參松養(yǎng)心膠囊對(duì)4種CYP450亞型酶活性的影響

繆志敏，賴 泳

（大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000）

治療心律失常的西藥具有起效快、療效確切的特點(diǎn)，但副作用大，而抗心律失常中藥具有療效確切、價(jià)格便宜、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)〔1〕，越來(lái)越受到患者和臨床醫(yī)生的青睞。參松養(yǎng)心膠囊是北京以嶺藥業(yè)集團(tuán)根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病理論研制的一種新型治療心律失常的中藥制劑。臨床常見(jiàn)參松養(yǎng)心膠囊聯(lián)用美托洛爾〔2〕、辛伐他汀〔3〕、曲美他嗪〔4〕治療心律失常；聯(lián)用胺碘酮〔5〕、華法林〔6〕治療心力衰竭伴室性心律失常、陣發(fā)性房顫；聯(lián)用比索洛爾治療室性早搏〔7〕；聯(lián)用瑞替普酶治療急性ST 段抬高型心肌梗死〔8〕等，都取得了很好的治療效果。

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450），是一種以鐵原卟啉為輔基的B 族細(xì)胞色素，因其還原態(tài)與一氧化碳（CO）作用后，它們形成的復(fù)合物在450 nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生特異吸收峰而命名〔9〕。CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6 和CYP3A4 這4 種CYP450 亞型酶參與臨床85% 以上的藥物代謝〔10〕?！癈ocktail”探針?biāo)幬锓ㄊ浅Ｓ玫腃YP450 亞型酶活性研究方法，能快速有效地評(píng)價(jià)藥物之間是否存在相互作用。參松養(yǎng)心膠囊成分復(fù)雜，未見(jiàn)臨床報(bào)道其對(duì)CYP450酶的影響。本實(shí)驗(yàn)采用“Cocktail”探針?biāo)幬锓?，選取咪達(dá)唑侖、美托洛爾、奧美拉唑、咖啡因4 種探針?biāo)幬?，考察參松養(yǎng)心膠囊對(duì)大鼠體內(nèi)CYP3A1、CYP2D1、CYP2C11、CYP1A2 4 種CYP450 亞型酶活性的影響，預(yù)測(cè)其存在藥物相互作用的可能性，為參松養(yǎng)心膠囊的臨床合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器Agilent 1260 HPLC 工作系統(tǒng)（美國(guó)Agilent 公司）；色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）（美國(guó)Agilent 公司）；TARGIN VX-III多管渦旋振蕩器（中國(guó)北京踏錦科技有限公司）；XW-80A旋渦混合器（中國(guó)其林貝爾科技有限公司）；Milli-Q 超純水機(jī)（Millipore，USA）；PremiumC340 超低溫冰箱（New Brunswick Scientific）；BCD-539WT冰箱（中國(guó)海爾集團(tuán)）；EL-304電子分析天平（Mettler Toledo）；3-15臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma）。

1.2 主要試劑及藥品參松養(yǎng)心膠囊（北京以嶺藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1703008-1703010）；氯化鈉注射液（浙江國(guó)境藥業(yè)有限公司，批號(hào)：A171019F1）；肝素鈉注射液（江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：51608109）；異氟烷（上?？圃粗扑幑煞萦邢薰荆?hào)：160601）；磷酸氫二銨（阿拉丁，批號(hào)：J1619003）；氯化鈣（西隴化工股份有限公司，批號(hào)：150121）；氯化鉀（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：016022401）；TRIS（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：1217S0713）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：113I0227）。

1.3 動(dòng)物雄性SD 大鼠24 只，體質(zhì)量（200±20）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。

2 方法

2.1 溶液的配制“Cocktail”探針?biāo)幬锶芤号渲品椒ǎ簻?zhǔn)確稱取咖啡因20 mg、奧美拉唑20 mg、美托洛爾40 mg溶于6 mL 0.9%氯化鈉溶液中，同時(shí)加入咪達(dá)唑侖注射液5 mL（相當(dāng)于10 mg），即配制成“Cocktail”探針?biāo)幬锶芤骸⑺绅B(yǎng)心膠囊溶液配制方法：根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》〔11〕臨床常用劑量并通過(guò)不同種動(dòng)物劑量換算公式計(jì)算，最終確定大鼠高、中、低給藥劑量分別是756、378、189 mg∕kg。分別精密稱取參松養(yǎng)心膠囊7.560、3.780、1.890 g，用雙蒸水定容到50 mL，超聲溶解30 min。含地西泮內(nèi)標(biāo)（internal standard，IS）終止反應(yīng)液配制方法：精密吸取2 mL 地西泮注射液（5 mg∕mL）用超純水定容在5 mL 棕色容量瓶中，混合均勻配制成濃度為2 mg∕mL 的地西泮標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱中保存。精密吸取一定量的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用超純水溶液稀釋成濃度為100 μg∕mL 的內(nèi)標(biāo)工作液，4 ℃冰箱中保存。

2.2 動(dòng)物分組及給藥方法將24 只SD 雄性大鼠隨機(jī)分為參松養(yǎng)心膠囊高、中、低劑量組和空白組4個(gè)組，每組6 只。參松養(yǎng)心膠囊高、中、低劑量組給藥劑量分別為756、378、189 mg∕（kg·d），每天給藥一次，連續(xù)給藥15 d，給藥期間對(duì)大鼠進(jìn)行正常喂養(yǎng)；空白組大鼠正常喂養(yǎng)。第16天，各組大鼠分別按照5 mL∕kg劑量給予腹腔注射“Cocktail”探針?biāo)幬锶芤骸?/p>

2.3 血漿樣品采集和處理方法在給藥前和給藥后5、10、20、40 min 及1.0、1.5、2.0、5.0、8.0、12.0、24.0 h尾靜脈真空采血管取血300 μL至肝素鈉處理過(guò)的1.5 mL 的EP 管中，以3 000 r∕min 離心10 min，吸取上層血漿100 μL 于新的1.5 mL EP 管中，加入10 μL 地西泮溶液（100 μg∕mL），渦旋混勻30 s，加入400 μL 乙腈，渦旋振蕩5 min，離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm的濾膜，20 μL進(jìn)樣分析。

2.4 色譜條件Agilent 1260 HPLC工作系統(tǒng)；色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.5 mL∕min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析利用DAS 3.0軟件采用非房室模型法計(jì)算各探針?biāo)幬锏乃幋鷦?dòng)力學(xué)參數(shù)，包括AUC（0-24）、MRT（0-24）、t1∕2、CL。

2.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析方法，Dunnett′st檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HPLC 方法學(xué)驗(yàn)證在“2.4”色譜條件下，血漿中咖啡因、奧美拉唑、美托洛爾、咪達(dá)唑侖和內(nèi)標(biāo)地西泮峰形較好，分離完全，無(wú)雜峰干擾，其保留時(shí)間分別是8.10、10.20、13.20、14.50 和19.52 min，色譜圖見(jiàn)圖1。分別以各探針?lè)迕娣e與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，探針底物濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程?？Х纫颍簓=0.419 9x-0.247 2，r=0.991 9；美托洛爾：y=0.835 9x-0.051 0，r=0.992 2；奧美拉唑：y=0.221 5x-0.031 2，r=0.995 6；咪達(dá)唑侖：y=0.451 2x+0.727 9，r=0.992 8。各探針的標(biāo)準(zhǔn)曲線最小濃度其精密度和準(zhǔn)確度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%（n=3），符合生物樣品中藥物分析要求，可作為分析方法的定量下限（low limit of quantification，LLOQ）。

3.2 4 種探針?biāo)幬镅帩舛?時(shí)間曲線測(cè)定結(jié)果參松養(yǎng)心膠囊高、中、低劑量組和空白組大鼠分別腹腔注射探針?biāo)幬?，按?.4”項(xiàng)下處理，測(cè)得4 種探針?biāo)幬锏难帩舛?，結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.3 4種探針?biāo)幬锼幋鷦?dòng)力學(xué)參數(shù)分析結(jié)果咖啡因、奧美拉唑、美托洛爾、咪達(dá)唑侖的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，與空白組比較，參松養(yǎng)心膠囊3個(gè)劑量組咖啡因的AUC（0-24）均增大，高劑量組的AUC（0-24）明顯增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MRT（0-24）均增大，t1∕2均有延長(zhǎng)，CL均有降低，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；參松養(yǎng)心膠囊3個(gè)劑量組奧美拉唑的AUC（0-24）顯著增大，MRT（0-24）均增大，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），t1∕2均有延長(zhǎng)，低劑量組的CL升高，中、高劑量組的CL降低，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；參松養(yǎng)心膠囊3個(gè)劑量組美托洛爾的MRT（0-24）均增大（P＜0.05），咪達(dá)唑侖的AUC（0-24）明顯增大（P＜0.05），低、高劑量組的MRT（0-24）明顯增大（P＜0.05），其他藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各分析物及內(nèi)標(biāo)的HPLC圖

圖2 4種探針?biāo)幬锲骄帩舛?時(shí)間曲線圖

表2 不同劑量參松養(yǎng)心膠囊對(duì)大鼠體內(nèi)4種探針?biāo)幬锏乃幋鷦?dòng)力學(xué)參數(shù)的影響（xˉ± s，n=6）

4 討論

20世紀(jì)90年代初，Breimer和Schellens〔12〕就提出了“Cocktail”探針?biāo)幬锓??！癈ocktail”探針?biāo)幬锓ㄊ侵敢环N為獲取多個(gè)代謝酶的表型信息，首先同時(shí)給予多種相對(duì)低劑量的探針?biāo)幬?，然后測(cè)定生物樣本中各個(gè)探針?biāo)幬锏拇x率或者其他代謝分型指標(biāo)的方法〔13-14〕。已有研究報(bào)道，大鼠體內(nèi)主要參與代謝的亞型酶為CYP1A2、CYP2C、CYP3A、CYP2E1〔15〕，并且在雄性大鼠體內(nèi)CYP3A 的活性是雌性大鼠的5～10 倍，與人類相似，因此雄性大鼠常用來(lái)研究預(yù)測(cè)藥物對(duì)CYPs酶活性是否產(chǎn)生相互影響。

結(jié)果顯示，與空白組相比，咖啡因組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)無(wú)明顯變化，表明參松養(yǎng)心膠囊對(duì)CYP1A2（相當(dāng)于人源CYP1A2 酶）活性沒(méi)有明顯作用。3 個(gè)濃度的參松養(yǎng)心膠囊使奧美拉唑、美托洛爾、咪達(dá)唑侖的代謝減慢，表明參松養(yǎng)心膠囊對(duì)CYP2C11（相當(dāng)于人源CYP2C19 酶）、CYP2D1（相當(dāng)于人源CYP2D6 酶）、CYP3A1（相當(dāng)于人源CYP3A4 酶）活性可能存在抑制作用。參松養(yǎng)心膠囊對(duì)大鼠體內(nèi)美托洛爾的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)t1∕2的影響中，低劑量組的t1∕2明顯高于其他劑量組，結(jié)合其他藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，分析存在以下兩個(gè)原因：①在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，先給予大鼠參松養(yǎng)心膠囊預(yù)處理15 d 后，藥物在體內(nèi)經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝、排泄的過(guò)程，再給予混合探針?biāo)幬锟疾焖鼈兊拇x變化容易受到個(gè)體生理差異的影響；②待測(cè)中成藥成分復(fù)雜，每一味藥之間可能存在相互作用，對(duì)大鼠體內(nèi)CYP2D1 酶活性的影響是原型藥物的多種組分起作用還是其代謝產(chǎn)物起作用，還尚不清楚。因此參松養(yǎng)心膠囊是否在臨床應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生抑制作用需再進(jìn)行人肝微粒體或與人體合并用藥進(jìn)一步驗(yàn)證。

研究表明，人CYP2D6酶參與抗心律失常藥（胺碘酮、利多卡因等）、鎮(zhèn)痛藥（曲馬多、美沙酮、嗎啡等）、抗精神病藥（利培酮、奮乃靜等）、抗癌藥（他莫昔芬等）、抗抑郁藥（去甲基西酞普蘭等）的代謝〔16〕。CYP2C19 酶會(huì)代謝質(zhì)子泵抑制劑、三環(huán)抗抑郁藥、SSRI、SNRI、巴 比 妥 酸 鹽 和 抗 血 小 板 藥 物〔17〕。CYP3A4 酶參與心血管疾病臨床用藥的代謝更為廣泛，包括抗心律失常藥（利多卡因、普羅帕酮、普魯卡因胺等）、抗動(dòng)脈粥樣硬化藥（吉非貝齊、氟伐他汀、辛伐他?。⑩}拮抗劑（維拉帕米、硝苯地平、氨氯地平等）〔18〕。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，在參松養(yǎng)心膠囊與以上相應(yīng)酶底物合用時(shí)，應(yīng)及時(shí)關(guān)注可能存在的藥物相互作用，并進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，以盡可能地減少由藥物相互作用引發(fā)的不良反應(yīng)。