DCD供腎灌注液生物標(biāo)志物預(yù)測腎移植術(shù)后移植物功能延遲恢復(fù)的臨床應(yīng)用研究

李馨 孫澤家 蔡繼飛 王瑋

我國于2015年1月1日起開始停用傳統(tǒng)的尸體供腎，主要采用心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD）供腎。腎移植術(shù)后移植物功能延遲恢復(fù)（delayed graft function，DGF）是術(shù)后早期嚴(yán)重的并發(fā)癥，國外研究發(fā)現(xiàn)DGF發(fā)生率高達(dá)25.2%～58.5%[1-3]，而采用DCD供腎是其發(fā)生的重要危險因素[4]。DGF還可增加急性排斥反應(yīng)、早期移植物失功、慢性排斥反應(yīng)等并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險。有研究表明，發(fā)生DGF腎移植受者的術(shù)后1年內(nèi)移植物失功的發(fā)生率成倍增長[5-8]。因此，早期評估供腎功能，及時診斷和治療DGF有助于挽救移植物功能，延長受者和移植腎存活時間。

近年來，一些可用于預(yù)測腎移植術(shù)后DGF發(fā)生的生物標(biāo)志物受到了器官移植界的廣泛關(guān)注，如中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL）、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白（liver-type fatty acid-binding protein,L-FABP）、白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）、腎損傷分子-1（kidney injury molecule，KIM-1）等。隨著器官保存方式的改進(jìn)，生物標(biāo)志物的取材也從供、受者體液標(biāo)本逐漸轉(zhuǎn)向更加無創(chuàng)的灌注液標(biāo)本[1,9-15]。除了機械灌注儀器中的灌注液標(biāo)本，近期也有研究證明，靜態(tài)冷保存（static cold storage, SCS）的供腎在行靜態(tài)沖洗灌注時，灌注液中亦可檢測出與DGF發(fā)生相關(guān)的生物標(biāo)志物[2]。這為我國一些尚未常規(guī)使用機械灌注儀器的移植中心提供了新的研究方向。本研究通過檢測DCD供腎SCS灌注液中所含的4種生物標(biāo)志物NGAL、KIM-1、L-FABP和IL-18的水平，探討其預(yù)測腎移植受者術(shù)后DGF發(fā)生的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年8月7日至2017年12月13日在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院首次接受DCD供腎腎移植的64例受者和47例供者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）供腎熱缺血時間＜10 min；（2）供者無心肺復(fù)蘇史；（3）獲取前供者收縮壓＞ 100 mmHg（10 mmHg=1.33 kPa）。47例供者中，男40例，女7例，年齡48（36，66）歲。死亡原因分別為腦出血20例、腦外傷26例、外傷1例。47例供者共獲取94個供腎，本研究共納入供腎64個，其余供腎均分派給其他器官移植中心使用。

根據(jù)受者術(shù)后是否發(fā)生DGF分為DGF組（7例）與即刻腎功能恢復(fù)（immediate graft function，IGF）組（57例）。DGF診斷標(biāo)準(zhǔn)為：同種異體腎移植術(shù)后1周內(nèi)需進(jìn)行血液透析或血液濾過腎臟替代治療。DGF組中，男6例，女1例，年齡（45±8）歲，原發(fā)病包括IgA腎病4例，慢性腎小球腎炎1例，血管膠質(zhì)瘤綜合征1例，其他1例；IGF組中，男37例，女20例，年齡（43±12）歲，原發(fā)病包括IgA腎病32例、慢性腎小球腎炎13例、紫癜性腎炎1例，多囊腎1例，其他10例。兩組受者年齡、性別等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＞0.05）。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 手術(shù)方式及術(shù)后免疫抑制方案

受者均于全身麻醉下行同種異體腎移植術(shù)。術(shù)前使用巴利昔單抗或抗人T細(xì)胞免疫球蛋白進(jìn)行免疫誘導(dǎo)，術(shù)后常規(guī)采用他克莫司+嗎替麥考酚酯+潑尼松的三聯(lián)免疫抑制方案。

1.3 檢測方法

嚴(yán)格控制修腎液體入量，取各組DCD供腎術(shù)前SCS灌注液20 mL進(jìn)行檢測，分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）檢測并計算其中NGAL、KIM-1、IL-18和L-FABP 4種生物標(biāo)志物的水平。

1.4 研究方法

比較兩組供腎灌注液各生物標(biāo)志物（NGAL、KIM-1、IL-18和L-FABP）的水平并分析其與DGF的相關(guān)性；分析各生物標(biāo)志物對腎移植受者術(shù)后發(fā)生DGF的預(yù)測價值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示。組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料以率表示。相關(guān)性分析采用Spearman法。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析各生物標(biāo)志物預(yù)測DGF的靈敏度和特異度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組供腎灌注液各生物標(biāo)志物水平的比較及與DGF的相關(guān)性分析

64例DCD供腎腎移植受者中，7例術(shù)后發(fā)生DGF，發(fā)生率為11%（7/64）。對兩組受者的DCD供腎灌注液中4種生物標(biāo)志物水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，NGAL、L- FABP、 KIM-1、IL-18的樣品檢出率分別為100%、97%、98%、61%。DGF組的NGAL水平高于IGF組（P=0.009），兩組間IL-18、KIM-1和L-FABP水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＞0.05）。兩組DCD供腎灌注液中各生物標(biāo)志物的水平見圖1。

圖1 兩組DCD供腎灌注液中各生物標(biāo)志物水平的比較Figure 1 Comparison of biomarker levels in DCD donor kidney perfusate between two groups

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，灌注液中的NGAL水平與腎移植術(shù)后DGF的發(fā)生呈正相關(guān)（r=0.430，P＜0.001）。

2.2 各生物標(biāo)志物對腎移植受者術(shù)后發(fā)生DGF的預(yù)測價值分析

ROC曲線結(jié)果顯示，DCD供腎灌注液中NGAL和KIM-1水平升高對腎移植受者術(shù)后發(fā)生DGF具有一定的預(yù)測價值，最佳截取值分別為204.130 ng/mL和100.480 ng/mL，診斷DGF的靈敏度分別為1.000和1.000，特異度分別為0.719和0.702，預(yù)測DGF發(fā)生的曲線下面積（area under curve，AUC）可達(dá)最高，分別為0.897[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI） 0.798～0.997]和 0.782（95%CI0.676～0.888）（均為P＜0.05，圖2）。而L-FABP和IL-18則無明顯預(yù)測意義（均為P＞0.05，圖2）。

圖2 各生物標(biāo)志物預(yù)測腎移植受者術(shù)后發(fā)生DGF的ROC曲線分析Figure 2 ROC curve analysis of each biomarker for predicting DGF in recipients after renal transplantation

當(dāng)聯(lián)合檢測NGAL和KIM-1時，預(yù)測腎移植受者術(shù)后發(fā)生DGF的AUC為0.932（95%CI0.850～1.000），靈敏度為1.000，特異度為0.754（P＜0.05），表明聯(lián)合檢測NGAL和KIM-1具有較好的預(yù)測效能。

3 討 論

近年來隨著免疫學(xué)及移植學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，腎移植受者的生存時間大幅度延長，但DCD供者與擴大標(biāo)準(zhǔn)供者（expended criteria donor，ECD）的使用增加，導(dǎo)致腎移植術(shù)后DGF、移植腎原發(fā)性無功能等并發(fā)癥的發(fā)生率越來越高。文獻(xiàn)報道我國DCD供腎腎移植術(shù)后DGF的發(fā)生率為15.2%～31.0%[7]，而在國外部分移植中心腎移植術(shù)后DGF的發(fā)生率可高達(dá)25.5%～85.0%[1-3,16-18]。DGF可增加術(shù)后早期移植物失功、移植物功能障礙和慢性移植腎排斥反應(yīng)相關(guān)風(fēng)險[4-5,19-20]，因此減少使用高風(fēng)險供腎，早期診斷和干預(yù)應(yīng)作為DGF綜合治療的重中之重。

目前國際上DGF的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)尚存在主觀性較強或診斷時間延遲從而影響治療等問題[21]。近年來研究者從供、受者的生物樣本中提取生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測，在腎移植術(shù)后發(fā)生DGF的預(yù)判方面已經(jīng)取得了不錯的進(jìn)展。有研究報道，從供者的血液、尿液中提取NGAL、胱抑素C等進(jìn)行檢測，可以發(fā)現(xiàn)其與腎移植受者術(shù)后DGF發(fā)生存在相關(guān)性[18,22-23]；在受者的尿液和血液中檢測IL-18、NAGL、L-FABP、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）等亦發(fā)現(xiàn)其與腎移植術(shù)后發(fā)生DGF存在相關(guān)性[15,24-30]。研究發(fā)現(xiàn)，在供腎灌注液（包括機械灌注液及SCS灌注液）中檢測相關(guān)生物標(biāo)志物也可發(fā)現(xiàn)其與DGF的發(fā)生、持續(xù)時間以及受者長期預(yù)后存在相關(guān)性。檢測灌注液中的生物標(biāo)志物對受者影響小且易于獲得，能在手術(shù)之前對供腎質(zhì)量進(jìn)行提前預(yù)判，進(jìn)而給出指導(dǎo)性的免疫治療方案，因而受到了研究者的廣泛關(guān)注[31]。

目前國際文獻(xiàn)報道的可以用來預(yù)測DGF的生物標(biāo)志物大多是在機械灌注液中得到的[1,3,17,32]。筆者在進(jìn)行本研究前進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)檢索時，僅發(fā)現(xiàn)1篇文章使用了同樣的SCS狀態(tài)下的供腎靜態(tài)灌注沖洗液作為生物檢材檢測部分相關(guān)生物標(biāo)志物，證實灌注液中的NGAL水平升高是DGF發(fā)生的危險因素[2]。經(jīng)筆者查閱文獻(xiàn)，本研究為國內(nèi)外首次報道DCD供腎術(shù)前SCS灌注液中的NGAL、L-FABP、KIM-1、IL-18均可被檢測出，除了IL-18以外，NGAL、L-FABP、KIM-1在灌注液中的檢出率均在95%以上。Hoogland等[17]對低溫機械灌注4 h后的機械灌注液進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，灌注液中的NAGL水平與DGF的發(fā)生存在相關(guān)性。與以往研究結(jié)果一致，本研究證實了灌注液中的NGAL水平與DGF的發(fā)生呈正相關(guān)（r=0.430，P＜0.001）。同時發(fā)現(xiàn)，NGAL和KIM-1都可以在一定程度上預(yù)測腎移植術(shù)后DGF的發(fā)生，其中NGAL對DGF的預(yù)測準(zhǔn)確性更加可靠。聯(lián)合檢測NGAL與KIM-1評估供腎功能時，其預(yù)測準(zhǔn)確性更佳。

SCS灌注液與機械灌注液相比，其優(yōu)勢包括成本低廉、獲取樣本濃度更高等。對于我國很多尚未廣泛使用機械灌注作為供器官保存方式的移植中心而言，僅通過供腎術(shù)前SCS灌注液就可以獲得同樣具有臨床評價意義的生物標(biāo)本，可使移植中心和受者從中同時獲益。

本研究亦存在一些不足之處，如無法排除術(shù)中血壓變化等因素的干擾，未能將供者更加詳細(xì)的信息納入對比等。本次入組樣本量較少，需要在將來的臨床及科研工作中擴大樣本量，從而獲得更有臨床指導(dǎo)意義的研究結(jié)果，以更準(zhǔn)確、科學(xué)地評估供腎生物標(biāo)志物與腎移植術(shù)后DGF發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系。

綜上所述，本研究首次證明了可將供腎術(shù)前SCS灌注液作為研究樣本檢測NGAL、L-FABP、KIM-1、IL-18水平，且發(fā)現(xiàn)NGAL水平與腎移植術(shù)后DGF的發(fā)生存在相關(guān)性。單獨檢測NGAL或KIM-1可在一定程度上預(yù)測腎移植受者術(shù)后DGF的發(fā)生。聯(lián)合檢測灌注液中的NGAL和KIM-1可以較好地預(yù)測腎移植受者術(shù)后DGF的發(fā)生。后續(xù)研究可以此為基礎(chǔ)擴展樣本量，繼續(xù)深入相關(guān)方向的研究，從而獲得更具有臨床指導(dǎo)意義的研究結(jié)果。