黑曲霉葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的表達(dá)及其高效發(fā)酵研究

盧 洋，張帥兵，翟煥趁，李 娜，呂揚(yáng)勇，胡元森，蔡靜平

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)是一類能催化β-D-葡萄糖和氧氣生成葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯和過氧化氫的酶類[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)曲霉、青霉和芽孢桿菌等多種微生物可產(chǎn)生葡萄糖氧化酶，用于研究和實(shí)際應(yīng)用最多的是來源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶，該酶在面粉和飼料添加劑、葡萄糖酸及其鹽生產(chǎn)以及生物傳感器等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[2-7]。研究表明通過向小麥粉中添加葡萄糖氧化酶可改善面團(tuán)品質(zhì)、發(fā)酵穩(wěn)定性和面包體積等[3,8-9]。葡萄糖氧化酶在飼料中添加可促進(jìn)動物消化吸收、保護(hù)腸道和提高動物免疫力等，是替代抗生素具有較好前景的新型飼料酶制劑[10-12]。近年來，市場上對葡萄糖氧化酶的需求日益增加，高效發(fā)酵制備葡萄糖氧化酶可降低其生產(chǎn)成本。在黑曲霉發(fā)酵葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)工藝中，發(fā)酵成本較高、酶制劑分離純化較復(fù)雜，而利用基因工程菌高效發(fā)酵黑曲霉葡萄糖氧化酶可有效降低生產(chǎn)成本。

作者通過將黑曲霉葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中組成型表達(dá)，純化得到了葡萄糖氧化酶并分析了其酶學(xué)特性。為了進(jìn)一步提高其發(fā)酵效率，將黑曲霉葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中進(jìn)行誘導(dǎo)型表達(dá)并利用G418抗生素篩選獲得了畢赤酵母高效表達(dá)菌株，通過高密度發(fā)酵可高效發(fā)酵黑曲霉葡萄糖氧化酶。本研究為高效發(fā)酵黑曲霉葡萄糖氧化酶及進(jìn)一步改造其酶學(xué)特性奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coliDH5α、PichiapastorisX-33、黑曲霉菌株、pGAPZαA和pPIC9K質(zhì)粒載體：河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏。T4 DNA連接酶、EcoR I限制性內(nèi)切酶、NotI限制性內(nèi)切酶、糖苷內(nèi)切酶H (Endo H)：美國New England Biolabs公司；pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶：寶生物工程(大連)有限公司(Takara)；鎳離子親和樹脂：美國伯樂公司；雙色預(yù)染蛋白Marker(貨號C610011)、真菌總RNA快速抽提試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒：上海生工生物有限公司。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L；Low-salt LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L；YPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L；YPDS培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，山梨醇182 g/L；BMGY培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，YNB 13.4 g/L，甘油10 g/L，生物素4×10-4g/L，0.1 mol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液(pH 6.0)；BMMY培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，胰蛋白 20 g/L，YNB 13.4 g/L，甲醇10 g/L，生物素4×10-4g/L，0.1 mol/L K2HPO4/KH2PO4緩沖液(pH 6.0)。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-200B恒溫?fù)u床：上海天呈試驗(yàn)儀器制造有限公司；SHP-150型恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；A200PCR儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司； BG-subMIDI水平電泳儀、BG-verMIDI垂直電泳儀：北京百晶生物技術(shù)有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)、MicroPulser電穿孔儀：美國伯樂公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；小型切向流超濾系統(tǒng)(Labscale TFF System)：美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉葡萄糖氧化酶編碼序列的克隆

將活化后的黑曲霉孢子接種于察氏培養(yǎng)基中，于200 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)5 d后用無菌紗布過濾菌絲體。液氮快速冷凍菌絲體并在研缽中快速研磨后，利用真菌總RNA快速抽提試劑盒提取黑曲霉總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書，以總RNA為模板、oligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄出cDNA。然后，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的黑曲霉葡萄糖氧化酶編碼序列信息(GenBank: FJ979866.1)設(shè)計(jì)正向引物Gox-F：5′- ATGCAGACTCTCCTTGTG -3′和Gox-R：5′- TCACTGCATGGAAGCATAATC -3′，利用Taq DNA聚合酶以cDNA為模板PCR擴(kuò)增出葡萄糖氧化酶編碼序列。利用DNA膠回收試劑盒獲得黑曲霉葡萄糖氧化酶編碼序列，利用T4 DNA將其與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序驗(yàn)證。利用信號肽分析在線軟件SignalP-5.0 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和PrediSi (www.predisi.de/)分析黑曲霉葡萄糖氧化酶的信號肽[13-14]。

1.3.2 黑曲霉葡萄糖氧化酶表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)正向引物mGox-F：5′- taggaggt gaattc AGCAATGGCATCGAAGCCAG -3′ 和mGox-R：5′ -taggaggt gcggccgc TCACTGCATGGAAGCATAATC -3′，以測序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒模板PCR擴(kuò)增不含信號肽的葡萄糖氧化酶編碼序列，PCR反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，2 min；反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸反應(yīng)10 min。利用DNA膠回收試劑盒獲得目的基因后，用EcoR I和NotI限制性內(nèi)切酶對目的基因進(jìn)行酶切。然后，用T4 DNA連接酶將其與用同樣的限制性內(nèi)切酶處理的pPIC9K質(zhì)粒相連接，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α后測序驗(yàn)證，將此重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-mGOX。

1.3.3 黑曲霉葡萄糖氧化酶編碼序列在畢赤酵母中的轉(zhuǎn)化與表達(dá)

用BspH I限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒pGAPZαA-mGOX進(jìn)行酶切反應(yīng)，制備線性化的重組質(zhì)粒片段。制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，利用電穿孔儀，將線性化重組質(zhì)粒片段轉(zhuǎn)入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞后涂布含有100 μg/mL博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基上。于28 ℃培養(yǎng)箱中放置3 d，挑取單菌落并接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2 d。離心收集發(fā)酵上清液，通過酶活檢測分析葡萄糖氧化酶的表達(dá)。

1.3.4 黑曲霉葡萄糖氧化酶活性測定方法

黑曲霉葡萄糖氧化酶活性的測定參照Tu等[15]的方法并稍加修改。反應(yīng)體系:10 mmol/L葡萄糖0.78 mL、2 000 U/mL辣根過氧化物酶40 μL、20 mmol/L愈創(chuàng)木酚的pH 6.0磷酸鈉緩沖液0.78 mL。取0.4 mL葡萄糖氧化酶酶液加入1.6 mL反應(yīng)溶液中，于35 ℃水浴鍋反應(yīng)5 min后，利用分光光度計(jì)在470 nm波長處測定吸光度。取0.4 mL不同濃度的過氧化氫加入1.6 mL反應(yīng)溶液中進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)葡萄糖濃度和470 nm波長處吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶液中葡萄糖氧化酶的酶活。酶活定義：在35 ℃、pH 6.0條件下，每1 min內(nèi)催化生成1 μmol的過氧化氫的酶量為1個(gè)酶活單位。

1.3.5 黑曲霉葡萄糖氧化酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)分析

利用labscale小型切向流超濾系統(tǒng)(Labscale TFF System)對發(fā)酵上清液進(jìn)行濃縮，根據(jù)鎳離子親和層析操作手冊(Ni-NTA Superflow Cartridge Handbook)的操作方法，利用鎳離子親和層析樹脂純化葡萄糖氧化酶。通過4%濃縮膠和12%分離膠的聚丙烯酰胺凝膠電泳對濃縮和純化后的葡萄糖氧化酶進(jìn)行SDS-PAGE分析。按照說明書，在37 ℃下用500 U的糖苷內(nèi)切酶H (Endo H)處理純化后的葡萄糖氧化酶以分析其糖基化。利用Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測純化后葡萄糖氧化酶的濃度。采用上述酶活檢測反應(yīng)條件對純化后的葡萄糖氧化酶的比活力進(jìn)行分析，比活力為在35 ℃、pH 6.0條件下每毫克葡萄糖氧化酶所具有的酶活單位數(shù)。根據(jù)葡萄糖氧化酶在35 ℃、100 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH 3.0～5.0)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.0～8.0)和Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)條件下的反應(yīng)活性確定其最適反應(yīng)pH值；將葡萄糖氧化酶在pH 3.0～9.0條件下溫育1 h后，于pH 6.0、35 ℃條件下測定殘余酶活以確定其pH穩(wěn)定性。根據(jù)葡萄糖氧化酶在pH 6.0、25～65 ℃條件下的反應(yīng)活性確定其最適反應(yīng)溫度；將葡萄糖氧化酶在25～65 ℃水浴中處理1 h后，于pH 6.0、35 ℃條件下測定殘余酶活以確定其熱穩(wěn)定性。

1.3.6 黑曲霉葡萄糖氧化酶多拷貝表達(dá)菌株的構(gòu)建及篩選

參照畢赤酵母表達(dá)手冊(Revision A.0, MAN0000012, Invitrogen)構(gòu)建和篩選黑曲霉葡萄糖氧化酶多拷貝表達(dá)的畢赤酵母菌株。利用PmeI限制性內(nèi)切酶線性化重組質(zhì)粒pPIC9K-GOX后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株。將其涂布于MD固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)2 d后，在MD培養(yǎng)基上加無菌水并用涂布棒刮下菌體制成約1×106cfu/mL的菌懸液。吸取100 μL菌懸液涂布于分別含有1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL G418抗生素的YPD固體培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

1.3.7 畢赤酵母高效發(fā)酵葡萄糖氧化酶的條件分析

參照畢赤酵母發(fā)酵工藝手冊(Version B, 053002, Invitrogen),對畢赤酵母高效發(fā)酵葡萄糖氧化酶的條件進(jìn)行分析。挑取含有4 mg/mL G418抗生素的YPD固體培養(yǎng)基平板上生長出的單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min培養(yǎng)2 d后離心收集菌體，用BMMY重懸菌體至濕菌體濃度為200 g/L。將50 mL濕菌體濃度為200 g/L的菌懸液分別移入250 mL無菌搖瓶中并于30 ℃、220 r/min條件下高密度培養(yǎng)。每天加入1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的甲醇，分析甲醇添加量對葡萄糖氧化酶表達(dá)量的影響；分析在最優(yōu)甲醇添加量條件下發(fā)酵時(shí)間對葡萄糖氧化酶表達(dá)量的影響。采用上述酶活檢測反應(yīng)體系，在35 ℃、pH 6.0條件下分析發(fā)酵上清液中葡萄糖氧化酶的活力。利用Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測純化后葡萄糖氧化酶的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆與表達(dá)

以黑曲霉總RNA為模板，擴(kuò)增出了葡萄糖氧化酶的編碼基因。該基因長度為1 818 bp(含1個(gè)終止密碼子)，編碼605個(gè)氨基酸，與已報(bào)道來源于黑曲霉Z-25菌株的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列一致性為100%[16]。利用SignalP-5.0和PrediSi在線軟件分析，黑曲霉葡萄糖氧化酶具有21個(gè)氨基酸組成的信號肽，推測其分子質(zhì)量為63.1 kDa。為了表達(dá)具有催化活性的葡萄糖氧化酶，利用PCR技術(shù)獲得去除信號肽的成熟葡萄糖氧化酶編碼序列。將該編碼和pGAPZαA質(zhì)粒載體重組并轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33菌株后，挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行蛋白表達(dá)。結(jié)果表明黑曲霉葡萄糖氧化酶可在畢赤酵母中組成型表達(dá)，發(fā)酵上清液中葡萄糖氧化酶的酶活可達(dá)1.2 U/mL。

2.2 黑曲霉葡萄糖氧化酶的純化

通過對發(fā)酵上清液濃縮并利用鎳離子親和層析對濃縮后發(fā)酵液中的葡萄糖氧化酶進(jìn)行分離純化，發(fā)酵液中葡萄糖氧化酶酶活可回收81.38%(表1)。黑曲霉葡萄糖氧化酶的SDS-PAGE分析見圖1，純化后得到了分子質(zhì)量約為100 kDa的葡萄糖氧化酶，分子質(zhì)量與推測的分子質(zhì)量相比偏大，這可能與該蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的糖基化有關(guān)。利用糖苷內(nèi)切酶H(Endo H)去除葡萄糖氧化酶的糖基化后，其分子質(zhì)量約為70 kDa，與推測的分子質(zhì)量相近。

表1 葡萄糖氧化酶純化后酶活回收率

注：泳道1為蛋白質(zhì)Marker；泳道2為濃縮后發(fā)酵上清液；泳道3為純化后的葡萄糖氧化酶；泳道4為糖苷內(nèi)切酶H處理后的葡萄糖氧化酶。

2.3 葡萄糖氧化酶酶學(xué)性質(zhì)

對純化后的葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果見圖2和圖3，在當(dāng)前反應(yīng)條件下該酶的比活力為60.9 U/mg。該酶的最適反應(yīng)pH為6，其在pH 5～8條件下具有較好的穩(wěn)定性。葡萄糖氧化酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，將葡萄糖氧化酶在45 ℃條件下溫育1 h后測定其殘余活力仍保留80%以上。

圖2 葡萄糖氧化酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性分析

圖3 葡萄糖氧化酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性分析

2.4 葡萄糖氧化酶高效表達(dá)菌株的篩選及發(fā)酵條件分析

為了進(jìn)一步提高葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的表達(dá)量，將葡萄糖氧化酶編碼序列與pPIC9K載體重組后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株得到了誘導(dǎo)型表達(dá)的工程菌株。通過G418抗生素篩選，得到了可在含有4.0 mg/mL G418的培養(yǎng)基上生長的菌株(圖4)。對該菌進(jìn)行高密度發(fā)酵條件研究表明：該菌株發(fā)酵葡萄糖氧化酶的最優(yōu)甲醇添加量為2.5%(圖5)。在甲醇添加量2.5%的誘導(dǎo)發(fā)酵過程中，葡糖糖氧化酶的表達(dá)量和酶活呈不斷上升趨勢，至第7天時(shí)葡萄糖氧化酶發(fā)酵量可達(dá)133 U/mL(圖5)，蛋白表達(dá)量約1.9 g/L(圖6)。發(fā)酵7 d后，上清液中酶活不再增加，蛋白濃度增加可能是由于酵母菌部分自溶引起的。

注：a、b、c、d分別為G418質(zhì)量濃度1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL。

圖5 甲醇添加量對發(fā)酵液中葡萄糖氧化酶酶活的影響

注：泳道M為蛋白質(zhì)Marker，泳道1—7分別為甲醇誘導(dǎo)后第1—7天的發(fā)酵上清液。

2.5 討論

黑曲霉葡萄糖氧化酶在面粉和飼料添加劑、葡萄糖酸及其鹽生產(chǎn)和生物傳感器等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，提高葡萄糖氧化酶的發(fā)酵效率以降低其生產(chǎn)成本對于該酶的生產(chǎn)和應(yīng)用具有重要意義。為了在畢赤酵母中高效表達(dá)黑曲霉葡萄糖氧化酶，分別構(gòu)建了組成型和誘導(dǎo)型表達(dá)葡萄糖氧化酶的畢赤酵母表達(dá)菌株，對畢赤酵母表達(dá)的葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)及糖基化進(jìn)行了研究分析，并通過高效表達(dá)菌株篩選和高密度發(fā)酵較大程度地提高了萄萄糖氧化酶的表達(dá)量。研究表明，黑曲霉葡萄糖氧化酶可在畢赤酵母中組成型和誘導(dǎo)型表達(dá)，該酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，50 ℃以上的溫度會引起該酶的快速失活，表明該酶的熱穩(wěn)定性較低。該酶在畢赤酵母中表達(dá)會產(chǎn)生約30 kDa的糖基化修飾，這與文獻(xiàn)[16-17]相一致。通過理性設(shè)計(jì)或定向進(jìn)化方法改造黑曲霉葡萄糖氧化酶以提高其熱穩(wěn)定性可為實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用過程提供耐熱性更高的酶，以減少該酶在使用中由于熱失活造成的酶活損失并拓展其應(yīng)用范圍[18-20]。

為了提高葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的發(fā)酵量，構(gòu)建了誘導(dǎo)型表達(dá)葡萄糖氧化酶的畢赤酵母工程菌株，得到了可在含有4 mg/mL G418的培養(yǎng)基上生長的菌株。研究表明，pPIC9K質(zhì)粒載體上含有G418抗性基因，通過G418抗生素篩選可獲得高效表達(dá)的含有多拷貝基因的工程菌株[21]。采用高密度發(fā)酵，甲醇添加量為2.5%條件下，葡糖糖氧化酶的表達(dá)量達(dá)到了較高酶量。與已報(bào)道葡萄糖氧化酶發(fā)酵水平相比該菌株具有較好的生產(chǎn)應(yīng)用前景[22]。

3 結(jié)論

本研究成功實(shí)現(xiàn)了黑曲霉葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中組成型表達(dá)，對純化后的葡萄糖氧化酶糖基化分析表明該酶在畢赤酵母中表達(dá)具有30 kDa左右的糖基化修飾，對葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。為了實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶的高效表達(dá)，構(gòu)建和篩選了誘導(dǎo)型表達(dá)葡萄糖氧化酶的高效發(fā)酵工程菌株并對發(fā)酵條件進(jìn)行了分析，為黑曲霉葡萄糖氧化酶的進(jìn)一步放大生產(chǎn)和研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。