兒童髓母細(xì)胞瘤腦脊液循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)可行性分析

孫艷玲 劉晶晶 李苗 任思其 劉妍 張金 李舒婷 龔小軍 王圓 杜淑旭 武萬(wàn)水 孫黎明 田永吉

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院兒科（北京100038）；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院小兒神經(jīng)外科（北京100050）

髓母細(xì)胞瘤（medulloblastoma，MB）是兒童常見(jiàn)的惡性腦腫瘤，約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的20%，目前在手術(shù)、全腦全脊髓放療以及輔助化療的多模式治療下，標(biāo)危組5年生存率可達(dá)85%，高危組可達(dá)70%，但仍有近30%患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)及進(jìn)展，而一旦復(fù)發(fā)或進(jìn)展，中位生存期僅有1年左右，2年生存率25%，總生存率不超過(guò)10%［1-2］。在2016年［3］的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)中對(duì)MB 增加了分子分型，然而一旦病情進(jìn)展或復(fù)發(fā)，82%呈腦脊膜播散伴或不伴有局部復(fù)發(fā)，僅25%可獲得再次手術(shù)或活檢獲得病理組織［4］，亟待尋找一種新的可供選擇的分子檢測(cè)手段用于評(píng)估基因突變狀態(tài)。近年來(lái)，隨著超敏感測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，腫瘤的精準(zhǔn)個(gè)體化治療成為目前治療的方向。數(shù)字PCR（dPCR）可以檢測(cè)出豐度為0.01% ～0.1%的突變等位基因，而新一代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）可平行檢測(cè)多種突變。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的半衰期不到兩個(gè)小時(shí)，可動(dòng)態(tài)反應(yīng)腫瘤的實(shí)時(shí)情況。2016年FDA 首次批準(zhǔn)液態(tài)活檢技術(shù)-血液ctDNA 的測(cè)定用于非小細(xì)胞肺癌中EGFR 突變的診斷和靶向治療，以及早期復(fù)發(fā)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。然而由于血腦屏障的存在，原發(fā)腦腫瘤患者的血漿中罕有檢出ctDNA。近來(lái)越來(lái)越多的研究顯示，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤（腦膠質(zhì)瘤為主）及轉(zhuǎn)移癌的患者腦脊液中可以檢測(cè)出ctDNA，陽(yáng)性率70%［6］，但關(guān)于兒童MB 尚缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)及研究。本課題通過(guò)對(duì)比兒童MB腫瘤組織和腦脊液ctDNA 檢測(cè)結(jié)果，確定腦脊液液態(tài)活檢在MB 中的可行性，探索腦脊液液體活檢用于MB 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的意義，并對(duì)進(jìn)展及復(fù)發(fā)患兒再次進(jìn)行基因診斷以實(shí)施個(gè)體化的精準(zhǔn)治療。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2019年4月至2019年12月北京天壇醫(yī)院小兒神經(jīng)外科收治的患兒6 例，術(shù)前均依據(jù)頭顱核磁影像學(xué)診斷為MB，以及同期于我院住院的初治MB 患兒1 例，頭顱及全脊髓核磁增強(qiáng)掃描提示存在脊髓播散MB。

1.2 髓母細(xì)胞瘤分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)及分期術(shù)后組織標(biāo)本經(jīng)天壇神經(jīng)外科病理研究所和北京宣 武醫(yī)院病理科確診為MB 并行病理分型，共分為四種病理類(lèi)型：經(jīng)典型（classic medulloblastoma，CMB）、促纖維增生/結(jié)節(jié)型（desmoplastic/nodular medulloblastoma DMB）、廣泛結(jié)節(jié)型（medulloblastoma with extensive nodularity，MBEN）、大細(xì)胞/間變型（large cell/anaplastic，LC/A）；TAYLOR 等［8］提出MB 包括4 種獨(dú)立的分子學(xué)亞型：WNT、SHH、3 型（Group3）、4 型（Group4），3 型和4 型屬于非WNT/SHH 亞型。根據(jù)Chang′s 分期［9］將腫瘤分為5 期：M0 期指無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移者，M1 期為僅腦脊液中有腫瘤細(xì)胞，M2期為僅腦部核磁共振成像（MRI）發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，M3 期為脊髓MRI 發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，M4 期為神經(jīng)系統(tǒng)外發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶。

1.3 方法

1.3.1 采樣術(shù)中樣本留?。盒g(shù)中先行枕后正中入路留取腦脊液標(biāo)本4 ～6 mL 及外周血streck 采血管4 mL。術(shù)后3 ～4 周樣本留?。河谛g(shù)后3-4 周首次化療前行腰椎穿刺留取腦脊液2 ～4 mL，并外周血streck 采血管4 mL。采集后4 ℃運(yùn)輸，2 ～3 h內(nèi)-4 ℃離心10 min，分離后于-80 ℃保存。

1.3.2 ctDNA 提取腦脊液樣本與200 μL 的Q Sepharose 陰離子交換樹(shù)脂混合，置于旋轉(zhuǎn)儀上室溫孵育，將收集的沉淀利用Micro Bio-SpinTM（Bio Rad）色譜柱清洗后洗脫，洗脫后的DNA 用Qia Quick columns（Qiagen）進(jìn)一步純化。

1.3.3 ctDNA 的目標(biāo)區(qū)域捕獲和建庫(kù)方案目標(biāo)捕獲和MB 密切相關(guān)基因的全部外顯子區(qū)域，以血液作為參照樣本排除胚系突變，用Covaris 破碎儀將基因組DNA（石蠟組織和血液）隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度為150 bp 大小的片段。將基因組DNA 片段以及腦脊液上清ctDNA，分別作為模板配制第一步PCR體系，將PCR 反應(yīng)體系利用Rain Drop Source（Rain Dance Technologies）系統(tǒng)將單個(gè)分子分散至油包水液滴中，制備好的油滴經(jīng)第一步PCR 擴(kuò)增捕獲目標(biāo)區(qū)域，破壞油滴釋放擴(kuò)增子，再通過(guò)第二步PCR添加適用于illumina 測(cè)序平臺(tái)的接頭序列，磁珠法純化DNA，對(duì)完整的DNA 文庫(kù)用Agilent 2100 檢測(cè)儀檢測(cè)片段大小，利用文庫(kù)定量試劑盒精確定量DNA 濃度，質(zhì)檢合格的文庫(kù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 髓母細(xì)胞瘤循環(huán)腫瘤DNA 的高通量測(cè)序?qū)τ谟坞xDNA 中含量極低的循環(huán)腫瘤DNA片段，目標(biāo)測(cè)序深度為20 000 ×，根據(jù)捕獲區(qū)間大小計(jì)算文庫(kù)輸入量。目標(biāo)捕獲區(qū)域片段長(zhǎng)度主要集中在160 ～200 bp 之間，選擇PE150 測(cè)序策略通illumina 公司的HiSeq X Ten 測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序，下機(jī)數(shù)據(jù)Q30在90%以上的進(jìn)行后續(xù)生信分析。

1.3.5 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析對(duì)獲得的下機(jī)數(shù)據(jù)按index 進(jìn)行拆分，得到原始測(cè)序序列（Raw Reads）。對(duì)Raw Reads 的數(shù)據(jù)量、堿基含量、堿基質(zhì)量等結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，過(guò)濾不合格的數(shù)據(jù)，得到Clean Reads。將Clean Data 按分段比對(duì)的方式比對(duì)到參考基因組上。修正后的比對(duì)結(jié)果將作為輸入文件進(jìn)行突變檢測(cè)、注釋和統(tǒng)計(jì)。在體細(xì)胞SNV、Indel 的檢測(cè)過(guò)程中，對(duì)正常樣本和腫瘤樣本進(jìn)行成對(duì)分析，以檢測(cè)出體細(xì)胞內(nèi)與腫瘤發(fā)生相關(guān)的突變。

2 結(jié)果

2.1 腦脊液上清較腦脊液沉淀檢出更豐富基因突變采用Agilent 2100 生物分析儀對(duì)標(biāo)本ctDNA 片段大小進(jìn)行進(jìn)行質(zhì)控分析，3 例在150 ～200 bp 處沒(méi)有峰值，而在2 885 bp 處出現(xiàn)峰值，非ctDNA 片段，質(zhì)控不合格，建庫(kù)失敗，未進(jìn)行基因檢測(cè)。樣本192D360 采用952 基因?qū)δX脊液上清、腦脊液沉淀及組織標(biāo)本進(jìn)行比對(duì)，腦脊液上清中較腦脊液沉淀可以檢測(cè)出更多的基因突變，且這些突變囊括MB 相關(guān)的重要基因（圖1）。

2.2 腦脊液基因突變檢出較組織更豐富4例建庫(kù)成功的患兒，男3 例，女1 例，年齡3 ～7 歲；CMB、DMB 各2 例；M0 期2 例；M2、M3 期各1 例；SHH、G4各2 例；3 例于術(shù)中采集ctDNA，1 例于腰穿時(shí)采集ctDNA。采集的ctDNA 濃度在0.137 ～57 ng/μL 之間。腦脊液SNV 檢出較組織更豐富（13/11、25/12、24/10）。腦脊液檢測(cè)出MB 相關(guān)重要基因突變，陽(yáng)性率75%。組織檢測(cè)出MB 相關(guān)重要基因突變，陽(yáng)性率50%。CSF 檢測(cè)出7 個(gè)MB 相關(guān)基因突變，組織檢測(cè)出2 個(gè)MB 相關(guān)基因突變（表1）。

表1 臨床資料及基因突變檢出情況Tab.1 Clinical data and gene mutation detection status

3 討論

MB 是兒童常見(jiàn)的惡性腦腫瘤，總體發(fā)病率2.34 ～5.96/100 萬(wàn)。隨著基因組學(xué)的完善，對(duì)于MB 的生物學(xué)特征有了更進(jìn)一步的理解。MB 現(xiàn)在被認(rèn)為是不同分子病理疾病實(shí)體的總稱(chēng)，并在2016年的CNS 分類(lèi)［3］中被分為WNT、SHH-TP53 野生型、SHH-TP53 突變型、非-WNT/非-SHH（包括Group3 和Group4），有MYC 擴(kuò)增或TP53 突變的患者總體預(yù)后較差。但目前針對(duì)兒童MB 的ctDNA的系統(tǒng)性監(jiān)測(cè)鮮有報(bào)道。

2016年FDA 已批準(zhǔn)液態(tài)活檢技術(shù)用于非小細(xì)胞肺癌中的EGFR 突變檢測(cè)，且已有研究發(fā)現(xiàn)液體活檢作為一種無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)，可以用于肺癌的早期復(fù)發(fā)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，甚至可以比影像學(xué)檢查提前一年發(fā)現(xiàn)癌癥復(fù)發(fā)的跡象［10］?，F(xiàn)在血漿ctDNA 已被用于多種腫瘤的診斷、預(yù)后判斷及精準(zhǔn)治療，如胰腺癌、肝細(xì)胞癌、前列腺腫瘤、直腸癌、甲狀腺癌等［11-13］。與經(jīng)典的組織病理相比，液體活檢克服了傳統(tǒng)組織活檢的侵入性、取樣困難等局限性，使腫瘤的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)成為可能。而且ctDNA 的遺傳信息和腫瘤組織有良好一致性，可以動(dòng)態(tài)反映腫瘤基因譜特征［14］。

BETTEGOWDA 等［15］針對(duì)640 例腦腫瘤患者進(jìn)行血漿ctDNA 測(cè)定，其中136 例為14 個(gè)癌種的腦轉(zhuǎn)移癌，41 例為腦膠質(zhì)瘤、MB 等原發(fā)腦腫瘤，原發(fā)腦腫瘤敏感性低于其它腫瘤，在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者中，腦脊液與腫瘤細(xì)胞接觸更為親密。腦脊液腫瘤細(xì)胞與原發(fā)腫瘤組織相匹配，但也有差異，特定的基因組區(qū)域在腦脊液腫瘤細(xì)胞中經(jīng)常改變。SHANKAR 等［16］發(fā)現(xiàn)原發(fā)腦腫瘤的腦脊液ctDNA濃度明顯高于血漿ctDNA 濃度，可檢測(cè)到ctDNA的患者比未檢測(cè)到ctDNA 的患者生存質(zhì)量更差，ctDNA 分析可檢測(cè)到相應(yīng)組織樣本中所缺失的突變。SIMONELLI 等［6］回顧ctDNA 液體活檢在腦膠質(zhì)瘤患者中的應(yīng)用歷史，靈敏度約為70%，在腦脊液樣本中檢測(cè)到TERTp 突變，靈敏度為92%，CSF-tDNA 中的低TERTp 突變總體存活時(shí)間明顯更長(zhǎng)。ctDNA 的液體活組織檢查是診斷膠質(zhì)瘤，特別是彌漫性中線(xiàn)膠質(zhì)瘤的一個(gè)很有前途的工具。PAN 等［17］提示基于數(shù)字PCR 和靶向擴(kuò)增子測(cè)序的方法對(duì)CSF ctDNA檢測(cè)是有效且高靈敏度的。ESHINI等［18］研究表明，88%的DMG 患者的腦脊液上清液中鑒定出H3K27M，其中CSF 中ctDNA 的富集程度最高（診斷時(shí)達(dá)75%）?？蓢L試作為小兒彌漫中線(xiàn)膠質(zhì)瘤監(jiān)測(cè)和細(xì)胞體外治療反應(yīng)的可行方法。

圖1 192D0360 腦脊液上清、腦脊液沉淀及組織基因突變Fig.1 Gene mutations in the CSF supernatant，CSF precipitate and tissue of sample 192D0360

SPINDLER等［19］通過(guò)PCR及測(cè)序法證實(shí)血漿中ctDNA 分子比非突變的ctDNA 分子短。UNDERHILL 等［20］在大鼠異種移植模型中測(cè)定ctDNA 的片段在134 ～144 bp 之間，盡管這種縮短的原因尚未明確。在本研究中，最初3 例采樣后直接-80 ℃凍存，之后統(tǒng)一進(jìn)行復(fù)蘇離心ctDNA 提取，采用Agilent 2100 生物分析儀質(zhì)控分析發(fā)現(xiàn)非ctDNA 片段，考慮存在細(xì)胞破壞，大片段基因組干擾，無(wú)法進(jìn)行深度測(cè)序，排除實(shí)驗(yàn)外。后腦脊液樣本采集后4 ℃運(yùn)輸，2 ～3 h 內(nèi)行-4 ℃離心10 min，分離后于-80 ℃保存。調(diào)整實(shí)驗(yàn)流程后，樣本192D360 做為預(yù)實(shí)驗(yàn)，提取DNA 后應(yīng)用Agilent 2100 進(jìn)行DNA片段測(cè)試，在150 ～200 bp 處顯示有峰值，采用952基因成功測(cè)序，對(duì)比腦脊液上清、沉淀及組織標(biāo)本基因突變檢出情況，腦脊液上清共檢出37 個(gè)基因突變，腦脊液沉淀共檢出17 個(gè)基因突變，共有突變5 個(gè)，其中與MB 密切相關(guān)的SMARCA4、TP53、KDM5A 三個(gè)基因突變?cè)谀X脊液樣本中檢出。SMARCA4 在上清和沉淀都有檢出，TP53 和KDM5A 在上清檢出，提示腦脊液上清中或許可以檢測(cè)出更多的基因突變，且這些突變囊括MB 相關(guān)的重要基因，與PENTSOVA 等［21］研究一致，確立以腦脊液上清做為后期研究的方向。本組數(shù)據(jù)顯示CSF 和腫瘤組織檢出Indel 一致性高，而SNV 一致性低。腦脊液SNV 檢出較組織更豐富。腦脊液MB 相關(guān)基因突變檢出陽(yáng)性率75%，組織MB 相關(guān)重要基因突變檢出陽(yáng)性率50%。腦脊液檢測(cè)出KMT2D、KMT2C、TP53、NF1、PIK3CA、SMARCA4、KMD5A 等MB 相關(guān)基因突變，組織檢測(cè)出KMT2D、SMARCA4 等MB 相關(guān)基因突變，分析可能與ctDNA片段短150 bp，測(cè)序深度達(dá)20000x 有關(guān)［22］。但本研究數(shù)據(jù)尚少，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并多中心研究明確。

綜上所述，腦脊液ctDNA 作為液體活檢在MB 診斷中有一定作用?，F(xiàn)有的研究提示腦脊液ctDNA 的檢測(cè)對(duì)于提示疾病進(jìn)展及預(yù)后具有一定的作用，但囿于腦脊液標(biāo)本量以及兒童MB 基因突變的檢出率及突變豐度等，目前對(duì)于MB 的進(jìn)展、復(fù)發(fā)的判斷仍以影像學(xué)檢查為主。本研究初步提出腦脊液液體活檢在MB 的診斷中是可行的，摸索了最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，提示尤其在復(fù)發(fā)MB 患兒無(wú)法手術(shù)獲得組織標(biāo)本時(shí)腦脊液ctDNA 檢測(cè)可能為進(jìn)一步的個(gè)體化治療的提供方向，是一個(gè)初步的嘗試，ctDNA 的濃度及基因突變程度對(duì)預(yù)后生存期意義還有待進(jìn)一步觀察，后續(xù)會(huì)進(jìn)行更大樣本的驗(yàn)證。