鐵甲草中齊墩果酸的含量測(cè)定

趙 瑩 葉小玲 蘇璐丹 翟 明 張聲源,3 聶 華,3*

1.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院客家藥用生物資源研究所，廣東 梅州 514031；2.江門市蓬江區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 江門 529030；3.嘉應(yīng)學(xué)院廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 梅州 514031

鐵甲草(CassiamimosoidesLinn.)為豆科(Leguminousae)決明屬一年或多年生亞灌木狀草本植物，以全草入藥，主要分布于廣東、福建、云南、臺(tái)灣、貴州和廣西等地，其味甘、性平，具有清肝明目、散瘀化積的功效[1]。有研究結(jié)果表明，鐵甲草能夠有效抑制脂肪酶，防止脂肪肝[2-3];其主要化學(xué)成分有大黃素、齊墩果酸、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素等[4-5]。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鐵甲草的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理作用方面，有關(guān)鐵甲草藥材質(zhì)量控制的研究很少，且未見(jiàn)對(duì)其有效成分進(jìn)行含量測(cè)定的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以鐵甲草中具有抗炎保肝的有效成分齊墩果酸[6]，作為定量檢測(cè)指標(biāo)成分，建立鐵甲草中齊墩果酸的HPLC含量測(cè)定方法，為鐵甲草的質(zhì)量控制和合理開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters Alliance 2695型高效液相色譜儀(Waters公司)； Waters XBridge Peptide BEH C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)； WJX-A1000型高速多功能粉碎機(jī)(浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司)；JP-100S型超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；MING-CHE 24UV超純水機(jī)(法國(guó)Merck Millipore公司)。

齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)：C1723001)，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鐵甲草采于廣東省梅州市蕉嶺縣，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)翟明老師鑒定為豆科決明屬植物鐵甲草(Cassiamimosoides)的全草；其他試劑均為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對(duì)照品1 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得。

2.2 供試品溶液的制備 稱取鐵甲草粗粉2 g，加入2 moL/L的鹽酸10 mL，充分浸潤(rùn)后，在60 ℃水浴下，酸水解2 h，濾渣用超純水水洗至中性，干燥后加入10倍量的90%的乙醇溶液和0.5%NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至8，50 ℃超聲30 min，抽濾后，水浴加熱濃縮成浸膏。

浸膏用甲醇超聲溶解后，離心取上清液，定容至10 mL，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge Peptide BEH C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇：PBS=85∶15；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：35 ℃。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下的齊墩果酸對(duì)照品0.5、1、2、3、4、5 mL溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得濃度為5、10、20、30、40、50 μg/mL系列濃度的齊墩果酸對(duì)照品溶液，于“2.3”項(xiàng)下的色譜條件，以齊墩果酸對(duì)照品溶液色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，齊墩果酸對(duì)照品濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，得齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程Y=4533X+909.6，R=0.9996。結(jié)果表明，在5～50 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，齊墩果酸對(duì)照品溶液的峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。

2.5 專屬性考察 取項(xiàng)目“2.1”和“2.2”項(xiàng)所制備的對(duì)照品溶液和供試品溶液，在“2.3”的色譜條件下進(jìn)樣，齊墩果酸的保留時(shí)間約為13.77 min，峰型穩(wěn)定，分離度良好，有較好的基線分離，未見(jiàn)雜質(zhì)峰干擾，具有良好的專屬性。如圖1所示。

2.6 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液1.0 mL，于“2.3”項(xiàng)的色譜條件下，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，檢測(cè)得到大黃素峰面積的RSD為1.36%,表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0 mL，分別于0、2、4、6、8、12 h于“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，檢測(cè)得到齊墩果酸的峰面積的RSD為0.82 %。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6份等質(zhì)量鐵甲草粗粉2.00 g，按“2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，于“2.3”項(xiàng)的色譜條件，檢測(cè)得到齊墩果酸峰面積的RSD為1.47 %。表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的等質(zhì)量鐵甲草粗粉6份，每份2.00 g，分別精密加入同一濃度的齊墩果酸對(duì)照品，按上述“2.2”的提取方法平行制備成供試品溶液，于“2.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算得到平均回收率結(jié)果為99.39%，RSD為1.53%。表明該方法測(cè)得的結(jié)果有良好準(zhǔn)確性。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 (n=6)

2.10 樣品含量測(cè)定 精密稱取3份不同批藥材各2.00 g，按照“2.2”項(xiàng)的制備方法制備成供試品溶液，每份樣品分別在“2.3”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣三次，記錄峰面積，計(jì)算樣品中齊墩果酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鐵甲草中大黃素和齊墩果酸含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

在考察齊墩果酸的色譜條件時(shí)，曾采用甲醇水，甲醇-0.1%甲酸和甲醇-PBS作為流動(dòng)相，考察結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相選擇為甲醇-PBS(85∶15)時(shí)，樣品中齊墩果酸分離度更好，峰型穩(wěn)定，無(wú)雜峰干擾。由于齊墩果酸同時(shí)含有羥基和羧基基團(tuán)，在堿性條件下更易被提取，在提取條件的考察過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)加入適量堿溶液使其pH值至8時(shí)，更利于齊墩果酸成分的提取。

本實(shí)驗(yàn)建立應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定鐵甲草中齊墩果酸含量的方法，方法精密度高、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率均符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求。測(cè)得3批樣品中，齊墩果酸的含量在3.67% ～3.73%之間，含量較高，且齊墩果酸在臨床上主要用于護(hù)肝降酶，與鐵甲草的功效相符，說(shuō)明齊墩果酸適合作為鐵甲草的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)成分，該方法可作為鐵甲草質(zhì)量控制的方法，從而為鐵甲草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考依據(jù)。