天然產(chǎn)物抑制黃曲霉生長(zhǎng)及其產(chǎn)毒的研究進(jìn)展

李 倩，趙 穎，朱曉嫚，謝巖黎

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，糧油食品安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001

黃曲霉(AF)屬于真菌界子囊菌門(mén)盤(pán)菌亞門(mén)發(fā)菌科曲霉菌屬[1],易污染儲(chǔ)藏農(nóng)作物及加工食品。受污染的農(nóng)作物較為廣泛，如糧食作物(玉米、水稻、小麥等)和油料作物(花生、大豆、棉籽等)等[2-3]。多數(shù)黃曲霉代謝產(chǎn)生聚酮類產(chǎn)物——真菌毒素(AFT)，在目前已知的20余種黃曲霉毒素中，按照毒性從強(qiáng)到弱依次為AFB1、AFM1、AFG1、AFB2、AFM2、AFG2，AFB1毒性最強(qiáng)，約為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍、標(biāo)準(zhǔn)致癌物二甲基亞硝胺的75倍、三聚氰胺的416倍[4-5]。除此之外，黃曲霉還會(huì)引起人和動(dòng)物的曲霉病，如霉菌性角膜炎[6]；降低人體免疫力，誘發(fā)原發(fā)性胃癌、肺癌[7-8]；還能以肝臟為靶器官，與慢性肝炎病毒協(xié)同致癌[9]。鑒于黃曲霉及其毒素的巨大危害，如何抑制黃曲霉的生長(zhǎng)和毒素的合成有著重要的研究意義。

近年來(lái)，許多天然產(chǎn)物安全、環(huán)保、來(lái)源廣泛，展現(xiàn)了良好的抑菌效果，其抑菌活性被廣泛研究。如綠葉揮發(fā)物(GLVs)抑制儲(chǔ)藏玉米中黃曲霉孢子的萌發(fā)[10]、香菇纖維素衍生物GPX抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生[11]、肉桂精油抑制蓮子中黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)及毒素的產(chǎn)生[12]。部分天然產(chǎn)物的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MFC)如表1所示。作者根據(jù)化學(xué)式結(jié)構(gòu)，將天然產(chǎn)物分為醛類、黃酮類、烯類、醇類、多酚類、醌類、肽類和其他類化合物，重點(diǎn)闡述不同類別的天然產(chǎn)物對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)及毒素合成的抑制機(jī)理。

1 醛類化合物

醛類是廣泛存在于植物精油中的揮發(fā)性小分子化合物，對(duì)檸檬醛和肉桂醛的研究較多。關(guān)于植物精油中醛類的抑菌機(jī)理，近年來(lái)的報(bào)道均證明是多途徑復(fù)合作用的結(jié)果，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)通過(guò)破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，抑制黃曲霉孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)，如2-羥基-4-甲氧基苯甲醛(HMB)[27]、鄰香草醛(未發(fā)表)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)容物滲出破壞細(xì)胞膜通透性，其中HMB還能夠破壞菌絲隔膜，破壞細(xì)胞壁完整性。(2)損傷線粒體功能，造成能量代謝以及胞內(nèi)酶系統(tǒng)紊亂，如Ma等[10]發(fā)現(xiàn)青葉醛降低乙酰輔酶A、ATP和線粒體脫氫酶的活性。相似的結(jié)論在羅曼等[28-29]的試驗(yàn)中已得到驗(yàn)證。(3)多途徑下誘導(dǎo)黃曲霉細(xì)胞凋亡。Tian等[30]報(bào)道紫蘇醛通過(guò)誘導(dǎo)活性氧(ROS)、鈣離子及細(xì)胞凋亡蛋白酶增加引發(fā)孢子凋亡。

2 黃酮類化合物

黃酮類化合物廣泛存在于蕓香科、唇形科、豆科、傘性科、銀杏科與菊科等植物中，具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒等生物活性功能[31]。李鐘美[32]研究發(fā)現(xiàn)，高良姜中主要的抑菌活性成分是黃酮醇類物質(zhì)，主要為高良姜素、槲皮素、山萘黃酮醇等。其中，高良姜素抑制黃曲霉菌絲生長(zhǎng)，其抗菌特性可能與其B環(huán)上羥基的缺乏有關(guān)[33]，可強(qiáng)烈阻止肝臟內(nèi)AFB1向黃曲霉毒素B1-8,9-環(huán)氧化物的轉(zhuǎn)化，而后者是黃曲霉毒素的最終致癌物[34]。槲皮素通過(guò)下調(diào)孢子發(fā)育相關(guān)基因(AFLA-083110和AFLA-044790)的表達(dá)抑制黃曲霉孢子萌發(fā)[35]。同時(shí)，槲皮素還具有抗氧化能力，能夠激活抗氧化系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子Yap1，極大提高抗氧化酶活性，并通過(guò)下調(diào)產(chǎn)毒調(diào)控基因AflR、AflS的表達(dá)抑制黃曲霉毒素的合成[15]。此外，也有研究表明，槲皮素能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合黃曲霉毒素合成途徑的關(guān)鍵酶——聚酮化合物合成酶的活性位點(diǎn)發(fā)揮抑制作用[36]。另外，黃酮中的代表化合物白楊素，對(duì)許多致病菌有顯著的抑制作用，如意大利青霉[37]和金黃色葡萄球菌[38]等。Yang等[37]對(duì)此類黃酮的構(gòu)效關(guān)系研究表明，不同碳位置上的羥基可能是抗真菌效果的潛在影響因素，如C4位置上的羥基會(huì)增強(qiáng)白楊素對(duì)意大利青霉的抑菌活性，C3位置上的羥基則相反，C2和C3之間不飽和鍵的氫化會(huì)降低白楊素對(duì)意大利青霉的抑菌活性；糖基化結(jié)合位點(diǎn)的不同和糖類成分的差異對(duì)抑菌活性有不同的影響。此外，有相關(guān)文獻(xiàn)表明具有抑菌作用的黃酮中有一半以上為二氫黃酮類化合物[39]，如喬松素[40]、二氫楊梅素等。熊大勝等[41-42]的試驗(yàn)表明二氫楊梅素對(duì)黃曲霉、金黃色葡萄球菌等均有抑制作用，但也有研究表明，二氫楊梅素對(duì)霉菌抑制作用并不明顯[43]，這可能與菌株或是藥敏試驗(yàn)中選用濃度不同有關(guān)。本課題組前期研究表明，二氫楊梅素能夠顯著抑制黃曲霉孢子萌發(fā)，其最小抑菌濃度為4 000 μg/mL(未發(fā)表)，抑菌機(jī)理正在研究中。然而，目前對(duì)二氫黃酮類化合物的抑菌機(jī)制研究尚有待深入，羥基對(duì)其構(gòu)效關(guān)系的影響也有待試驗(yàn)驗(yàn)證。

表1 天然產(chǎn)物抑制黃曲霉的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

3 烯類化合物

植物中具有抑菌活性的烯類化合物有檸檬烯、α-蒎烯、香葉烯、金合歡烯、松油烯、石竹烯、檜烯等。梁海燕等[44]發(fā)現(xiàn)，檸檬烯對(duì)多種真菌，如黃曲霉、寄生曲霉、金黃色葡萄球菌都具有抑制作用，是一種廣譜抑菌劑，與α-蒎烯[45-46]、羅勒烯相似，其抑菌作用靶點(diǎn)均為細(xì)胞膜，除此之外，檸檬烯還能夠抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生[47]。另有報(bào)道，某些烯類化合物能夠降低AFB1所致小鼠肝癌的發(fā)生率，如銀杏葉提取物中的萜烯類化合物下調(diào)肝組織肝癌相關(guān)基因MXR7的表達(dá)、提高肝細(xì)胞抑制因子P16蛋白的表達(dá)[48]。但此試驗(yàn)只是降低了肝癌的發(fā)生率，并沒(méi)有完全防止肝癌的發(fā)生，其抑制機(jī)理還有待研究。

4 醇類化合物

醇類物質(zhì)也是廣泛存在于植物中的重要活性成分，其中如香葉醇、橙花醇等已被《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn) GB 29938—2013》列入允許使用的食品天然香料名單。梁海燕等[44]研究發(fā)現(xiàn)芳樟醇通過(guò)抑制線粒體呼吸及破壞細(xì)胞膜抑制黃曲霉生長(zhǎng)。香葉醇則主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS積累發(fā)揮抑制作用[49]。橙花醇抑制黃曲霉的作用機(jī)理還與鈣離子超載有關(guān)，二者的積累引起線粒體功能障礙，增加氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而激活細(xì)胞色素c的釋放和提高半胱天冬酶活性[22]。這3種醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，它們互為同分異構(gòu)體，其中香葉醇與橙花醇因甲基和氫原子順?lè)唇Y(jié)構(gòu)的不同互為立體異構(gòu)，芳樟醇中有一個(gè)雙鍵與香葉醇和橙花醇有位置上的差別,因此是位置異構(gòu)體[50]。橙花醇、芳樟醇、香葉醇抑制黃曲霉的MIC分別為0.5、0.6、0.5 μL/mL[25-26]，它們之間的差異可能和結(jié)構(gòu)上的差別相關(guān)。除此之外，具有抑制黃曲霉生成及毒素合成的醇類化合物還有香茅醇、香芹醇等[51]。

圖1 香葉醇、芳樟醇和橙花醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

5 多酚類化合物

多酚類化合物中研究較多的有茶多酚、姜黃素等。茶多酚是廣泛存在于茶葉中的一種天然抗氧化劑，也是普洱茶中的主要抑菌活性成分[52]。茶多酚不僅抑制黃曲霉的生長(zhǎng),而且對(duì)黃曲霉毒素合成有顯著抑制效果[53]。茶多酚可嚴(yán)重破壞黃曲霉菌絲體的超微結(jié)構(gòu)：(1)破壞細(xì)胞壁，瓦解黃曲霉菌的固有形態(tài)；(2)破壞細(xì)胞膜，使胞內(nèi)外物質(zhì)交換受阻，抑制細(xì)胞膜上的酶正常發(fā)揮作用，降低細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，阻礙生物大分子合成。姜黃素是來(lái)自香料姜黃的天然多酚化合物，F(xiàn)erreira等[54]發(fā)現(xiàn)，姜黃素可抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，機(jī)理可能涉及細(xì)胞氧化應(yīng)激和過(guò)氧化。此外，姜黃素還是一種有效的光敏劑，經(jīng)可見(jiàn)光在60 J/cm2、420 nm照射處理后抑菌活性顯著增強(qiáng)[55]。百里香酚是一種高效的抑殺黃曲霉孢子的酚類化合物，凋亡機(jī)制涉及以下兩個(gè)方面：(1)增加ROS和NO含量[56];(2)特異靶向細(xì)胞膜上的電壓門(mén)控鉀離子通道β亞甲基KCNAB[57]。

6 醌類化合物

醌類化合物從結(jié)構(gòu)上可分為苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌，其中萘醌是植物和微生物中活性最高的天然代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗腫瘤等活性。鳳仙花醌、胡桃醌、β-拉帕醌均屬于萘醌，抑制酵母菌機(jī)理涉及破壞線粒體功能[58]。2-甲氧基-1,4-萘醌(MeONQ)，可顯著抑制意大利青霉的生長(zhǎng)，作用靶點(diǎn)包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、線粒體氧化還原酶等[59]，但對(duì)黃曲霉是否有抑制作用還有待研究。其他抑制黃曲霉的醌類物質(zhì)還有蘆薈大黃素、蘭雪醌、紫草素、百里香醌等[60]。然而許多醌類化合物，如鳳仙花醌、胡桃醌對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有毒性[58]，這種毒性機(jī)理包括：(1)催化NADPH和O2引發(fā)的氧化還原循環(huán)，使O2轉(zhuǎn)化為有害的ROS；(2)醌環(huán)上的未取代碳原子結(jié)合親核生物分子。因此，如果將醌類化合物用于食品防霉制劑，需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的藥物安全性評(píng)價(jià)。

7 肽類化合物

從植物和微生物中分離到的抗菌肽是拮抗黃曲霉的重要組分。如短小芽孢桿菌HY1分泌的抗真菌肽[61]、黃曲霉拮抗菌B10-6-1分泌的脂肽[62]等能夠顯著抑制黃曲霉孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。在韓玉竹等[25]的試驗(yàn)中，辣椒籽抗菌肽顯著降低黃曲霉攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，這很可能與辣椒籽抗菌肽破壞了細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。這與黃現(xiàn)青[63]報(bào)道的環(huán)狀脂肽通過(guò)抑制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收抑制點(diǎn)狀青霉的觀點(diǎn)一致。從鏈霉菌、玫瑰茄、海洋海綿和海洋細(xì)菌中分離出來(lái)的環(huán)二肽——L-亮氨酰-L-脯氨酰，在3.5 mg/mL時(shí)可抑制黃曲霉毒素相關(guān)基因aflR、hexB、pksL1和dmtA的轉(zhuǎn)錄，但對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)影響很小，只有當(dāng)質(zhì)量濃度大于6 mg/mL時(shí)，才能夠抑制其生長(zhǎng)。此二肽具有3個(gè)異構(gòu)體，不同濃度下，它們抑制代謝產(chǎn)物——降散盤(pán)衣酸的積累、孢子形成的程度也有所不同，抑制作用可能與某些酶基因的下調(diào)相關(guān)[64]。這是關(guān)于環(huán)二肽抑制黃曲霉毒素合成的首次報(bào)道，其詳細(xì)機(jī)理及具體應(yīng)用還有待探討。

8 其他類化合物

抑制黃曲霉生長(zhǎng)及其毒素合成的化合物還有生物堿[4]、哌啶化合物[65]、多糖[11, 66]等。吲哚屬于生物堿的一種，MIC為100 μg/mL，一定范圍內(nèi)，抑菌效果隨吲哚濃度升高而增強(qiáng)，低濃度的吲哚會(huì)促進(jìn)黃曲霉毒素的產(chǎn)生，只有當(dāng)吲哚濃度接近或者大于MIC時(shí)，才可有效抑制AFT，此抑制機(jī)理與吲哚對(duì)產(chǎn)毒基因aflR的調(diào)控有關(guān)[26]。 Caceres等[67]發(fā)現(xiàn)胡椒堿是一種哌啶化合物，它通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制AFT合成，并從基因?qū)用嫔蠈?duì)此發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了更深入的探究：(1)在胡椒堿的作用下，參與AFB1生物合成的27個(gè)基因中有25個(gè)基因被顯著下調(diào)，其中9個(gè)基因的表達(dá)被輕度抑制(2～3倍)，如aflD、aflQ、aflC等，13個(gè)基因的表達(dá)呈現(xiàn)出4～8倍的抑制，其中以aflN、aflW、aflK下調(diào)最為明顯，而aflR、aflT則無(wú)顯著變化;(2)參與編碼氧化應(yīng)激的20個(gè)基因中16個(gè)被顯著調(diào)節(jié)，其中包括轉(zhuǎn)錄因子(msnA、srrA)、全調(diào)因子VeA、雙加氧酶ppoc和細(xì)胞受體gprp在內(nèi)的5個(gè)下調(diào)基因,氧化應(yīng)激反應(yīng)因子(sskA、ap1、atfA、atfB、sod1、cat、cat2)、氧化脂質(zhì)生物合成因子(ppa、ppoB)、GPR1和GPRH這11個(gè)上調(diào)因子,其中aflB、sod1上調(diào)效果最為顯著;(3)過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶過(guò)表達(dá)。李紅波等[66]對(duì)幾種多糖進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的β-葡聚糖抑制黃曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)毒，部分α-葡聚糖，如馬鈴薯直鏈淀粉也具有這種抑制功能，但也有一些多糖的作用相反，如A型大豆多糖能促進(jìn)黃曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)毒。由于葡聚糖分子量較大，不易進(jìn)入真菌細(xì)胞內(nèi)，推測(cè)其細(xì)胞膜可能存在多糖受體介導(dǎo)抑菌機(jī)制[66]。香菇纖維素衍生物GPX也是一種β-葡聚糖，GPX能夠促進(jìn)黃曲霉細(xì)胞內(nèi)囊泡過(guò)早與大液泡融合[11]。由于AFT合成最后幾步在囊泡中完成[68]，然后囊泡經(jīng)過(guò)運(yùn)輸和胞吐釋放AFT，因此，囊泡過(guò)早融合成大液泡會(huì)使AFT的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、釋放受阻[11]。綜上所述，多糖也是一種潛在的可以抑制黃曲霉的天然產(chǎn)物。

9 展望

在對(duì)黃曲霉及其毒素的污染防控技術(shù)中，傳統(tǒng)的化學(xué)法處理簡(jiǎn)單、成本低，但污染嚴(yán)重，可能會(huì)破壞產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分。物理法操作簡(jiǎn)單、方便高效，但儀器成本高。微生物法因其特異性強(qiáng)、污染小、能夠保證食品營(yíng)養(yǎng)安全等優(yōu)點(diǎn)成為最具發(fā)展前景的方法[69]，然而微生物法目前尚處于實(shí)驗(yàn)室階段。利用天然產(chǎn)物抑制黃曲霉生長(zhǎng)及其毒素合成是防控中的研究熱點(diǎn)。

近年來(lái)，多數(shù)抑菌研究已經(jīng)從簡(jiǎn)單的生理生化指標(biāo)檢測(cè)轉(zhuǎn)向靶標(biāo)探索，如細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、線粒體成為了多種抑菌劑的共同靶標(biāo)。除此之外，宏觀的整體的研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向亞細(xì)胞乃至分子層面的探索，如某些參與黃曲霉生長(zhǎng)和毒素合成的基因/蛋白的表達(dá)。這些研究都為開(kāi)發(fā)靶向抑菌劑提供了重要的理論基礎(chǔ)。鑒于黃曲霉對(duì)多種抑菌劑，包括天然的和合成的化合物均衍生出了一定的耐受機(jī)制[24]，因此，如何改造、修飾天然產(chǎn)物以及如何將有效活性成分合理復(fù)配，以提升抑菌劑的穩(wěn)定性及長(zhǎng)期的抑菌效果仍然是目前防霉控霉方向的重要問(wèn)題，是延長(zhǎng)糧食儲(chǔ)藏期和食品貨架期、提高我國(guó)糧食出口安全以及食品品質(zhì)的重要發(fā)展方向。