方可以減輕腸道黏膜的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腸道黏膜潰瘍的愈合〔7〕。但中醫(yī)藥作用機(jī)制復(fù)雜，目前針對痛瀉要方治療炎癥性腸病的機(jī)制研究多具有一定的片面性，故結(jié)合目前最前沿的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果，從整體角度探討其作用機(jī)制，具有積極意義。

根據(jù)本研究結(jié)果分析推測：痛瀉要方4 味中藥中共有31種治療炎癥性腸病的主要活性成分，目前研究表明白芍中的β-谷甾醇能顯著抑制結(jié)腸縮短，降低結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，顯著降低炎癥因子IL-1（白細(xì)胞介素-1）、IL-6（白細(xì)胞介素-6）、MCP-1（單核細(xì)胞趨化蛋白-1）和相關(guān)COX-2（環(huán)氧合酶-2）的水平〔8〕。芍藥苷可以抑制腸系膜和結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞的浸潤，抑制結(jié)腸巨噬細(xì)胞中NLRP3蛋白并抑制細(xì)胞因子IL-1β 的釋放〔9〕。陳皮中的柚皮素能阻斷NF-κB 信號通路，減少腸道中產(chǎn)生的氧自由基，修復(fù)損傷的組織〔10〕。

在UC 結(jié)腸細(xì)胞水平研究上，痛瀉要方中相關(guān)成分通過影響IL6、AKT1、MAPK3、JUN、CASP3、MAPK1、PTGS2、MAPK8、ESR1、HSP90AA1、CAT、CCND1、MMP9、PPARG、MAPK14、CREB1、RELA、AR、CCL2、HMOX1、AHR 的表達(dá)來治療炎癥性腸病，相關(guān)研究表明IL-6的表達(dá)可引起機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)〔11-12〕。AKT 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，激活NF-κB 等核轉(zhuǎn)錄因子，促使產(chǎn)生大量的促炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)或持續(xù)炎癥，另一方面刺激細(xì)胞持續(xù)生長，抑制細(xì)胞凋亡，增加癌變機(jī)會〔13〕。MAPK 蛋白及mRNA 在UC中表達(dá)均有顯著升高（P＜0.01），提示炎癥因子大量產(chǎn)生，從而形成腸道炎癥表現(xiàn)〔14〕。重癥UC 患者血清NLRP3、CASP1 和NF-κB mRNA 表達(dá)水平均顯著升高，且NLRP3 mRNA 與CASP1、NF-κB mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)〔15〕。

GO 功能分析結(jié)果顯示，痛瀉要方中治療炎癥性腸病的104個靶點(diǎn)基因的富集生物學(xué)功能主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表達(dá)以及藥物反應(yīng)等過程，反映出痛瀉要方作用于細(xì)胞的生物過程也是多樣化的。KEGG 通路富集分析表明，痛瀉要方治療炎癥性腸病的靶點(diǎn)通路主要涉及腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路，Toll樣受體等途徑。眾多研究表明TNF-α（腫瘤壞死因子-α）是重要的炎癥啟動因子，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，通過表達(dá)凝血因子、成纖維增殖因子和黏附因子以及啟動細(xì)胞急性反應(yīng)、凋亡等過程發(fā)揮作用〔16〕。而IL-17則可能是通過促進(jìn)白細(xì)胞釋放過量的化學(xué)因子引起組織炎癥的發(fā)生，最終強(qiáng)化了腸道內(nèi)的炎性反應(yīng)而導(dǎo)致炎癥性腸病的形成〔17〕。Toll 樣受體（TLRs）∕NF-κB 信號傳導(dǎo)通路參與了UC 發(fā)病機(jī)制，在調(diào)節(jié)涉及黏膜炎癥反應(yīng)中起核心作用〔18〕?，F(xiàn)代研究認(rèn)為p53信號通路多與癌變相關(guān)，提示痛瀉要方可能通過影響p53 信號通路抑制UC 癌變。此外KEGG 結(jié)果顯示痛瀉要方還可以通過影響乙肝感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE受體信號通路、丙肝感染等通路治療炎癥性腸病，這些信號通路在炎癥性腸病的臨床研究中少被提及，或許可以成為新的研究方向。

綜上，在相關(guān)文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，可推測痛瀉要方是通過調(diào)節(jié)炎癥通路及干預(yù)炎癥的發(fā)展過程來發(fā)揮抗炎癥性腸病的作用。本研究為探索痛瀉要方的作用機(jī)制提供了新的方法和思路，也為下一步實(shí)驗(yàn)研究以及有效藥物成分的開發(fā)提供一些參考。