基于NF-κB通路探討杜仲皮、葉醇提物對(duì)膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥性骨破壞的影響

張 妍，王健英，陳曉云，張 磊，袁 穎*

? 藥理與臨床 ?

基于NF-κB通路探討杜仲皮、葉醇提物對(duì)膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥性骨破壞的影響

張 妍1，王健英2，陳曉云3，張 磊2，袁 穎1*

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201203 3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院類風(fēng)濕科，上海 200032

研究杜仲皮、葉醇提物對(duì)膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠骨破壞的治療作用及機(jī)制。隨機(jī)選取6只雌性Wistar大鼠作為對(duì)照組，其余大鼠于背部多點(diǎn)及尾根部sc 0.1 mL牛II型膠原乳劑建立CIA模型，第14天將CIA大鼠隨機(jī)分為模型組，杜仲皮醇提物低、高劑量（2、4 g/kg）組，杜仲葉醇提物低、高劑量（2、4 g/kg）組及甲氨蝶呤（1 mg/kg）組，各給藥組ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)4周。觀察各組大鼠足腫脹情況；采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化；采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平；采用qRT-PCR法檢測(cè)各組大鼠脾臟中炎性因子如、TNF受體相關(guān)因子-6（TNF receptor-associated factor-6，）、、、mRNA表達(dá)，膝關(guān)節(jié)組織中破骨細(xì)胞標(biāo)志物如抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，）、活化T細(xì)胞的核因子c1（nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1，）、組織蛋白酶K（cathepsin K，）、原癌基因、核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，）mRNA表達(dá)，膝關(guān)節(jié)組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，）mRNA表達(dá)及成骨細(xì)胞標(biāo)志物如金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitor 1of metalloproteinases，）、骨鈣素（osteocalcin，、骨保護(hù)素（osteoprotegerin，）mRNA表達(dá)；采用Western blotting法檢測(cè)各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶α/β（phosphorylated inhibitor of NF-κB kinase α/β，p-Iκκα/β）、磷酸化NF-κB抑制蛋白α（phosphorylated inhibitor α of NF-κB，p-IκBα）、磷酸化p65（p-p65）蛋白表達(dá)情況。與模型組比較，杜仲皮、葉醇提物可顯著降低CIA大鼠足腫脹度（＜0.05、0.01）；改善踝關(guān)節(jié)組織病理；顯著降低CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6水平（＜0.01）；顯著降低CIA大鼠脾臟中、、、mRNA表達(dá)水平（＜0.05、0.01），顯著降低CIA大鼠膝關(guān)節(jié)組織中、、、、、、mRNA表達(dá)水平（＜0.01），顯著升高CIA大鼠膝關(guān)節(jié)組織中、、mRNA表達(dá)水平（＜0.05、0.01），顯著降低CIA大鼠膝關(guān)節(jié)組織中p-Iκκα/β、p-IκBα、p-p65蛋白表達(dá)水平（＜0.01）。杜仲皮、葉醇提物可以減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥，抑制促血管生成因子的表達(dá)，延緩關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨與骨的破壞，其機(jī)制與調(diào)控NF-κB通路相關(guān)的炎癥性骨代謝有關(guān)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；杜仲皮、葉醇提物；膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎；大鼠；炎癥；骨破壞

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性多關(guān)節(jié)炎癥和骨質(zhì)破壞為主的自身免疫疾病，其主要病理特征為滑膜炎性細(xì)胞增生、軟骨和骨破壞、關(guān)節(jié)畸形等。目前治療RA的藥物主要針對(duì)關(guān)節(jié)炎癥，研究發(fā)現(xiàn)，RA后期，即使滑膜炎癥已經(jīng)得到控制，但骨質(zhì)的破壞仍可造成關(guān)節(jié)不可逆損傷[1]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor- κB，NF-κB）位于細(xì)胞質(zhì)中，與NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）結(jié)合為非活性復(fù)合物，炎性狀態(tài)下IκB蛋白降解，NF-κB被釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，調(diào)控炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）轉(zhuǎn)錄，激活多個(gè)炎癥信號(hào)。關(guān)節(jié)內(nèi)的巨噬細(xì)胞可分泌大量炎性細(xì)胞因子，激活NF-κB通路，導(dǎo)致大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，加劇軟骨損傷[2]。

中醫(yī)常選用具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、活血化瘀等功效的藥物治療RA，既能抗炎、鎮(zhèn)痛，也能抑制自身免疫應(yīng)答的發(fā)生并調(diào)節(jié)全身免疫系統(tǒng)。杜仲具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，常用于治療肝腎虧虛、腰膝酸痛。杜仲的活性成分具有降血壓、提高免疫功能、抗衰老、抗炎、抗腫瘤、利尿等作用[3-5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲皮醇提物體外可抑制人RA滑膜細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡；體內(nèi)可降低膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型足腫脹及關(guān)節(jié)炎評(píng)分、改善滑膜炎癥浸潤(rùn)、減輕血管翳形成[6]。杜仲皮作為杜仲的傳統(tǒng)入藥部位，藥源日趨緊缺。本研究探究杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠骨破壞的治療作用及機(jī)制，為杜仲皮、葉等藥用部位應(yīng)用于RA的治療提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雌性Wistar大鼠42只，體質(zhì)量（120±10）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2016-0011。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)PZSHUTCM18122823）。

1.2 藥材

杜仲皮、葉（批號(hào)分別為180915、20181116）購(gòu)于上?？禈蛑兴庯嬈?，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)吳靳榮教授鑒定為杜仲科植物杜仲Oliv.的干燥樹皮及葉。

1.3 藥品與試劑

甲氨蝶呤（2.5 mg/片，批號(hào)036170604）購(gòu)自上海上藥信誼藥廠有限公司；Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；RNA提取試劑盒、4×Reverse Transcription Master Mix、2×SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)EZBioscience公司；引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、牛血清白蛋白購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購(gòu)自瑞士Roche公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白上樣緩沖液、三色預(yù)染蛋白Marker、超敏發(fā)光液購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自武漢ABclonal公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、磷酸化p65（p-p65）、磷酸化IκBα（p-IκBα）、磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶α/β（phosphorylated inhibitor of NF-κB kinase α/β，p-Iκκα/β）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.4 儀器

低速臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Eppeddorf公司）；正置顯微鏡（日本Olympus公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；YLS-7A足趾容積測(cè)量?jī)x（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；RM2265全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 杜仲皮、葉醇提物的制備

分別精確稱取200 g干燥杜仲皮、葉粉末，加入70%乙醇，加熱回流提取，真空干燥。杜仲皮、葉醇提物臨用前分別以蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為0.5、1.0 g/mL（以生藥量計(jì)）的溶液，分別用作杜仲皮、葉醇提物低、高劑量組[6-9]。

2.2 CIA大鼠模型制備、分組與給藥

牛II型膠原蛋白溶于0.1 mol/L醋酸，與等體積完全弗氏佐劑乳化，制成穩(wěn)定的乳劑（10 mg/mL）。隨機(jī)選取6只大鼠作為對(duì)照組，其余大鼠于背部多點(diǎn)及尾根部sc 0.1 mL乳劑，對(duì)照組大鼠于同部位sc等體積生理鹽水，記為第0天；第7天，大鼠尾根部sc 0.1 mL乳劑，加強(qiáng)免疫。第14天大鼠CIA模型成功建立，按照文獻(xiàn)報(bào)道方法[10]，將CIA大鼠隨機(jī)分為模型組，杜仲皮醇提物低、高劑量（2、4 g/kg，EB-2、EB-4）組，杜仲葉醇提物低、高劑量（2、4 g/kg，EL-2、EL-4）組及甲氨蝶呤（1 mg/kg）組，每組6只。各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)4周。

2.3 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠足容積和關(guān)節(jié)炎評(píng)分的影響

每7天用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠足容積，并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分。關(guān)節(jié)炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)腫脹、紅腫；1分為跗骨或踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫；2分為從腳踝到跗骨出現(xiàn)腫脹和發(fā)紅；3分為從腳踝到跖骨關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫；4分為腳踝、跗骨和跖骨周圍紅腫[11]。

2.4 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠血清炎癥因子水平的影響

給藥結(jié)束后，烏拉坦麻醉大鼠，采用腹主動(dòng)脈取血，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平。

2.5 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化的影響

大鼠脫頸椎處死，取各組大鼠踝關(guān)節(jié)，于4%多聚甲醛中固定24 h，10%乙二胺四乙酸脫鈣、石蠟包埋后切片（厚4 mm）；蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察各組大鼠踝關(guān)節(jié)的滑膜炎癥、血管醫(yī)形成及骨破壞情況并評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、無(wú)血管翳形成、無(wú)骨破壞；1分為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或輕微水腫、少量血管翳形成、骨輕度破壞；2分為炎性細(xì)胞中等浸潤(rùn)、大量血管翳形成、骨中度破壞；3分為炎性細(xì)胞嚴(yán)重浸潤(rùn)、關(guān)節(jié)腔狹窄；4分為血管翳形成、骨重度破壞[9]。

2.6 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠脾臟及膝關(guān)節(jié)中炎癥因子和骨代謝因子mRNA表達(dá)的影響

取各組大鼠脾臟及膝關(guān)節(jié)，按照試劑盒說(shuō)明書提取RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析，檢測(cè)大鼠脾臟中、、、及膝關(guān)節(jié)中抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，）、TNF受體相關(guān)因子-6（TNF receptor-associated factor-6，）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，、活化T細(xì)胞的核因子c1（nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，）、組織蛋白酶K（cathepsin K，）、原癌基因、核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，）、金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitor 1 of metalloproteinases，）、骨鈣素（osteocalcin，、骨保護(hù)素（osteoprotegerin，）mRNA表達(dá)情況。qRT-PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸90 s。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.7 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取20 mg各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑）于冰上研磨，提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉，分別加入p-Iκκα/β、p-IκBα、p-p65抗體（1∶1000），于4 ℃孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶5000），于室溫孵育2 h，加入超敏發(fā)光液，采用蛋白凝膠電泳成像儀曝光，Image軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠足容積和關(guān)節(jié)炎評(píng)分的影響

如圖1-A所示，與對(duì)照組比較，自第14天造模大鼠足容積顯著升高（＜0.01），踝關(guān)節(jié)紅腫明顯、變形嚴(yán)重，表明CIA模型制備成功；與模型組比較，自第28天，各給藥組大鼠足容積顯著降低（＜0.01），關(guān)節(jié)腫脹程度均減輕。如圖1-B所示，與對(duì)照組比較，自第14天造模大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，自第21天，各給藥組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著降低（＜0.05、0.01）。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ## P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.2 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化的影響

如圖2所示，對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)組織未見(jiàn)明顯病理性改變；模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨變性壞死，纖維組織增生，關(guān)節(jié)腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分骨及骨小梁壞死；EB-2組大鼠關(guān)節(jié)軟骨部分變性壞死，血管翳形成，纖維組織、滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；EB-4組大鼠關(guān)節(jié)組織少量關(guān)節(jié)滑膜變性壞死，血管翳形成，滑膜增生；EL-2組大鼠關(guān)節(jié)滑膜變性壞死，纖維組織增生，關(guān)節(jié)腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，滑膜增生，部分骨及骨小梁壞死；EL-4組大鼠關(guān)節(jié)軟骨部分變性壞死，血管翳形成，滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；甲氨蝶呤組關(guān)節(jié)組織關(guān)節(jié)腔內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少量滑膜增生。如圖3所示，與模型組比較，各給藥組病理評(píng)分均顯著降低（＜0.01）。

白色箭頭表示滑膜增生及血管翳；黑色箭頭表示軟骨侵蝕

圖3 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化的影響 ()

3.3 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠血清炎癥因子水平的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平均明顯降低（＜0.01），表明杜仲皮、葉醇提物可以降低CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6等炎癥因子水平，對(duì)炎癥具有一定的抑制作用。

3.4 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠脾臟中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟中、、、mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，除EL-2組大鼠脾臟中僅、、mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），其余給藥組大鼠脾臟中、、、mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）。

3.5 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)中骨代謝因子mRNA表達(dá)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中血管新生相關(guān)因子如、及破骨細(xì)胞標(biāo)志物如、、、、mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01），成骨標(biāo)志物如、mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中血管新生相關(guān)因子如、及破骨細(xì)胞標(biāo)志物如、、、、mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），EB-2組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中、mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），EB-4組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中、、mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），EL-2組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），EL-4組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中、、mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖4 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠血清中TNF-α (A) 和IL-6 (B) 水平的影響()

圖5 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠脾臟中TNF-α (A)、IL-1β (B)、TRAF-6 (C) 和IL-17 (D) mRNA表達(dá)的影響 ()

3.6 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)組織NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖7、8所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)組織NF-κB通路中p-Iκκα/β、p-IκBα、p-p65蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中p-IκBα、p-p65蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），EB-4、EL-4組大鼠膝關(guān)節(jié)組織中p-Iκκα/β蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。

4 討論

RA是一種以慢性多關(guān)節(jié)炎癥和骨破壞為主的自身免疫疾病，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA屬于“痹病”范疇，風(fēng)寒濕邪導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)閉阻為標(biāo)，肝腎虧虛為本。杜仲具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，在增強(qiáng)免疫、降血壓、抗骨質(zhì)疏松、抗炎和抗衰老等方面有一定的作用[3]。

圖6 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)中VEGF (A)、HIF-1 (B)、NFATc1 (C)、TRAP (D)、c-Fos (E)、CTSK (F)、RANKL (G)、TIMP1 (H)、OCN (I) 和OPG (J) mRNA表達(dá)的影響()

圖7 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)中NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖8 杜仲皮、葉醇提物對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)中NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響()

杜仲葉與杜仲皮具有相似的化學(xué)成分和臨床功效。研究表明，杜仲葉具有抗骨質(zhì)疏松、抑菌和抗氧化的藥理作用[12]；杜仲葉總提取物可以改善骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）模型動(dòng)物骨代謝，增加骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物的骨密度，加強(qiáng)骨穩(wěn)定、減少骨破壞，可有效防治骨質(zhì)疏松癥[13]；杜仲葉提取物/磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）復(fù)合載體具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、黏附的作用[14]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲皮對(duì)CIA模型大鼠具有良好的治療作用，但杜仲葉與杜仲皮藥理作用的一致性尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠關(guān)節(jié)紅腫、踝關(guān)節(jié)畸形，與RA臨床表現(xiàn)相似；杜仲皮、葉明顯減輕CIA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度，減輕關(guān)節(jié)軟骨部分壞死，減少血管翳形成，抑制炎細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織及滑膜增生，表明杜仲皮與杜仲葉可有效抑制CIA大鼠模型關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善關(guān)節(jié)病理特征。

TNF-α、IL-1β、IL-6由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在RA的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。TNF-α、IL-1β可激活NF-κB，從而激活內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生因子生成，為炎癥細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧，促進(jìn)其向炎癥組織浸潤(rùn)。IL-6可刺激中性粒細(xì)胞遷移，促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟，促進(jìn)VEGF生成，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致血管炎、滑膜炎和關(guān)節(jié)破壞[15]。TNF和IL-6受體阻斷劑可有效延緩RA骨侵蝕[16]。本研究結(jié)果顯示，杜仲皮、葉醇提物可顯著降低CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6水平及脾臟中、、、mRNA表達(dá)水平及膝關(guān)節(jié)中、mRNA表達(dá)水平，表明杜仲的抗炎作用可能與抑制促炎因子的產(chǎn)生及血管新生有關(guān)。

炎性狀態(tài)下，IκB蛋白降解，NF-κB被釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，炎癥因子的增加激活I(lǐng)κκ、IκB、p65使之磷酸化，從而調(diào)節(jié)一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[2]。NF-κB信號(hào)通路與RA血管新生有關(guān)，在破骨細(xì)胞中，NF-κB介導(dǎo)RANKL誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)[17]。NF-κB的激活增加了HIF-1α啟動(dòng)子的活性，從而增加了HIF-1α表達(dá)[18]。破骨細(xì)胞是來(lái)源于單核細(xì)胞系的巨大多核細(xì)胞，是唯一能夠在體內(nèi)吸收骨的細(xì)胞，可通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的相互作用來(lái)吸收骨基質(zhì)。RA中，RANKL激活NF-κB信號(hào)，破骨細(xì)胞合成的基質(zhì)酶如CTSK、TRAP等可降解骨基質(zhì)，加劇骨侵蝕[19]。本研究結(jié)果顯示，杜仲皮、葉醇提物可顯著降低CIA大鼠膝關(guān)節(jié)中p-Iκκα/β、p-IκBα、p-p65蛋白表達(dá)水平，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活；杜仲皮、葉醇提物可顯著降低CIA大鼠膝關(guān)節(jié)中、、、、mRNA表達(dá)水平，升高成骨細(xì)胞標(biāo)志物、mRNA表達(dá)水平，表明杜仲皮、葉醇提物可抑制破骨細(xì)胞成熟及骨基質(zhì)降解，對(duì)骨代謝有一定的調(diào)節(jié)作用，杜仲皮、葉醇提物可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)改善CIA大鼠模型的炎癥性骨破壞。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）參與組織的重塑、修復(fù)及血管生成等，受TIMP調(diào)節(jié)，骨關(guān)節(jié)炎、RA等疾病發(fā)生時(shí)，MMPs蛋白表達(dá)升高，與TIMP的平衡被打破[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)中mRNA表達(dá)水平降低，杜仲皮、葉醇提物可上調(diào)mRNA表達(dá)水平，表明杜仲皮、葉醇提物對(duì)關(guān)節(jié)炎有一定的改善作用，課題組后續(xù)將進(jìn)一步研究杜仲皮、葉醇提物對(duì)MMPs的影響。

綜上所述，杜仲皮、葉醇提物可以減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥，抑制促血管生成因子的表達(dá)，延緩關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨與骨的破壞，其機(jī)制與調(diào)控NF-κB通路相關(guān)的炎癥性骨代謝有關(guān)。在改善炎癥性骨破壞方面，杜仲皮與杜仲葉有著相似的作用，杜仲葉在一定程度上可替代杜仲皮用于治療RA。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects of ethanol extracts of barks and leaves fromon inflammatory bone destruction in collagen-induced arthritis rats based on NF-κB pathway

ZHANG Yan1, WANG Jian-ying2, CHEN Xiao-yun3, ZHANG Lei2, YUAN Ying1

1. School of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. Shanghai Innovation Center of TCM Health Service, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 3. Shanghai Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China

To study the therapeutic effect and mechanism of alcohol extract of barks and leaves from Duzhong ()on bone destruction of collagen-induced arthritis (CIA) rats.Six female Wistar rats were randomly selected as control group, the rest of rats were sc 0.1 mL bovine type Ⅱ collagen emulsion at multiple points on back and tail to establish CIA model. On 14th day, CIA rats were randomly divided into model group, alcohol extract of barks fromlow- and high-dose (2 and 4 g/kg) groups, alcohol extract of leaves fromlow- and high-dose (2 and 4 g/kg) groups, and methotrexate (1 mg/kg) group, rats were ig corresponding drugs, once a day for 4 weeks. Foot swelling situation of each group was observed. Hematoxylin-eosin (HE) staining method was used to observe the pathological changes of ankle joint in each group of rats. Levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in serum were detected by ELISA. qRT-PCR was used to detect mRNA levels of inflammatory factors such as, TNF receptor related factor-6 (),,, andin spleen, osteoclast markers such as tartrate resistant acid phosphatase (), nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1 (), cathepsin K (), proto-oncogene, and receptor activator of NF-κB ligand () mRNA expressions, vascular endothelial growth factor (), and hypoxia inducible factor-1 () mRNA expressions, and osteoblast markers such as tissue inhibitor 1 of metalloproteinases (), osteocalcin () and osteoprotegerin () mRNA expressions in knee joints; Western blotting was used to detect expressions of phosphorylated inhibitory of NF-κB kinase α/β (p-Iκκα/β), phosphorylation inhibitor α of NF-κB (p-IκBα), phosphorylated p65 (p-p65) in knee joints.Compared with model group, swelling of feet was significantly reduced (< 0.05, 0.01), pathology of ankle joint was improved, levels of TNF-α and IL-6 in serum were significantly reduced (< 0.01),,,,mRNA levels in spleen were significantly reduced (< 0.05, 0.01),,,,,,,mRNA levels in knee joints were significantly reduced (< 0.01),,,mRNA levels in knee joints were significantly increased (< 0.05, 0.01), expressions of p-Iκκα/β, p-IκBα, and p-p65 in knee joints were significantly reduced (< 0.01) in alcohol extract of barks and leaves fromgroups.Barks and leaves fromcan relieve joint inflammation in CIA rats, inhibit expressions of pro-angiogenic factors, and delay the destruction of cartilage and bone in the joints, of which mechanism is related to the regulation of inflammatory bone metabolism related to NF-κB pathway.

rheumatoid arthritis; alcohol extract of barks and leaves fromOliv.; collagen-induced rheumatoid arthritis; rats; inflammation; bone destruction

R285.5

A

0253 - 2670(2021)06 - 1645 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.012

2020-11-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81773922）；上海自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（19ZR1452000）

張 妍（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幖皬?fù)方藥效作用機(jī)制研究。E-mail: ZY180629@163.com

袁 穎，女，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幖皬?fù)方藥效作用機(jī)制研究。Tel: 18621174662 E-mail: yyin921@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]