紅景天苷預(yù)處理脂肪干細(xì)胞促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的作用及機(jī)制

楊金龍 張榮明 魏巍 湯鋒 陳健

1錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷整形小兒外科（遼寧錦州121000）；2遼寧省錦州市中心醫(yī)院整形外科（遼寧錦州121000）；3中國(guó)人民解放軍第968 醫(yī)院燒傷整形科（遼寧錦州121000）

糖尿病皮膚潰瘍是常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥之一， 近些年干細(xì)胞移植用于該病的治療價(jià)值受到越來(lái)越多關(guān)注。但是，高糖環(huán)境對(duì)干細(xì)胞的增殖、遷移及分化具有抑制作用，不利于干細(xì)胞向糖尿病潰瘍創(chuàng)面的定向移動(dòng)，進(jìn)而影響了創(chuàng)面修復(fù)的效果［1-3］。紅景天苷是藏藥紅景天中的活性成分，有研究報(bào)道紅景天苷在干細(xì)胞的增殖、遷移、分化中起到調(diào)控作用［4-7］。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是組織工程領(lǐng)域重要的種子細(xì)胞之一，具有來(lái)源廣泛、取材方便等優(yōu)勢(shì)，被用于燒傷創(chuàng)面、糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面的治療［8-10］。本研究將紅景天苷用于ADSCs的干預(yù)，一方面觀察紅景天苷在高糖環(huán)境下對(duì)ADSCs 增殖、遷移及分化的影響，另一方面觀察紅景天苷處理ADCSs 后對(duì)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合作用，旨在為今后使用ADSCs治療糖尿病皮膚潰瘍提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物7 ～8 周齡的SPF 級(jí)雄性SD 大鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量200 ～250 g，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0004。

1.1.2 試劑紅景天苷、鏈脲佐菌素購(gòu)自Sigma 公司，MTS 細(xì)胞增殖活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega 公司，結(jié)晶紫購(gòu)自上海生工公司，RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，HE 染色試劑盒購(gòu)自上海歌凡生物，CD44、CD29、CD45、CD34、角蛋白19（Cytokerantin19，CK19）、CD31、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、膠原蛋白（Collagen，Col）-Ⅰ、Col-Ⅲ抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.1.3 儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo 公司，顯微鏡購(gòu)自Nikon 公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-tek 公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ADSCs 的分離及驗(yàn)證分離大鼠大腿內(nèi)側(cè)腹股溝處的脂肪組織，剔除脂肪組織膜及血管后剪碎，消化酶消化組織后離心得到沉淀，重懸并接種在培養(yǎng)瓶中，24 h 后換液、去除未貼壁的細(xì)胞，而后每3 天換液1 次，細(xì)胞融合至80% ～90%后進(jìn)行消化，取第三代細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)CD44、CD29、CD45、CD34 的表達(dá)。

1.2.2 ADSCs 的分組及給藥第3 代ADSCs 隨機(jī)分為對(duì)照組、高糖組、高糖+紅景天苷組、紅景天苷組，分別用低糖（5.5 mmol/L）DMEM、高糖DMEM（25.0 mmol/L）、含有100 μg/mL 紅景天苷的高糖DMEM、100 μg/mL 紅景天苷的低糖DMEM 處理，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 ADSCs 增殖的檢測(cè)采用MTS 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力并在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處的吸光值A(chǔ)490。

1.2.4 ADSCs 遷移的檢測(cè)在Transwell 模型中檢測(cè)細(xì)胞遷移，ADSCs 接種在上層小室內(nèi)，下層小室內(nèi)加入含血清培養(yǎng)基，分組干預(yù)后2 d 用結(jié)晶紫對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行染色，而后在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.2.5 動(dòng)物分組、造模及干預(yù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、ADSCs 組、紅景天苷ADSCs 組，每組各8 只。造模方法如下：高脂高糖飼料喂養(yǎng)1 個(gè)月、腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病，在背部正中做一直徑2 cm 創(chuàng)面。造模后6 h 開(kāi)始進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注入1 mL 培養(yǎng)基，ADSCs 組經(jīng)尾靜脈注入1 mL 含有2 × 106個(gè)ADSCs 的培養(yǎng)基，紅景天苷ADSCs 組 經(jīng)尾靜脈注入1 mL 含 有2 × 106個(gè)紅景天苷預(yù)處理48 h 的ADSCs 的培養(yǎng)基。

1.2.6 創(chuàng)面愈合的大體觀察干預(yù)前、及干預(yù)后第7 天、第14 天時(shí)，觀察創(chuàng)面并拍照，計(jì)算創(chuàng)面面積及愈合率。

1.2.7 創(chuàng)面愈合的形態(tài)學(xué)觀察干預(yù)后第14 天，處死大鼠并收集創(chuàng)面組織，4%多聚甲醛固定后制作切片，采用HE 染色試劑盒進(jìn)行染色并在顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變。

1.2.8 蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)取分組給藥的ADSCs或干預(yù)后第14天的大鼠創(chuàng)面組織，用RIPA裂解液提取蛋白并檢測(cè)蛋白含量，取含有30 μg 蛋白的樣本進(jìn)行Western blot 檢測(cè)，電泳、電轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂牛奶封閉、孵育一抗、二抗后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)灰度值計(jì)算表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件錄入數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行差異性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs 表面干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)第三代ADSCs 表面CD44、CD29 的陽(yáng)性率均在95%以上，CD45、CD34 陰性表達(dá)，表明ADSCs 符合間充質(zhì)來(lái)源干細(xì)胞的特性。見(jiàn)圖1。

2.2 紅景天苷促進(jìn)ADSCs 的增殖與對(duì)照組比較，高糖組的A490水平明顯降低，紅景天苷組的A490水平明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+紅景天苷組的A490水平明顯增加（P＜0.05）且在干預(yù)的第1 天、第2 天，紅景天苷組及高糖+紅景天苷組的A490水平逐步增加，而從干預(yù)的第3 天起、紅景天苷組及高糖+紅景天苷組的A490水平不再繼續(xù)增加，因此后續(xù)選擇紅景天苷干預(yù)2 d 作為檢測(cè)ADSCs 遷移、分化的時(shí)間點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

2.3 紅景天苷促進(jìn)ADSCs 的遷移干預(yù)后2 d，對(duì)照組、高糖組、高糖+紅景天苷組、紅景天苷組的遷移數(shù)目分別為（22.38±6.86）、（11.75±3.47）、（19.75±5.14）、（37.49±9.39）。與對(duì)照組比較，高糖組的遷移細(xì)胞數(shù)目明顯減少，紅景天苷組的遷移細(xì)胞數(shù)目明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+紅景天苷組的遷移細(xì)胞數(shù)目明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖1 ADSCs 表面CD44、CD29、CD45、CD34 的表達(dá)Fig.1 Expression of CD44，CD29，CD45 and CD34 on ADSCs

圖2 紅景天苷對(duì)高糖條件下ADSCs 增殖的影響Fig.2 Effect of salidroside on the proliferation of ADSCs under high glucose condition

2.4 紅景天苷促進(jìn)ADSCs 的定向分化干預(yù)后2天，與對(duì)照組比較，高糖組的CK19、CD31、α-SMA表達(dá)量明顯減少，紅景天苷組的CK19、CD31、α-SMA 表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+紅景天苷組的CK19、CD31、α-SMA 表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖4、表1。

圖3 紅景天苷對(duì)高糖條件下ADSCs 遷移的影響Fig.3 Effect of salidroside on the migration of ADSCs under high glucose condition

圖4 紅景天苷對(duì)高糖條件下ADSCs 中CK19、CD31、α-SMA 表達(dá)的影響Fig.4 Effect of salidroside on the expression of CK19，CD31，α-SMA in ADSCs under high glucose condition

2.5 紅景天苷預(yù)處理ADSCs 移植促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的大體觀察及形態(tài)學(xué)觀察與模型組比較，ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs 組的創(chuàng)面愈合率均增加（P＜0.05）且紅景天苷+ADSCs 組的創(chuàng)面愈合率高于ADSCs 組（P＜0.05），見(jiàn)表2；HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變顯示，模型組創(chuàng)面組織中存在大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，新生血管及成纖維細(xì)胞減少；ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs組創(chuàng)面組織中成纖維細(xì)胞增多、炎癥細(xì)胞減少且紅景天苷+ADSCs 組的變化較ADSCs 組更明顯，見(jiàn)圖5。

表1 紅景天苷對(duì)高糖條件下ADSCs 中CK19、CD31、α-SMA 表達(dá)的影響Tab.1 Effect of salidroside on the expression of CK19，CD31，α-SMA in ADSCs under high glucose condition ±s

表1 紅景天苷對(duì)高糖條件下ADSCs 中CK19、CD31、α-SMA 表達(dá)的影響Tab.1 Effect of salidroside on the expression of CK19，CD31，α-SMA in ADSCs under high glucose condition ±s

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與高糖組比較，#P ＜0.05

組別對(duì)照組高糖組高糖+紅景天苷組紅景天苷組例數(shù)4 4 4 4 CK19 0.78±0.16 0.40±0.09*0.89±0.14*1.19±0.24#CD31 0.69±0.08 0.31±0.07*0.60±0.07*0.93±0.18#α-SMA 0.52±0.09 0.24±0.07*0.58±0.10*0.79±0.14#

表2 紅景天苷預(yù)處理ADSCs 移植對(duì)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率的影響Tab.2 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on skin wound healing rate in diabetic rats x±s

2.6 紅景天苷預(yù)處理ADSCs增加糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中膠原的表達(dá)量與模型組比較ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs 組皮膚創(chuàng)面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）且紅景天苷+ADSCs 組皮膚創(chuàng)面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)量明顯高于ADSCs組（P＜0.05）。見(jiàn)圖6、表3。

2.7 紅景天苷預(yù)處理ADSCs增加糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 的表達(dá)量與模型組比較，ADSCs 組、紅景天苷+ADSCs 組皮膚創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 的表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）且紅景天苷+ADSCs 組皮膚創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 的表達(dá)量明顯高于ADSCs 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖7、表4。

3 討論

ADSCs 是創(chuàng)面修復(fù)常用的一類干細(xì)胞［11-12］，多項(xiàng)研究報(bào)道，高糖環(huán)境顯著抑制ADSCs 的增殖、遷移及分化［13-16］。本研究分離ADSCs 并用高糖培養(yǎng)基處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖、遷移受抑制，表皮、血管內(nèi)皮、血管平滑肌的標(biāo)志基因CK19、CD31、α-SMA 表達(dá)降低，表明高糖對(duì)ADSCs 的增殖、遷移及分化具有抑制作用，與既往其他學(xué)者的研究結(jié)果吻合。

圖5 紅景天苷預(yù)處理ADSCs 移植對(duì)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面形態(tài)學(xué)的影響（HE 染色，×400）Fig.5 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on skin wound morphology in diabetic rats（HE staining，×400）

圖6 紅景天苷預(yù)處理ADSCs 移植對(duì)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達(dá)的影響Fig.6 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on Col-Ⅰ，Col-Ⅲexpression in skin wound in diabetic rats

圖7 紅景天苷預(yù)處理ADSCs 移植對(duì)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 表達(dá)的影響Fig.7 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on CK19，CD31，α-SMA expression in skin wound in diabetic rats

表3 紅景天苷預(yù)處理ADSCs 移植對(duì)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達(dá)的影響Tab.3 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on Col-Ⅰ，Col-Ⅲexpression in skin wound in diabetic rats x±s

ADSCs 在高糖環(huán)境下的上述變化會(huì)直接影響其修復(fù)糖尿病潰瘍創(chuàng)面的作用，需要進(jìn)行必要的干預(yù)。國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究使用白細(xì)胞介素8、趨化因子-8 進(jìn)行干預(yù)后，能夠減輕高糖引起的ADSCs 損傷［13-14］；國(guó)外學(xué)者的研究使用HIF-1α、CDC42 基因修飾的方式減輕了高糖引起的ADSCs 損傷［15-16］。紅景天苷是藏藥紅景天的活性成分，對(duì)高糖引起的多種細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［17-19］。本實(shí)驗(yàn)在高糖環(huán)境下加用紅景天苷對(duì)ADSCs 進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠減輕高糖對(duì)ADSCs 增殖、遷移、分化的抑制作用。

表4 紅景天苷預(yù)處理ADSCs 移植對(duì)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 表達(dá)的影響Fig.4 Effect of salidroside pretreated ADSCs transplantation on CK19，CD31，α-SMA expression in skin wound in diabetic rats±s

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與ADSCs 組比較，#P ＜0.05

組別 例數(shù)CK19CD31α-SMA模型組ADSCs 組紅景天苷ADSCs 組8 8 8 0.40±0.09 0.67±0.13*0.93±0.17#0.35±0.07 0.70±0.12*1.04±0.20#0.24±0.05 0.56±0.09*0.94±0.18#

干細(xì)胞在創(chuàng)面內(nèi)的歸巢并向上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞分化能夠促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)［20-22］。本實(shí)驗(yàn)在建立糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的模型后進(jìn)行了ADSCs 的移植，單純移植ADSCs 能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合、增加創(chuàng)面中的血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，而移植紅景天苷預(yù)處理的ADSCs 能夠增強(qiáng)上述促愈合作用，且創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA 的表達(dá)均增加。這一結(jié)果表明紅景天苷預(yù)處理的ADSCs 具有更強(qiáng)的創(chuàng)面修復(fù)能力，紅景天苷可能通過(guò)促進(jìn)ADSCs 增殖、遷移及分化的方式增強(qiáng)ADSCs 的創(chuàng)面修復(fù)能力。

綜上所述，紅景天苷對(duì)ADSCs 的增殖、遷移、分化具有促進(jìn)作用，移植紅景天苷預(yù)處理的ADSCs 能夠促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合，促進(jìn)ADSCs 增殖、遷移及其向表皮、血管內(nèi)皮及血管平滑肌分化是可能的分子機(jī)制。但是目前關(guān)于ADCSs進(jìn)入體內(nèi)后增殖、定向分化并分布至潰瘍的機(jī)制尚未明確，今后應(yīng)通過(guò)更多的在體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明ADCSs 或其他干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后的增殖、分化、遷移過(guò)程及相關(guān)機(jī)制。