β-咔啉類雜環(huán)胺模型體系反應(yīng)產(chǎn)物相關(guān)性質(zhì)的研究

趙天培，馬宇翔，張晨霞，席 俊，汪學(xué)德

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

圖1 Norharman和Harman的分子結(jié)構(gòu)式

熱處理(如蒸煮、燒烤、油炸、烘焙等)是食品加工中最為普遍的方式，這些加工方式伴隨著美拉德反應(yīng)，讓人們享受到食品色、香、味的同時(shí)又會(huì)生成一系列危害物，如丙烯酰胺、羥甲基糠醛、晚期糖基化終末產(chǎn)物等[1-3]。近年來(lái)，高溫加工肉制品中產(chǎn)生的有害物質(zhì)雜環(huán)胺(heterocyclic aromatic amines, HCAs)成為國(guó)內(nèi)外相關(guān)科研工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。雜環(huán)胺是蛋白質(zhì)含量高的食品經(jīng)高溫處理后產(chǎn)生的一類致癌、致突變的化合物，迄今有超過25種雜環(huán)胺被分離鑒定出來(lái)[4]，其中β-咔啉類雜環(huán)胺Norharman(9H-吡啶并[3,4-b]吲哚，分子量168.2，非極性)和Harman(1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚，分子量182.3，非極性)在食品加工中非常容易產(chǎn)生，分子結(jié)構(gòu)式見圖1。這兩種物質(zhì)自身不具有致突變性，但當(dāng)與苯胺、甲苯或者其他雜環(huán)胺共存時(shí)會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的致癌性，屬于輔助致突物和潛在誘變劑[5-6]，動(dòng)物試驗(yàn)也表明，Norharman和Harman會(huì)影響動(dòng)物的生理行為，主要是因?yàn)樗鼈儠?huì)與小鼠肝臟和大腦的某些位點(diǎn)結(jié)合[7]。

通過研究，人們對(duì)高蛋白食品在熱加工處理過程中產(chǎn)生雜環(huán)胺的機(jī)理有了初步的認(rèn)識(shí)，美拉德反應(yīng)在雜環(huán)胺的形成方面發(fā)揮重要作用。美拉德反應(yīng)是由還原糖和含游離氨基的化合物在加熱時(shí)所發(fā)生的一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，是熱加工食品中風(fēng)味和色澤產(chǎn)生的重要途徑之一[8]。研究發(fā)現(xiàn)，不同的氨基酸和糖在美拉德反應(yīng)進(jìn)程中生成不同的中間產(chǎn)物，進(jìn)一步與肌酐反應(yīng)最終形成不同種類的雜環(huán)胺。色氨酸是β-咔啉類雜環(huán)胺形成的前體物質(zhì)，同時(shí)，葡萄糖在復(fù)雜的反應(yīng)過程中促進(jìn)了β-咔啉的形成[9-11]。

采用葡萄糖與色氨酸以及肌酐在高溫條件下反應(yīng)構(gòu)建肉制品美拉德反應(yīng)模型體系，研究不同反應(yīng)溫度和時(shí)間體系中β-咔啉類雜環(huán)胺生成規(guī)律及體系產(chǎn)物的相關(guān)性質(zhì)，包括pH值、中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物類黑精生成量、體系DPPH自由基清除能力和鐵離子還原力以及各體系揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量的變化規(guī)律，并進(jìn)一步分析雜環(huán)胺生成量與各理化指標(biāo)之間的相關(guān)性，能夠加深對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的認(rèn)識(shí)，有助于深入了解美拉德反應(yīng)與其伴生危害物雜環(huán)胺之間的關(guān)系，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

Harman和Norharman標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、色氨酸、肌酐(純度均大于98%)、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ)、二甘醇：上海麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)、乙腈、甲醇(色譜純)：美國(guó)Sigma公司；氨水、濃鹽酸(分析純)：天津科密歐試劑有限公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Acquity UPLC CLASS超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQD三重四極桿質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)：美國(guó)Waters公司；XPE26DR電子天平(感量0.01 mg)：瑞士Mettler Toledo公司；Eppendorf Multipette E3x電動(dòng)移液器：德國(guó)Eppendorf公司；P160002厚壁耐壓瓶：北京欣維爾玻璃儀器有限公司；MTN-2800 W氮吹濃縮儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；Visiprep DL真空固相萃取裝置：美國(guó)Supelco公司；UV-6000PC紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；DK-S24型電熱恒溫油浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；7890B型氣相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；ISQ型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：Thermo Fisher Scientific公司；摩爾細(xì)胞型超純水器：重慶Molecular水處理設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型體系的建立

稱取0.4 mmoL色氨酸、0.4 mmoL肌酐、0.2 mmoL葡萄糖于耐壓瓶中，用移液管準(zhǔn)確移取10 mL水分含量為14%的二甘醇水溶液，渦旋振蕩混勻，置于油浴鍋中在160、180、200 ℃條件下分別反應(yīng)10、30、60、90、120 min，獲得反應(yīng)程度不同的反應(yīng)液，儲(chǔ)存于-4 ℃冰箱備用。

1.3.2 UPLC-MS測(cè)定雜環(huán)胺含量

樣品前處理：根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)吸取200 μL反應(yīng)液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取一定量稀釋后的模型體系反應(yīng)液上樣于PCX固相萃取柱(3 mL甲醇，3 mL超純水預(yù)先活化)，再用3 mL 0.1 mol/L的鹽酸和3 mL甲醇淋洗，最后使用3 mL甲醇-氨水溶液(體積比為95∶5)洗脫，收集全部洗脫液于45 ℃下氮吹至近干，用1 mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)行UPLC-MS測(cè)定。

色譜分析條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)，柱溫35 ℃；色譜流動(dòng)相為10 mmol/L甲酸銨溶液(pH 6.80)(A)、乙腈(B)，流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0 min，10% B；0.2 min，10% B；1.0 min，30% B；3.0 min，60% B；3.5 min，90% B，平衡至初始狀態(tài)；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜分析條件：質(zhì)譜電離源采用電噴霧電離源(ESI)，ESI+，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM模式)；源溫120 ℃；毛細(xì)管電壓0.5 kV；脫溶劑氣體流速1 000 L/h；脫溶劑溫度650 ℃；錐孔氣體流速50 L/h；碰撞氣體流速0.3 mL/min。雜環(huán)胺質(zhì)譜參數(shù)見表1。

以雜環(huán)胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，建立雜環(huán)胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：YNorharman=1 140.3X+1 688.5，R2=0.999 4；YHarman=952.05X+865，R2=0.999 5。峰面積與雜環(huán)胺質(zhì)量濃度在0.609～276.0 ng/mL之間有良好的線性關(guān)系。Norharman和Harman的檢出限和定量限分別為0.14、0.05 μg/kg和0.24、0.16 μg/kg，回收率為84.51%～113.8%，精密度小于6%。

表1 β-咔啉類雜環(huán)胺的MRM質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 pH值的測(cè)定

采用PHS-25型pH計(jì)檢測(cè)模型體系反應(yīng)液的pH值。

1.3.4 中間產(chǎn)物和褐變程度的測(cè)定

取一定反應(yīng)液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用紫外可見分光光度計(jì)在420 nm和294 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，分別用來(lái)表征模型體系反應(yīng)液的最終褐色產(chǎn)物類黑精和中間產(chǎn)物的量[12-13]。

1.3.5 模型體系反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性的測(cè)定

DPPH自由基清除能力測(cè)定：將樣品采用甲醇稀釋相同倍數(shù)后參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行測(cè)定；FRAP還原力的測(cè)定：樣品稀釋后參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 模型體系反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定

稱取模型體系反應(yīng)液4 g左右于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入4-壬醇作內(nèi)標(biāo)密封待測(cè)。水浴50 ℃吸附平衡20 min，采用SPME進(jìn)樣器進(jìn)行頂空吸附萃取30 min，GC-MS手動(dòng)進(jìn)樣，樣品解析時(shí)間3 min。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，流速1 mL/min；升溫程序：起始溫度40 ℃，在40 ℃條件下保持3.5 min，以4 ℃/min升溫到230 ℃，維持8 min；進(jìn)樣方式：不分流。質(zhì)譜條件：電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；掃描質(zhì)量范圍(m/z)33～65。數(shù)據(jù)處理：未知物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索并與NIST 11.L譜庫(kù)對(duì)比分析，僅選用匹配度大于80的鑒定結(jié)果，通過對(duì)比待測(cè)揮發(fā)物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比進(jìn)行定量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用EXCEL 2010、SPSS 23.0及Masslynx 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 2017軟件作圖。數(shù)據(jù)間多重對(duì)比采用Duncan檢驗(yàn)分析顯著性，P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型體系中雜環(huán)胺含量的變化

圖2為雜環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液UPLC-MS色譜圖。模型體系中β-咔啉類雜環(huán)胺總生成量的變化如圖3所示。由圖3可知，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)和溫度升高，雜環(huán)胺生成量基本呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。160 ℃條件下，β-咔啉雜環(huán)胺的總生成量由3.84 μg/mL(反應(yīng)10 min)升高至31.03 μg/mL(反應(yīng)120 min)；180 ℃條件下，β-咔啉雜環(huán)胺的總生成量有所提高，由7.99 μg/mL上升至62.23 μg/mL；相比于前兩個(gè)溫度條件，200 ℃時(shí)β-咔啉雜環(huán)胺的總生成量上升趨勢(shì)更加顯著，由9.07 μg/mL升高至106.05 μg/mL。

圖2 雜環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液UPLC-MS色譜圖

圖3 不同溫度下模型體系中β-咔啉類雜環(huán)胺總生成量隨時(shí)間的變化

表2是Harman和Norharman在各個(gè)體系中的生成量，兩種雜環(huán)胺隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)和溫度升高，生成量逐漸增加，其中Norharman的生成量顯著高于Harman的生成量。在160 ℃條件下，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，Harman的生成量由0.92 μg/mL上升至5.14 μg/mL，Norharman的生成量由2.92 μg/mL上升至25.89 μg/mL；180 ℃條件下，Harman和Norharman的生成量分別由1.71、6.28 μg/mL上升至10.94、51.29 μg/mL；200 ℃條件下，Harman和Norharman的生成量分別由2.27、6.80 μg/mL上升至20.06、85.99 μg/mL，可以看出Norharman比Harman更容易生成且含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Harman。本研究與Herraiz等[16]研究結(jié)果一致，溫度和時(shí)間顯著促進(jìn)β-咔啉類雜環(huán)胺的形成。β-咔啉類雜環(huán)胺生成量普遍較高，可能是由于前體物含量和反應(yīng)溫度較高所致，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，低于100 ℃的溫度也能生成β-咔啉類雜環(huán)胺[10,17]。

表2 不同溫度下模型體系中Norharman 和 Harman含量隨時(shí)間的變化

2.2 模型體系中pH值的變化

溫度和時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系pH值的影響如圖4所示。隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)和反應(yīng)溫度升高，反應(yīng)體系產(chǎn)物pH值逐漸升高，由低溫短時(shí)間加熱呈現(xiàn)弱堿性到高溫長(zhǎng)時(shí)間加熱后反應(yīng)液變?yōu)閴A性，這與模型體系中大量生成β-咔啉類雜環(huán)胺有密切關(guān)系，雜環(huán)胺類物質(zhì)屬于堿性化合物，體系生成量越高，堿性越強(qiáng)。

圖4 不同溫度下模型體系中反應(yīng)液pH值隨時(shí)間的變化

2.3 模型體系中中間產(chǎn)物和褐變程度的變化

圖5 不同溫度下模型體系中生成的美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物和褐變程度隨時(shí)間的變化

反應(yīng)產(chǎn)物在294 nm波長(zhǎng)處的吸光度可以表示美拉德反應(yīng)過程中形成的無(wú)色、無(wú)熒光中間產(chǎn)物(如糖、醛和二羰基化合物等)的積累量，這些產(chǎn)物是美拉德反應(yīng)過程中生成最終產(chǎn)物的前體物。由圖5a可知，隨著反應(yīng)進(jìn)行，β-咔啉類雜環(huán)胺模型體系在294 nm波長(zhǎng)處的吸光度呈上升趨勢(shì)，中間產(chǎn)物生成量增加，在前30 min，中間產(chǎn)物的生成速率較快，后逐漸趨于平緩，其變化規(guī)律與pH值的變化規(guī)律類似。420 nm處的吸光度用來(lái)表征反應(yīng)體系中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物類黑精的積累量。由圖5b可知，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)和溫度升高，420 nm波長(zhǎng)處的吸光度逐漸增加，表明模型體系褐變程度增強(qiáng)，形成大量褐色物質(zhì)，色澤加深，同時(shí)反應(yīng)進(jìn)行得更加徹底，反應(yīng)終產(chǎn)物類黑精的積累量增多。

2.4 模型體系中產(chǎn)物抗氧化性的變化

表3為模型體系抗氧化活性的結(jié)果，不同溫度下模型體系反應(yīng)產(chǎn)物DPPH自由基清除能力和鐵離子還原力隨時(shí)間變化并沒有規(guī)律。DPPH自由基清除率在160 ℃時(shí)，基本隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)而增加，由51.92%上升至90.94%，但隨著加熱溫度升高，體系DPPH自由基清除率隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)總體上有所下降。鐵離子還原力在160 ℃條件下，隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，但在180 ℃和200 ℃條件下，還原力沒有呈現(xiàn)一致的變化規(guī)律，180 ℃反應(yīng)時(shí)，隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)體系還原力先增加后降低，200 ℃反應(yīng)時(shí)，體系還原力呈波動(dòng)性變化，原因可能是高溫長(zhǎng)時(shí)間加熱反應(yīng)生成具有螯合Fe3+能力的大分子化合物，造成體系還原力降低。

表3 不同溫度下各模型體系反應(yīng)產(chǎn)物DPPH自由基清除能力和FRAP還原力隨時(shí)間的變化

模型體系DPPH自由基清除率和鐵離子還原力變化趨勢(shì)復(fù)雜，這可能與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的復(fù)雜性有關(guān)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中既含有抗氧化物質(zhì)又含有促氧化物質(zhì)[18]，致使抗氧化活性時(shí)而降低時(shí)而升高，同時(shí)，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)和溫度升高，不同活性的物質(zhì)發(fā)揮的作用不一樣，造成體系抗氧化性變化沒有規(guī)律。

2.5 模型體系中各理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

對(duì)模型體系中反應(yīng)產(chǎn)物、β-咔啉類雜環(huán)胺總生成量、體系pH值、中間產(chǎn)物、褐變程度、DPPH自由基清除能力、鐵離子還原力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表4所示。Harman、Norharman含量及β-咔啉類雜環(huán)胺總生成量都與體系pH值、D(294)和D(420)呈極顯著正相關(guān)，與體系DPPH自由基清除能力和還原力無(wú)相關(guān)性；體系pH值與D(294)和D(420)呈極顯著正相關(guān)，與體系還原力呈顯著相關(guān)，與體系DPPH自由基清除能力無(wú)相關(guān)性；D(294)與體系還原力呈極顯著正相關(guān)，D(420)與體系還原力呈顯著正相關(guān)，二者與體系DPPH自由基清除能力無(wú)相關(guān)性；體系DPPH自由基清除能力與還原力呈極顯著正相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，β-咔啉類雜環(huán)胺模型體系中各理化指標(biāo)之間相互影響，主要由于高溫濕熱條件下，堿性環(huán)境有助于美拉德反應(yīng)，反應(yīng)速率加快造成褐變程度增強(qiáng)，同時(shí)反應(yīng)產(chǎn)生更多中間產(chǎn)物，雜環(huán)胺生成量增加，進(jìn)一步造成體系pH值上升。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，D(420)即表示體系褐變程度與體系抗氧化能力FRAP顯著相關(guān)，這與先前的報(bào)道一致[19]，近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)抗氧化能力并不完全依賴褐變程度即類黑精的生成量[20]。章銀良等[1]報(bào)道在生成丙烯酰胺的美拉德模型體系中，丙烯酰胺生成量和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性存在正向關(guān)系，本研究得出雜環(huán)胺的生成量與體系的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原力沒有明確的關(guān)系。

表4 β-咔啉類雜環(huán)胺模型體系各理化指標(biāo)間的相關(guān)性分析

2.6 模型體系中揮發(fā)性物質(zhì)含量的變化

采用SPME-GC-MS對(duì)9個(gè)不同反應(yīng)時(shí)間和溫度的β-咔啉類雜環(huán)胺模型體系的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果如表5所示，共鑒定出17種化合物，吡嗪類物質(zhì)所占比值最高，原因可能是pH值影響美拉德反應(yīng)，美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物二羰基化合物在堿性環(huán)境中與游離氨基發(fā)生反應(yīng)生成α-氨基酮，其經(jīng)過縮合就會(huì)生成不同種類的吡嗪化合物，尤其在pH值大于9時(shí)吡嗪類物質(zhì)大量產(chǎn)生[21-22]。從表5可看出，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)和溫度升高，模型體系揮發(fā)性物質(zhì)種類增多，含量也基本呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中2-甲基吡嗪含量最高，200 ℃反應(yīng)120 min時(shí)含量已增至16.39 μg/g，其次為2,6-二甲基吡嗪、吡嗪、2-乙基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪，含量分別為6.04、5.04、4.96、3.95 μg/g，這些物質(zhì)也是美拉德反應(yīng)常見生成產(chǎn)物，通常被認(rèn)為具有烤香風(fēng)味[23]。

表5 模型體系反應(yīng)液揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果

此外，色氨酸是吲哚的衍生物，隨著體系加熱溫度升高和加熱時(shí)間延長(zhǎng)，色氨酸大量降解，體系中吲哚物質(zhì)含量逐漸增加，最終生成量?jī)H次于幾種吡嗪類物質(zhì)，由最初未檢測(cè)出到最終生成量為3.55 μg/g。吲哚是一種亞胺，具有弱堿性，這也是導(dǎo)致體系pH值升高的原因。另外，吲哚乙胺等可通過環(huán)化反應(yīng)形成四氫化-β-咔啉，而Herraiz[24]認(rèn)為四氫化-β-咔啉是熱加工過程中β-咔啉類雜環(huán)胺Norharman和Harman形成的前體物質(zhì)，當(dāng)體系中產(chǎn)生大量的吲哚類物質(zhì)，β-咔啉類雜環(huán)胺的含量就會(huì)相應(yīng)升高，進(jìn)一步解釋了吲哚和兩種β-咔啉類雜環(huán)胺生成量變化規(guī)律相似的原因。

3 結(jié)論

通過對(duì)色氨酸-葡萄糖-肌酐的食品美拉德模型體系研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)β-咔啉類雜環(huán)胺的生成量和反應(yīng)體系產(chǎn)物理化性質(zhì)有很大的影響，即隨著反應(yīng)溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，β-咔啉類雜環(huán)胺的生成量相應(yīng)增加、體系pH值升高、中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物類黑精生成量增加、揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量增多，以吡嗪類化合物居多，而反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和鐵離子還原力沒有規(guī)律性變化。相關(guān)性研究表明，體系中雜環(huán)胺生成量與pH值、中間產(chǎn)物生成量和最終產(chǎn)物類黑精生成量之間呈極顯著正相關(guān)，與體系抗氧化活性沒有相關(guān)性。

美拉德反應(yīng)機(jī)理復(fù)雜，產(chǎn)物眾多，可在食品工業(yè)中對(duì)其反應(yīng)產(chǎn)物加以利用，如在抗氧化活性方面的應(yīng)用，同時(shí)也應(yīng)該重視反應(yīng)中產(chǎn)生的有害物質(zhì)如雜環(huán)胺。此外，本研究為調(diào)節(jié)食品美拉德體系色澤、抗氧化活性、風(fēng)味及有害物質(zhì)提供理論研究的思路，為熱加工肉制品減少雜環(huán)胺形成和提高食用品質(zhì)提供技術(shù)基礎(chǔ)。