益氣通竅活血方對(duì)顱腦損傷模型大鼠認(rèn)知功能和神經(jīng)功能缺損的作用及機(jī)制探討

楊 琳，王 麗，王 晨，王立新

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021)

顱腦損傷系指因鈍性創(chuàng)傷或機(jī)械力創(chuàng)傷造成腦功能暫時(shí)或永久性損害的神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，是神經(jīng)外科的常見病癥，神經(jīng)功能缺損是其重要臨床表現(xiàn)[1]。根據(jù)發(fā)生時(shí)間的先后，顱腦損傷分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩個(gè)病理階段。原發(fā)性顱腦損傷發(fā)生在受傷當(dāng)即，是外力直接作用于頭部引發(fā)的腦組織損傷；繼發(fā)性損傷則發(fā)生于原發(fā)性損傷后，主要因腦組織缺氧缺血、腦水腫、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞鈣超載、線粒體功能障礙等因素導(dǎo)致，可持續(xù)數(shù)周，是誘發(fā)顱腦損傷進(jìn)一步發(fā)展加重的重要原因，也是造成顱腦損傷高致殘率和高病死率的重要原因[2-3]，因此減輕繼發(fā)性腦損傷對(duì)顱腦損傷的治療和預(yù)后有重要意義。顱腦損傷屬于中醫(yī)學(xué)“頭部?jī)?nèi)傷”“瘀血證”范疇，病機(jī)主要為瘀血內(nèi)阻、正氣受損，因此治療以益氣活血、通竅化瘀為主。有研究報(bào)道，清代王清任調(diào)配的通竅活血湯可以減輕重型顱腦損傷的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)[4]。益氣通竅活血湯是我院在通竅活血湯的基礎(chǔ)上制定的協(xié)定處方，臨床上應(yīng)用可改善顱腦損傷引起的認(rèn)知功能和神經(jīng)功能障礙，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過建立顱腦損傷大鼠模型，采用益氣通竅活血方干預(yù)，旨在探討益氣通竅活血方對(duì)顱腦損傷后認(rèn)知功能和神經(jīng)功能缺損的影響及其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 60只清潔級(jí)雄性SD大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量(250±20)g，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-007，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0018209。室溫飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l件》要求。

1.2藥品與試劑 益氣通竅活血方組成：黃芪15 g、黨參15 g、當(dāng)歸9 g、川芎9 g、赤芍6 g、桃仁12 g、紅花9 g、柴胡3 g、丹參9 g、甘草6 g、人工麝香0.15 g；飲片均由本醫(yī)院藥房提供并煎煮，藥材加水煎煮2次，合并藥液。水合氯醛(分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)；蘇木精-伊紅染色液(武漢華美生物工程有限公司)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；S100B蛋白試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司； 兔抗NGF-β購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Bcl-2、Bax抗體購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz 公司；Envision試劑(HRP/Rabbit)即用型購(gòu)自丹麥Dako公司。

1.3儀器 Pin Point TM 精密顱腦損傷撞擊器(Hat-teras Instruments，美國(guó))；RM2235型病理切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；TE2000-E倒置顯微鏡(尼康儀器有限公司)；高速低溫離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；OLYMPUSAU5400全自動(dòng)生化分析儀(日本奧林巴斯有限公司)；ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將60只大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、益氣通竅活血低劑量組、益氣通竅活血中劑量組、益氣通竅活血高劑量組，每組10只。建模前4 h禁食水，除空白組外，其余組大鼠腹腔注射10%水合氯醛400 mL/kg行全身麻醉，無菌條件下沿頭皮正中矢狀切開，分離骨膜，暴露顱骨，在顱骨冠狀縫后1.5 mm、中線偏左2.5 mm處開一直徑5 mm的骨窗，手術(shù)過程中確保硬膜的完整性。模型組和益氣通竅活血各劑量組大鼠固定于定位儀上，將撞擊錘安置于骨窗，選用直徑5 mm的撞針，設(shè)定撞擊深度5 mm，速度2 vm/s，接觸時(shí)間90 ms，術(shù)后修補(bǔ)骨窗，縫合傷口。假手術(shù)組不進(jìn)行撞擊，僅打開骨窗，再修補(bǔ)縫合。造模后采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)估，造模后6 h mNSS評(píng)分>4分表示建模成功[5]。模型組和益氣通竅活血高劑量組各死亡1只，益氣通竅活血中劑量組死亡2只。建模成功后，益氣通竅活血低、中、高劑量組分別給予益氣通竅活血方2.5 mg/kg、5 mg/kg、7.5 mg/kg灌胃，其余組給予生理鹽水灌胃，均 1次/d，連續(xù)7 d。

1.5觀察指標(biāo)與方法

1.5.1mNSS評(píng)分 分別于造模后24 h、72 h、168 h對(duì)各組大鼠進(jìn)行mNSS評(píng)分。mNSS評(píng)分由運(yùn)動(dòng)(肌肉狀態(tài)、異常運(yùn)動(dòng))、感覺(視覺、觸覺和本體感受)和反射測(cè)試構(gòu)成，分值0～18分，得分越高，神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.5.2認(rèn)知功能 采用Morris水迷宮試驗(yàn)對(duì)大鼠認(rèn)知功能(空間學(xué)習(xí)、空間探索能力)進(jìn)行評(píng)估。Morris水迷宮：直徑180 cm、高60 cm圓形水池，池中有直徑20 cm的圓形透明平臺(tái)和數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)。①空間學(xué)習(xí)能力測(cè)試：于建模成功后第4天開始對(duì)大鼠進(jìn)行為期4 d、每日4次、每次間隔20 min的航行訓(xùn)練，水溫室溫，從水池4個(gè)邊緣隨機(jī)位置放入大鼠，以大鼠找到低于水面1 cm的圓形透明平臺(tái)或航行時(shí)間達(dá)120 s但未能找到平臺(tái)視為結(jié)束。計(jì)算大鼠每日抵達(dá)平臺(tái)的平均航行時(shí)間即為逃避潛伏期，逃避潛伏期越長(zhǎng)表示認(rèn)知功能越差。②空間探索測(cè)試(記憶力測(cè)試)：所有大鼠在造模第7天時(shí)測(cè)試記憶力，撤去圓形透明平臺(tái)，從水池4個(gè)邊緣隨機(jī)位置放入大鼠，航行時(shí)間60 s，記錄大鼠穿越原平臺(tái)的次數(shù)，測(cè)試2次，間隔15 min 1次，取平均值。

1.5.3血清S100B、NGF、BDNF水平 于建模后第7天，10%水合氯醛麻醉，心臟取血，離心，取上層血清，采用放射免疫法檢測(cè)血清S100B、NGF、BDNF水平，嚴(yán)格按說明書操作。

1.5.4腦組織病理表現(xiàn) 于建模后第7天，取血后主動(dòng)脈灌注生理鹽水200 mL，至心臟右心耳處流出清亮液體，再灌注4%多聚甲醛250 mL，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中固定24 h。石蠟包埋切片，行HE染色和尼氏染色，鏡下觀察腦組織神經(jīng)元細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)。

1.5.5腦組織中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)情況 選取制備好的石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟脫水，PBS漂洗3次，3 min/次；滴加0.3% H2O2，室溫靜置15～20 min，PBS漂洗3次；滴加20%正常山羊血清封閉液，室溫孵育30 min；滴加Ⅰ抗，Bcl-2和Bax按照一定濃度稀釋，室溫孵育10～15 min，4 ℃過夜，37 ℃復(fù)溫30 min，PBS漂洗3次，5 min/次；滴加Envision 試劑(HRP/R)，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次。DAB顯色8～12 min；蘇木素復(fù)染，熱水藍(lán)化；脫水，透明，樹脂封片；烤片，拍照。Bcl-2和Bax蛋白染色呈棕黃色或黃色為陽性細(xì)胞，在高倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算腦組織中Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)，取平均值為最終結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠不同時(shí)間mNSS評(píng)分比較 空白組與假手術(shù)組大鼠術(shù)后24 h、72 h、168 h的mNSS評(píng)分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與空白組比較，模型組術(shù)后24 h、72 h、168 h的mNSS評(píng)分均明顯升高(P均<0.05)；與模型組比較，益氣通竅活血各劑量組大鼠術(shù)后24 h、72 h、168 h的mNSS評(píng)分均明顯降低(P均<0.05)；益氣通竅活血高劑量組大鼠術(shù)后24 h、72 h、168 h的mNSS評(píng)分均明顯低于益氣通竅活血低劑量組(P均<0.05)，益氣通竅活血低劑量組與中劑量組、中劑量組與高劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間mNSS評(píng)分比較分)

2.2各組大鼠認(rèn)知功能比較 空白組與假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與空白組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，益氣通竅活血各劑量組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短(P均<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P均<0.05)；與益氣通竅活血低劑量組比較，益氣通竅活血高劑量組大鼠的逃避潛伏期更短(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)更多(P<0.05)；益氣通竅活血低劑量組與中劑量組、中劑量組與高劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較

2.3各組大鼠血清S100B、NGF、BDNF水平比較 空白組與假手術(shù)組大鼠血清S100B、NGF、BDNF水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與空白組比較，模型組大鼠血清S100B水平明顯升高(P<0.05)，NGF、BDNF水平均明顯降低(P均<0.05)；與模型組比較，益氣通竅活血各劑量組大鼠血清S100B水平均明顯降低(P均<0.05)，NGF、BDNF水平均明顯升高(P均<0.05)；與益氣通竅活血低劑量組比較，益氣通竅活血高劑量組大鼠血清S100B水平更低(P<0.05)，NGF、BDNF水平更高(P均<0.05)；益氣通竅活血低劑量組與中劑量組、中劑量組與高劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清S100B、NGF、BDNF水平比較

2.4各組大鼠腦組織病理學(xué)表現(xiàn) 空白組與假手術(shù)組大鼠腦組織皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，無出血、水腫及損傷，各細(xì)胞層次分明清晰，排列整齊有序，神經(jīng)元核仁清楚，血管正常無擴(kuò)張。模型組大鼠創(chuàng)傷灶及其周邊組織發(fā)生明顯水腫，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞胞體出現(xiàn)腫脹，可見細(xì)胞核固縮及缺失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。益氣通竅活血各劑量組大鼠創(chuàng)傷區(qū)及周圍組織水腫顯著減輕，神經(jīng)細(xì)胞腫脹減少，核固縮好轉(zhuǎn)，偶見部分空泡中央細(xì)胞缺失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，其中以高劑量組改善最佳。見圖 1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)HE染色鏡下表現(xiàn)(×400)

2.5各組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況比較 空白組與假手術(shù)組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與空白組比較，模型組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)均明顯增多(P均<0.05)；與模型組比較，益氣通竅活血各劑量組大鼠腦組織中Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)均明顯增多(P均<0.05)，Bax陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)均明顯減少(P均<0.05)；與益氣通竅活血低劑量組比較，益氣通竅活血高劑量組大鼠腦組織中Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)更多(P<0.05)，Bax陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)更少(P<0.05)；益氣通竅活血低劑量組與中劑量組、中劑量組與高劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腦組織中Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)比較個(gè))

3 討 論

顱腦損傷為神經(jīng)外科的一種常見外傷，常出現(xiàn)大腦學(xué)習(xí)能力和記憶力減退等認(rèn)知功能障礙[6-7]，預(yù)后多不佳。在顱腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程中，繼發(fā)性顱腦損傷的發(fā)生起到重要作用，并嚴(yán)重影響患者預(yù)后[8]。腦損傷后，各種刺激信號(hào)可激活多種病理生理因子表達(dá)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性顱腦損傷的重要機(jī)制[9]。神經(jīng)細(xì)胞凋亡與顱腦損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，與神經(jīng)功能缺損也密切相關(guān)[10]。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，Bcl-2和Bax被認(rèn)為是關(guān)鍵基因[11]，其中Bcl-2為抑制凋亡基因，其通過抑制誘導(dǎo)因子被激活、減少自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、提高神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性，從而發(fā)揮作用；Bax則是Bcl-2的拮抗蛋白，與Bcl-2的作用正相反，為促凋亡基因，通過拮抗Bcl-2的功能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此維持Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)平衡對(duì)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡有重要意義[12]。

海馬區(qū)是腦邊緣系統(tǒng)中的重要結(jié)構(gòu)，主管人的學(xué)習(xí)和記憶能力、認(rèn)知功能等，當(dāng)其受損后會(huì)表現(xiàn)出學(xué)習(xí)和記憶能力的下降，這也是顱腦損傷的典型標(biāo)志之一。NGF是最早發(fā)現(xiàn)的一類神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育、成熟具有促進(jìn)作用，并能調(diào)節(jié)神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)方向。當(dāng)腦組織受損時(shí)，NGF能促進(jìn)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)，保護(hù)損傷神經(jīng)元，從而減輕繼發(fā)性顱腦損傷。BDNF是在腦內(nèi)合成的一種內(nèi)源性腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)，分布于腦皮質(zhì)、紋狀體區(qū)、海馬區(qū)，對(duì)神經(jīng)元的分化和生長(zhǎng)再生具有維持和促進(jìn)作用。在腦損傷早期，BDNF釋放量會(huì)顯著增加，以保護(hù)神經(jīng)功能[13]；但后期，當(dāng)損傷神經(jīng)元的因素持續(xù)且大量存在時(shí)，會(huì)過度消耗BDNF，同時(shí)還能抑制BDNF合成，導(dǎo)致生物體內(nèi)BDNF水平降低。S100B蛋白酸性鈣結(jié)合蛋白是一種特異性腦蛋白，主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞、垂體前葉細(xì)胞。當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷時(shí)，S100B蛋白的釋放量會(huì)明顯增加，并進(jìn)一步刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性因子及NO，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡而損傷神經(jīng)功能，S100B蛋白水平的高低與顱腦損傷的程度密切相關(guān)[14]。因此，提高NGF、BDNF水平對(duì)減輕腦損傷后期神經(jīng)元損傷和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，恢復(fù)大腦認(rèn)知功能有重要意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“腦為元神之府”，人的感官、思維、意識(shí)和記憶力等皆由腦統(tǒng)攝。外傷導(dǎo)致顱腦損傷可使機(jī)體對(duì)外界的認(rèn)識(shí)程度、感知水平和適應(yīng)能力下降[15]。顱腦損傷的病位在腦，病機(jī)為瘀血內(nèi)阻、正氣受損，氣化運(yùn)行不順則為風(fēng)，風(fēng)動(dòng)生熱，傷及腦髓經(jīng)絡(luò)，因此益氣活血、祛風(fēng)通絡(luò)是基本的治療準(zhǔn)則[16]。本研究中所用益氣通竅活血方以黃芪、黨參為君藥，益氣固表、補(bǔ)氣升陽，氣血充盈利于活血通絡(luò)；川芎有血中之氣藥之稱，具有活血行氣、消散瘀血、祛風(fēng)止痛的功效，能上達(dá)巔頂、下通氣海；當(dāng)歸活血補(bǔ)血；紅花、桃仁、赤芍活血化瘀；柴胡祛除風(fēng)邪；甘草補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，方中多藥均具有抗炎、抗氧化、清除自由基、擴(kuò)張腦血管、抑制血小板活化等作用，如川芎嗪能清除自由基、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、減輕炎癥反應(yīng)、抑制血小板聚集等；丹參能減輕炎癥因子對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，并促進(jìn)組織修復(fù)再生，恢復(fù)神經(jīng)功能；黃芪多糖、柴胡可增強(qiáng)免疫功能、清除自由基等；甘草具有糖皮質(zhì)激素樣作用；紅花、桃仁可擴(kuò)張血管，抑制血小板黏附聚集[17-20]。因此，該方能抑制血小板聚集，有效改善腦部微循環(huán)，增加腦血流量，同時(shí)還能減輕炎性反應(yīng)，清除氧自由基，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，修復(fù)和保護(hù)損傷腦組織，改善認(rèn)知功能障礙。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，益氣通竅活血各劑量組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的mNSS評(píng)分及血清S100B水平均明顯降低，血清NGF、BDNF水平均明顯升高，水迷宮試驗(yàn)逃避潛伏期明顯縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多，腦組織中Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)均明顯增多，Bax陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)均明顯減少，且益氣通竅活血高劑量組各指標(biāo)改善最明顯。表明益氣通竅活血方對(duì)顱腦損傷大鼠有較好的干預(yù)作用，能有效保護(hù)損傷神經(jīng)元，減輕神經(jīng)功能缺損，改善認(rèn)知功能，機(jī)制可能與提高NGF、BDNF水平，降低S100B水平，抑制Bax蛋白表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。