基于2種色譜-質譜聯用技術的參芪降糖顆?；瘜W成分分析

王 倩，李冰冰，黃文靜，程國良，王樂琪，肖 雪，嚴詩楷

基于2種色譜-質譜聯用技術的參芪降糖顆?；瘜W成分分析

王 倩1, 4，李冰冰2*，黃文靜1, 4，程國良2，王樂琪1, 4，肖 雪1, 4，嚴詩楷1, 3, 4*

1. 廣東藥科大學中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006 2. 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276000 3. 上海交通大學藥學院，上海 200240 4. 廣東省代謝病中西醫(yī)結合研究中心，廣東 廣州 510006

基于UPLC-Q/TOF MS和GC-MS法分析參芪降糖顆粒的化學成分。參芪降糖顆粒甲醇提取液采用Zorbax RRHD SB C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，體積流量0.3 mL/min。電噴霧離子源正負離子模式下對色譜流出物進行質譜檢測，利用Peakview軟件，根據二級質譜信息及文獻，對主要色譜峰進行鑒定分析。參芪降糖顆粒揮發(fā)性成分分析采用HP-5MS毛細管柱（60 m×250 μm×0.25 μm），程序升溫，EI離子源，質量掃描范圍/25～500。GC-MS分析通過NIST 2014標準譜庫檢索并結合文獻對參芪降糖顆粒中揮發(fā)性成分進行快速鑒定。參芪降糖顆粒中共鑒定出132個非揮發(fā)性成分和86個揮發(fā)性成分。提供了一種快速、有效、全面系統地對參芪降糖顆粒的化學成分進行定性分析的方法，為參芪降糖顆粒藥效物質基礎研究、二次開發(fā)、質量控制、藥理作用機制研究等奠定基礎。

參芪降糖顆粒；化學成分；UPLC-Q/TOF MS；GC-MS；定性分析

參芪降糖顆粒是由人參莖葉總皂苷、黃芪、五味子、山藥等11味中藥，經一系列現代生產工藝制備的中藥復方制劑，具有益氣養(yǎng)陰、滋脾補腎的功效，臨床上常用于治療2型糖尿病[1]。目前，參芪降糖顆粒的研究多以統計和觀察臨床數據為主，關于參芪降糖顆粒的化學成分研究較少，張慧等[2]采用液質聯用技術鑒定出98個化合物，主要包括皂苷、黃酮、木脂素等非揮發(fā)性化學成分，未對其揮發(fā)性成分開展研究。其余研究多局限于單一藥材或個別成分的定性定量研究，缺乏整體認識。中藥物質基礎研究是闡明中藥整體功效及其作用機制的核心環(huán)節(jié)，也是深層次開發(fā)中藥方劑、改進工藝和劑型、制定質量標準、提高臨床療效的重要基礎。因此，有必要更加全面系統地開展參芪降糖顆粒的物質基礎分析研究。

中成藥多為復方制劑，其化學成分繁多，需采用快速、分離度好、準確性高的分析儀器進行成分分析與鑒定。近年來，超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜（UPLC-Q/TOF MS）和氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）等色譜-質譜聯用技術憑借其具有的高分離性、高分辨率以及高靈敏度等優(yōu)勢，在不需要對照品的情況下能提供化合物的結構表征所需的精確質量數、元素組成、質譜碎片等信息，在中藥非揮發(fā)性成分和揮發(fā)性成分的定性檢測方面得到了廣泛應用[3-4]。本研究擬采用UPLC-Q/TOF MS和GC-MS 2種儀器和技術對參芪降糖顆粒的化學成分進行全面定性分析，以期為參芪降糖顆粒的質量控制、二次開發(fā)、工藝改進及其藥理作用機制等研究提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB Sciex Q/TOF MS質譜儀（Analyst1.6工作站，美國AB Sciex公司）；Agilent 7890B-5977A氣相色譜質譜聯用儀（美國Agilent公司，配備7890B GC分離系統，5977A MSD檢測器，Mass Hunter 工作站）；ZDHW型電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；PL2002電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；ELGA超純水機（法國威立雅集團）。

1.2 試劑及藥物

甲醇和乙腈（質譜級，德國Merck公司）；參芪降糖顆粒（生產批號01190551，魯南厚普制藥有限公司）；正己烷（分析純，天津科密歐化學試劑公司），無水硫酸鈉（天津市致遠化學試劑有限公司），超純水（自制）。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

2.1.1 UPLC-Q/TOF MS供試品溶液制備 精密稱取參芪降糖顆粒3.000 g，加甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，超聲提取1 h，得參芪降糖顆粒甲醇提取液，3000 r/min離心10 min后，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.1.2 GC-MS供試品溶液制備 稱取參芪降糖顆粒300 g，置于水蒸氣蒸餾裝置內，加熱提取6 h后，收集餾出液，加入2 mL正己烷萃取油狀物，加入適量的無水硫酸鈉靜置過夜，吸取上清液，即得。

2.2 色譜-質譜聯用條件

2.2.1 UPLC-Q/TOF MS分析條件

液相色譜條件：Zorbax RRHD SB C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，5% B；3～18 min，5%～25% B；18～30 min，25%～42% B；30～40 min，42%～60% B；40～50 min，60%～85% B；50～55 min，85%～95% B；55～60 min，95% B；柱溫30 ℃，體積流量0.3 mL/min，進樣量5 μL。

質譜條件[5]：電噴霧離子源分別在正負模式下進行檢測，掃描時間0.08 s；采集時間60 min；TOF/ MS掃描范圍/100～2000；Product Ion掃描范圍50～1500；霧化氣體積流量50 mL/min；脫溶劑氣流速50 mL/min；氣簾氣體積流量35 mL/min；脫溶劑氣溫度500 ℃；離子噴霧電壓5500 V；去簇電壓80 V/?80 V；碰撞能10 V/?10 V；動態(tài)背景扣除模式；質譜漂移范圍5×104。

2.2.2 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：HP-5MS毛細管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；載氣為氦氣，體積流量1.0 mL/min，分流進樣，分流比為5∶1；進樣口溫度為260 ℃；程序升溫：起始溫度為50 ℃，以4 ℃/ min升溫至130 ℃，保持5 min；以3℃/min升溫至175 ℃，保持15 min；以7 ℃/min升溫至210 ℃，保持5 min；以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持3 min；進樣量1 μL。

質譜條件：電子轟擊電離（EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲時間5 min，全掃描采集模式，掃描范圍/25～550。

3 結果

3.1 非揮發(fā)性成分

按照“2.1.1”項的方法制備供試品溶液，在“2.2.1”的分析條件下進樣，參芪降糖顆粒中非揮發(fā)性成分在正離子和負離子模式采集的基峰圖（base peak chromatogram，BPC）見圖1。將采集的數據導入Peakview 1.2（Analyst1.6工作站，AB Sciex公司，美國），選擇BPC，Mass tolerance 0.4，根據各保留時間下化合物的/值，利用軟件中Formula Finder功能計算化合物的分子離子類型，將可能的化合物結構信息的mol文件導入Peakview 1.2并與化合物的Product Ion進行比對鑒定，同時結合化學鍵斷裂規(guī)律及文獻數據確定化合物結構。參芪降糖顆粒非揮發(fā)性成分中共鑒定出132種化合物，結果見表1。復方參芪降糖顆粒的成分歸屬可知，來源于人參（23個）、黃芪（17個）、茯苓（27個）、澤瀉（19個）、五味子（15個）的成分相對較多，來源于地黃（10個）、麥冬（9個）、天花粉（3個）、枸杞子（7個）、覆盆子（9個）、山藥（8個）等藥材的成分較分散，其中包括某些成分存在于多種藥材中，例如甜菜堿等成分來源于黃芪、枸杞子，鳥苷、尿苷等成分在人參、黃芪、麥冬、地黃等藥材中均含有。進一步對主要成分質譜裂解規(guī)律與結構解析進行總結。

圖1 參芪降糖顆粒BPC圖譜

表1 參芪降糖顆粒UPLC-Q/TOF MS分析

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

3.1.1 人參皂苷Rg1在ESI＋模式下，保留時間為25.373 min，人參皂苷Rg1的相對分子質量為800.492 1，其多級質譜顯示具有/441.369 4、423.359 0、405.347 9的特征碎片離子，人參皂苷Rg1在正離子模式[M＋H]+下/801.343 1裂解過程中，首先失去1分子葡萄糖后產生/621.432 9 [C36H60O8]+，繼而裂解失去1分子水產生603.416 4 [C36H58O7]+，該離子進一步裂解失去1分子水產生/559.380 1 [C36H56O6]+，同時，/621.432 9 [C36H60O8]+失去1分子葡萄糖產生/441.369 4 [C30H48O2]+，繼而裂解失去1分子水產生/423.359 0 [C30H46O6]+，該離子進一步裂解失去1分子水產生/405.347 9 [C30H44]+，故鑒定為人參皂苷Rg1，其結構解析過程見圖2。

3.1.2 毛蕊花糖苷 在ESI?模式下，保留時間為14.30 min，準分子離子峰為/623.196 6 [M－H]?，該準分子離子在進一步的MS/MS裂解過程中，在芳烴與葡萄糖間的碳氧鍵斷裂產生/461.164 8 [C20H29O12]?和/161.024 1 [C9H5O3]?，/161.024 1 [C9H5O3]?進一步裂解產生/133.027 6 [C8H5O2]?，故鑒定為毛蕊花糖苷，其結構解析過程見圖3。

3.1.3 茯苓酸 在ESI+模式下，保留時間為28.222 min，準分子離子峰為/529.348 9 [M＋H]+，該離子的多級質譜顯示具有/469.324 1、451.316 0、433.312 1的碎片離子。該準分子離子裂解失去1個羧甲基產生/469.324 1 [C31H49O3]+，進一步失去1分子水產生/451.316 0 [C31H47O2]+，同時準分子離子/529.348 9 [M＋H]+失去C7H12的取代基產生/433.312 1 [C26H41O5]+，故鑒定為茯苓酸，其結構解析過程見圖4。

圖2 人參皂苷Rg1結構解析過程

圖3 毛蕊花糖苷結構解析過程

3.1.4 黃芪紫檀烷苷 在ESI+模式下，保留時間為19.60 min，/為482.197 3。該基峰離子/482.197 3 [M＋NH4]+比較容易失去1分子葡萄糖產生/303.120 1 [C17H19O5]+離子，繼而失去黃烷基的母核產生/167.070 0 [C9H11O3]+，進一步裂解產生/123.043 5 [C7H7O2]+，故鑒定為黃芪紫檀烷苷，其結構解析過程見圖5。

3.2 揮發(fā)性成分

按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項分析條件進樣分析，得到參芪降糖顆粒中揮發(fā)性成分的總離子流圖（圖6）。所得數據經美國國家標準與技術研究所數據庫（National Institute of Standards and Technology，NIST2014）質譜數據庫檢索匹配，采用峰面積歸一化法計算相對含量（表2）。參芪降糖顆粒揮發(fā)油中共定性出86種化學成分，占已分離總組分相對含量的80.7%。從表2中可看出，參芪降糖顆粒中主要揮發(fā)性成分為酮類（9種，27.31%）、烴類（34種，21.2%）、醇類（15種，21.8%）、醛類（17種，5.49%）、酯類（5種，3.02%）、脂肪酸類（3種，0.89%）、酚類（2種，0.86%）、雜環(huán)類（1種，0.13%）等，其中含量較高的成分為長葉松香芹酮（19.88%）、衣蘭烯醇（7.83%）、γ-杜松烯（0.85%）等來源于五味子，橙花叔醇（2.33%）來源于人參、茯苓，α-畢橙茄醇（2.1%）來源于人參，α-紫羅酮（1.11%）來源于地黃，亞油酸乙酯（1.02%）來源于人參、澤瀉，花側柏烯（0.85%）來源于人參、五味子，棕櫚酸乙酯（1.16%）、棕櫚酸（0.74%）來源于茯苓、麥冬、澤瀉。

圖4 茯苓酸結構解析過程

圖5 黃芪紫檀烷苷結構解析過程

圖6 參芪降糖顆粒中揮發(fā)性成分的總離子流圖

表2 參芪降糖顆粒中揮發(fā)性成分分析結果

續(xù)表2

4 討論

參芪降糖顆粒是由人參（莖葉）皂苷、黃芪等11味中藥按照“君臣佐使”配伍而成的復方制劑。方中人參、黃芪為君藥，益氣養(yǎng)陰，生津止渴。地黃、麥冬、天花粉為臣藥，清熱育陰，生津潤燥，與人參、黃芪相配伍，不溫不燥，益氣養(yǎng)陰、清熱潤燥而止渴。枸杞子、五味子、覆盆子共為佐藥，封固腎關，不使精微下流，與君臣相協同，補腎攝精，肝腎兩益。山藥、茯苓、澤瀉為使藥，健脾養(yǎng)胃，固腎滲濕。君臣佐使，相互配合，共成氣陰兩補、肺脾肝腎同治之方。本研究利用UPLC-Q/TOF MS技術對參芪降糖顆粒中的非揮發(fā)性化學成分進行研究，共鑒定出132種化合物，主要包括皂苷類、黃酮類、木脂素類等。與張慧等[2]采用UPLC-Q-TOF MS/MS法分析參芪降糖顆粒的化學成分相比較，在其基礎上，所鑒定的化學成分數量更多，進一步豐富了參芪降糖顆粒的物質基礎研究。研究發(fā)現人參中的人參皂苷Rb1可增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，同時可通過上調葡萄糖轉運體的表達，促進葡萄糖的消耗，調節(jié)糖代謝紊亂[37-38]。人參皂苷Rg1可通過降低炎癥因子的表達，抑制炎癥反應以延緩糖尿病腎病的進展[39]。人參皂苷Re也被證實可以改善糖尿病癥狀，降低糖尿病大鼠的血糖水平[40]。黃芪中的黃芪甲苷通過抑制肝葡萄糖原磷酸化酶（GP）和葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性，調節(jié)血糖水平[41]。另有研究發(fā)現黃芪甲苷能夠降低模型小鼠的血清總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）水平，調節(jié)體內瘦素（leptin）敏感性和產熱網絡系統[42]。黃芪總黃酮及黃芪多糖能夠清除自由基發(fā)揮抗氧化作用，且清除能力與濃度有明顯的依賴關系[43]。澤瀉中的澤瀉醇B 23-乙酸酯和澤瀉倍半萜成分能夠抑制巨噬細胞RAW264.7在γ-干擾素和脂多糖誘導下合成NO的活性，通過抑制一氧化氮合酶（誘導酶）（inducible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA的表達發(fā)揮作用的，進而發(fā)揮抗炎作用[44]。五味子中的五味子乙素通過清除自由基和抗脂質過氧化而發(fā)揮抗氧化作用[45-46]。地黃中的梓醇能降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠血糖，并呈劑量依賴性，其作用機制是通過促進β-內啡肽的釋放，提高葡萄糖轉運率，抑制糖異生[47]。以上研究結果表明參芪降糖顆?？赡芡ㄟ^調控胰島素抵抗、氧化應激、炎癥反應等來發(fā)揮治療糖脂代謝紊亂性疾病的作用。

采用GC-MS技術鑒定出參芪降糖顆粒中86個揮發(fā)性成分，包括烴類、醇類、醛類、酚酸類、木脂素、脂肪酸類等。研究發(fā)現，長葉松香芹酮、β-雪松烯、花側柏烯、γ-杜松烯、衣蘭烯醇、去氫白菖烯等揮發(fā)性成分來自五味子[31-33]，五味子揮發(fā)油具有保肝降酶、調血脂的作用[48]。另有研究表明參芪降糖顆粒揮發(fā)性成分中的脂肪酸類和酯類成分，也可能是其藥效成分。亞油酸和α-亞麻酸屬于多不飽和脂肪酸的n-6（ω-6）和n-3系列，是必需脂肪酸，它們大部分是從飲食中獲得，不在人體內合成，必需脂肪酸依賴于雙鍵所發(fā)揮的抗氧化活性調節(jié)低密度脂蛋白代謝，維持體內脂質平衡，改善血管內皮功能，并有助于降低血壓，改善血小板敏感性和血清三酰甘油水平[49-52]。棕櫚酸對糖尿病和心腦血管疾病等具有生理調節(jié)作用，已有研究表明棕櫚酸可以緩解多種代謝疾病如肥胖、高血脂、高血糖等[53-54]。亞油酸乙酯具有降低血清膽固醇和低密度脂蛋白的作用，主要用于預防和治療動脈粥樣硬化、心絞痛等心血管疾病[55]。以上研究結果表明參芪降糖顆粒中的揮發(fā)性成分，也是其治療糖脂代謝紊亂性疾病的關鍵藥效成分，且這些藥效成分可能通過作用于脂肪酸代謝通路來發(fā)揮降糖調脂作用。

參芪降糖顆粒作為一種復方制劑，其化學成分非常復雜，在體內以何種成分、何種形式發(fā)揮藥物作用以及作用機制如何尚不明確。近年來血清藥物化學和腸道菌群在闡明中藥藥效物質基礎及探討其藥理作用機制的研究中得到廣泛的應用。朱寶玉等[56]發(fā)現人參皂苷Rb1、Re、Rg2及三七皂苷Fe、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素等成分為血中移行成分，研究表明此類成分能夠增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，降低血糖水平[37-40]。竇志華等[57]研究發(fā)現五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、戈米辛N、五味子乙素等是五味子的血中藥源性成分。另有研究表明，許多中藥療效的發(fā)揮與人體腸道微環(huán)境的改變有密切關系，或是中藥可直接調整腸道菌群結構進而影響健康，亦或腸道菌群影響口服中藥在體內的吸收、代謝、轉化等而改變中藥療效的發(fā)揮。體外實驗表明枸杞子、地黃、黃芪等補益類中藥對雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌具有促進作用，從而改善腸道菌群失調[58]。近年來研究發(fā)現糖尿病的發(fā)生可能與腸道菌群失調有關，如皂苷類成分一般需要經過腸道菌代謝轉化為苷元發(fā)揮降血糖、降血脂等藥理活性。陳新梅[59]研究發(fā)現人參皂苷Rg1在大鼠腸內菌所分泌的水解皂苷糖基的酶類如β-葡萄糖苷酶作用下，0～12 h內的代謝產物為一對同分異構體人參皂苷Rh1及人參皂苷F1，12～24 h內的代謝產物為苷元Rpt；代謝產物的極性小于人參皂苷Rg1。沈嵐等[60]研究發(fā)現麥冬皂苷可被大鼠腸內菌群代謝為薯蕷皂苷元入血。

綜上所述，參芪降糖顆粒的分析鑒定結果，可為進一步研究不同化學成分的藥理作用機制以及活性成分間的相互作用奠定基礎。

5 結論

本研究建立的UPLC-Q/TOF MS和GC-MS分析方法較為全面地表征了參芪降糖顆粒的化學成分，為參芪降糖顆粒的二次開發(fā)、組方配伍、藥理機制等提供了較好的研究基礎。但本研究分析主要集中于化學成分的鑒定分析上，未開展入血成分、藥效物質基礎研究等。故今后應借助這一分析技術進一步完善參芪降糖顆粒的藥效物質基礎研究，同時，結合血清藥物化學、網絡藥理學、代謝組學以及宏基因組學等技進一步闡明參芪降糖顆粒改善糖脂代謝紊亂性疾病的作用機制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis of chemical constituents of Shenqi Jiangtang Granule based on UPLC-Q/TOF MS and GC-MS

WANG Qian1,4, LI Bing-bing2, HUANG Wen-jing1,4, CHENG Guo-liang2, WANG Le-qi1,4, XIAO Xue1,4, YAN Shi-kai1,3,4

1. Institute of Chinese Medicine Sciences, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Linyi 276000, China 3. School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China 4. Guangdong Metabolic Disease Research Center of Integrated Chinese and Western Medicine, Guangzhou 510006, China

To study the chemical constituents of Shenqi Jiangtang Granule (參芪降糖顆粒) based on UPLC-Q/TOF MS and GC-MS.The methanol extract of Shenqi Jiangtang Granule was separated on Zorbax RRHD SB C18column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), and the gradient elution of acetonitrile-water was used as mobile phase at a flow rate of 0.3 mL/min. The chromatographic effluent was detected by mass spectrometry under the positive and negative ion modes of the ESI source. According to the cleavage fragments of MS/MS and literaturea, the main chromatographic peaks were identified by Peakview software. Composition analysis of volatile oil from Shenqi Jiangtang Granule was performed by HP-5MS column (60 m × 250 μm × 0.25 μm), with programmed temperature and EI ion source, and the mass scanning range was/25—500. GC-MS analysis was performed using the enhanced NIST 2014 standard spectrum library for rapid identification of volatile components in Shenqi Jiangtang Granule.A total of 132 non-volatile components and 86 volatile components were identified in Shenqi Jiangtang Granule.This study provides a rapid and effective method for the qualitative analysis of the chemical components of Shenqi Jiangtang Granulecomprehensively and systematically, which lays the foundation for the research on the material basis of pharmacodynamics, secondary development, quality control, and pharmacological mechanism.

ShenqiJiangtang Granule; chemical constituents; UPLC-Q/TOF MS; GC-MS; qualitative analysis

R284.1

A

0253 - 2670(2021)06 - 1568 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.004

2020-11-08

國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1704200）；國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1704205）

王 倩（1990—），女，碩士研究生，從事中藥分析與質量評價研究。E-mail: 1464887702@qq.com

嚴詩楷，男，副研究員，從事中醫(yī)藥系統生物學研究。E-mail: shkyan@sjtu.edu.cn

李冰冰，男，博士，從事中藥藥效物質基礎與作用機制研究。E-mail: libingt@126.com

[責任編輯 王文倩]