馬齒莧酰胺E干預(yù)腎癌的作用機(jī)制研究

陳盛燁，黃 航，葉挺宇，潘 悅

馬齒莧酰胺E干預(yù)腎癌的作用機(jī)制研究

陳盛燁，黃 航，葉挺宇，潘 悅

溫州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325035

探討馬齒莧酰胺E對(duì)人腎癌786-O細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用及機(jī)制。體外培養(yǎng)786-O細(xì)胞，給予馬齒莧酰胺E（10、20、40 μmol/L）進(jìn)行干預(yù)，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；采用Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力；采用AO/EB試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。建立裸鼠移植瘤腎癌模型，給予馬齒莧酰胺E（3、15 mg/kg）進(jìn)行干預(yù)，測(cè)定各組裸鼠腫瘤質(zhì)量及體積，采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀(guān)察腫瘤組織病理變化；采用Western blotting法檢測(cè)786-O細(xì)胞和荷瘤裸鼠瘤組織中細(xì)胞增殖標(biāo)志物如Ki67、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）及凋亡標(biāo)志物如活化半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）、Cleaved Caspase-9及侵襲相關(guān)蛋白如基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9及希佩爾-林道抑癌基因（Von Hippel-Lindau，VHL）/缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）通路相關(guān)蛋白VHL、HIF-1α的表達(dá)情況。馬齒莧酰胺E顯著抑制786-O細(xì)胞活力（＜0.05、0.01），下調(diào)Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）；明顯促進(jìn)786-O細(xì)胞凋亡（＜0.05、0.01），上調(diào)Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）；有效改善786-O細(xì)胞遷移與侵襲能力（＜0.05、0.01），顯著降低MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）；顯著上調(diào)VHL蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）并顯著下調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)水平（＜0.01）。馬齒莧酰胺E可有效降低荷瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量與體積（＜0.05、0.01），抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，顯著下調(diào)Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9、HIF-1α蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），顯著上調(diào)Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、VHL蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）。馬齒莧酰胺E體外可有效抑制786-O細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，促進(jìn)786-O細(xì)胞凋亡，體內(nèi)可有效降低荷瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量與體積，其作用機(jī)制可能與調(diào)控VHL/HIF通路及其下游蛋白表達(dá)有關(guān)。

腎癌；遷移；侵襲；馬齒莧酰胺E；VHL/HIF-1α信號(hào)通路

腎癌是臨床常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在成年人惡性腫瘤中占2%，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新增患者403 262例、死亡175 098例[1]。30%患者初次診斷時(shí)已為晚期，60%確診患者由于轉(zhuǎn)移性腎癌其5年生存率僅為10%[2]。吸煙、肥胖、高血壓為腎癌的主要誘導(dǎo)因素[3]。目前臨床通常采用手術(shù)切除或術(shù)后輔助治療等方式治療腎癌，但術(shù)后復(fù)發(fā)率仍高達(dá)20%～40%[4]。近年腎癌分子靶向治療成為研究熱門(mén)，然而靶向藥物易產(chǎn)生耐藥性且價(jià)格昂貴，中位緩解率僅為1.5～2.0年[5]。因此尋找療效佳、不良反應(yīng)小的治療藥物尤為重要。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在改善腎癌患者的臨床癥狀、生存質(zhì)量等方面表現(xiàn)良好[6-7]。馬齒莧是莧科植物馬齒莧L.的干燥地上部分，又名“長(zhǎng)壽菜”，其性寒味酸，具有清熱解毒、涼血止血等功效，通常用于治療熱毒血痢、癰腫疔瘡、濕疹等[8]。馬齒莧的主要成分為生物堿類(lèi)、萜類(lèi)、香豆素類(lèi)、黃酮類(lèi)等化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、降血糖、調(diào)血脂等多種藥理活性[9-11]。馬齒莧酰胺E是從馬齒莧中提取、分離得到的四氫異喹啉并吡咯烷酮類(lèi)生物堿[12]，具有良好的抗氧化、抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用[13]。本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)考察馬齒莧酰胺E對(duì)腎癌的治療作用及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c裸鼠20只，5周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2018-008。動(dòng)物于無(wú)菌層流房中給予無(wú)菌水及滅菌顆粒飼料飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)和溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)（2018025）。

1.2 細(xì)胞

人腎癌786-O細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.3 藥品與試劑

馬齒莧酰胺E（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)0464534-5）購(gòu)自美國(guó)Aurora Fine Chemicals公司；舒尼替尼（批號(hào)170304）購(gòu)自美國(guó)MCE公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號(hào)20180107）、蛋白抽提試劑盒（批號(hào)20181123）、ECL發(fā)光液（批號(hào)20181121）購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；AO/EB試劑盒（批號(hào)20190107）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Ki67抗體（批號(hào)GR256572-6）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（批號(hào)GR263410-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）抗體（批號(hào)GR276948-1）、MMP-9抗體（批號(hào)GR274709-18）、活化半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）抗體（批號(hào)GR213318-5）、Caspase-3抗體（批號(hào)GR52861-1）、Cleaved Caspase-9抗體（批號(hào)GR219248-2）、Caspase-9抗體（批號(hào)GR525572-1）、希佩爾-林道抑癌基因（Von Hippel-Lindau，VHL）抗體（批號(hào)GR254523-1）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）抗體（批號(hào)GR187744-1）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)S8946）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.4 儀器

CKX31倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、Ti-S倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Synergy HT酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）；Mimi Protean垂直電泳儀、SEM1-DRY電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；SW-CJ-IF細(xì)胞超凈工作臺(tái)（蘇州尚田生物技術(shù)公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

786-O細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞活力的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞，以2×104/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。參照文獻(xiàn)方法[14-15]，設(shè)置對(duì)照組、馬齒莧酰胺E（10、20、40 μmol/L）組及舒尼替尼（5 μmol/L）組，給藥組分別加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK8溶液，孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（）值。

2.3 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞凋亡的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞，以1×105/mL接種于24孔板中，每孔500 μL，培養(yǎng)24 h，設(shè)置對(duì)照組、馬齒莧酰胺E（10、20、40 μmol/L）組及舒尼替尼（5 μmol/L）組，給藥組分別加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，按照AO/EB試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

2.4 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞遷移的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞，以5×105/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，進(jìn)行劃痕。設(shè)置對(duì)照組、馬齒莧酰胺E（10、20、40 μmol/L）組及舒尼替尼（5 μmol/L）組，用PBS洗滌3次，給藥組分別加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、24 h在顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

2.5 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞侵襲的影響

Transwell小室中加入60 μL Matrigel膠，于培養(yǎng)箱中孵育5 h。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞，以5×105/mL接種于Transwell小室中，每孔100 μL。Transwell小室下室中加入1 mL培養(yǎng)基。設(shè)置對(duì)照組及馬齒莧酰胺E（10、20、40 μmol/L）組及舒尼替尼（5 μmol/L）組，給藥組分別加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。PBS洗滌，棉簽擦拭Transwell小室內(nèi)的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定5 min，吉姆薩染色8 min，PBS洗滌，于顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

2.6 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞Ki67、PCNA、MMP-2、MMP-9、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Caspase-9、VHL和HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞，以5×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、馬齒莧酰胺E（10、20、40 μmol/L）組及舒尼替尼（5 μmol/L）組，給藥組分別加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞。

各組細(xì)胞加入RIPA裂解液，離心并提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛血清白蛋白封閉，分別加入Ki67、PCNA、MMP-2、MMP-9、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Caspase-9、VHL、HIF-1α抗體（1∶1000），孵育過(guò)夜；TBST洗滌，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，于室溫孵育1 h，TBST洗滌后，滴加ECL液進(jìn)行顯影成像，采用Image J軟件對(duì)條帶蛋白光密度進(jìn)行分析。

2.7 荷瘤裸鼠腎癌模型的建立、分組與給藥

按照文獻(xiàn)方法[16-18]，裸鼠于腹部sc 100 μL 786-O細(xì)胞（2×107/mL），當(dāng)瘤體積達(dá)到25 mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和馬齒莧酰胺E低、高劑量（3、15 mg/kg）組及舒尼替尼（7.5 mg/kg）組，每組5只。馬齒莧酰胺E溶于0.5% CMC-Na溶液分別配制成質(zhì)量濃度為0.3、1.5 mg/mL的溶液，各給藥組ig 2 mL相應(yīng)藥物，對(duì)照組ig等體積CMC-Na溶液，1次/d，連續(xù)4周。給藥結(jié)束后，裸鼠脫頸椎處死，取瘤組織，稱(chēng)定質(zhì)量，用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤組織的最長(zhǎng)直徑與最短直徑，計(jì)算腫瘤體積。

2.8 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織病理變化的影響

取各組裸鼠瘤組織，除去胞膜，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片（厚4 μm），HE染色后于顯微鏡下觀(guān)察。

2.9 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織Ki67、PCNA、MMP-2、MMP-9、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Caspase-9、VHL和HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

各組裸鼠瘤組織按“2.6”項(xiàng)下方法提取蛋白，并采用Western blotting法考察瘤組織Ki67、PCNA、MMP-2、MMP-9、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Caspase-9、VHL、HIF-1α蛋白表達(dá)情況。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞增殖和凋亡的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，馬齒莧酰胺E可顯著抑制786-O細(xì)胞活力（＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性；如圖2所示，馬齒莧酰胺E可顯著促進(jìn)786-O細(xì)胞凋亡（＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.2 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，馬齒莧酰胺E顯著抑制786-O細(xì)胞的遷移與侵襲（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性。

3.3 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，馬齒莧酰胺E（20、40 μmol/L）顯著降低Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），馬齒莧酰胺E（10 μmol/L）顯著降低Ki67蛋白表達(dá)水平（＜0.05）。

圖2 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞凋亡的影響()

圖3 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞遷移(A、C) 與侵襲(B、D) 的影響()

圖4 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞Ki67及PCNA蛋白表達(dá)的影響()

3.4 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，馬齒莧酰胺E（20、40 μmol/L）顯著升高Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），馬齒莧酰胺E（10 μmol/L）顯著升高Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平（＜0.05）。

3.5 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，馬齒莧酰胺E顯著降低MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性。

3.6 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞VHL/HIF-1α相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，馬齒莧酰胺E顯著升高VHL蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），顯著降低HIF-1α蛋白表達(dá)水平（＜0.01），呈劑量相關(guān)性。

圖5 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞Caspase-3及Caspase-9蛋白表達(dá)的影響()

圖6 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)的影響()

圖7 馬齒莧酰胺E對(duì)786-O細(xì)胞VHL及HIF-1α蛋白表達(dá)的影響()

3.7 馬齒莧酰胺E對(duì)裸鼠腫瘤大小的影響

如圖8所示，與對(duì)照組比較，馬齒莧酰胺E可明顯降低裸鼠的瘤質(zhì)量與瘤體積（＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性。

3.8 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織病理變化的影響

如圖9所示，對(duì)照組裸鼠腫瘤組織中瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞排列紊亂、大小不一，未見(jiàn)凋亡細(xì)胞；細(xì)胞核呈圓形，核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，且核仁明顯。各給藥組裸鼠腫瘤組織中瘤細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞壞死、凋亡明顯，細(xì)胞器腫脹，部分瘤細(xì)胞僅留有裸核，偶見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3.9 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖10所示，與對(duì)照組比較，馬齒莧酰胺E顯著降低Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性。

3.10 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖11所示，與對(duì)照組比較，馬齒莧酰胺E顯著升高Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性。

圖8 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量(A) 與體積(B) 的影響()

圖9 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織病理變化的影響(HE, ×200)

圖10 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織Ki67及PCNA蛋白表達(dá)的影響()

圖11 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織Caspase-3及Caspase-9蛋白表達(dá)的影響()

3.11 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖12所示，與對(duì)照組比較，馬齒莧酰胺E（15 mg/kg）顯著降低MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平（＜0.01），馬齒莧酰胺E（3 mg/kg）顯著降低MMP-9蛋白表達(dá)水平（＜0.05），且呈劑量相關(guān)性。

3.12 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織VHL/ HIF-1α相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖13所示，與對(duì)照組比較，馬齒莧酰胺E顯著升高VHL蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），顯著降低HIF-1α蛋白表達(dá)水平（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。

圖12 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)的影響()

圖13 馬齒莧酰胺E對(duì)荷瘤裸鼠瘤組織VHL及HIF-1α蛋白表達(dá)的影響()

4 討論

近年來(lái)，惡性腫瘤、糖尿病及腦血管疾病已成為危害人類(lèi)生命的“三大殺手”，其中腎癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤[19]。根據(jù)病理分型，腎癌可分為透明細(xì)胞癌、乳頭狀癌、嫌色細(xì)胞癌等[20]。由于腎癌屬于化療抵抗性癌癥，手術(shù)治療不能徹底清除癌細(xì)胞，因此腎癌易復(fù)發(fā)、預(yù)后較差[21]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為腎癌具有腰痛、血尿、腫塊等癥狀，與“尿血”“腎積”“腰痛”等病相關(guān)，臨床通常治法主要包括健脾益腎、清熱利濕、活血化瘀等[22-23]。隨著傳統(tǒng)中藥的深入開(kāi)發(fā)，中藥的多靶點(diǎn)及整體調(diào)理功能在腫瘤治療中備受關(guān)注[24]。馬齒莧是我國(guó)歷代本草醫(yī)書(shū)中記載的中草藥，其重要成分馬齒莧酰胺E具有良好的藥理活性[13]，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)腎癌786-O細(xì)胞及體內(nèi)建立荷瘤裸鼠模型，深入探討馬齒莧酰胺E抗腎癌的活性及作用機(jī)制。

Ki67及PCNA作為生物標(biāo)志物廣泛應(yīng)用于腫瘤的診治[25]。Ki67、PCNA是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)，Ki67、PCNA表達(dá)越高，癌細(xì)胞增殖指數(shù)越強(qiáng)[26]。本研究結(jié)果顯示，馬齒莧酰胺E可有效抑制786-O細(xì)胞增殖，下調(diào)Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物研發(fā)的重要手段，細(xì)胞凋亡途徑可分為線(xiàn)粒體途徑和外源性死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抗腫瘤藥物能夠通過(guò)上述細(xì)胞程序激活Cleaved Caspase-9，誘導(dǎo)Cleaved Caspase-3活化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[27-28]。本研究結(jié)果顯示，馬齒莧酰胺E可有效誘導(dǎo)786-O細(xì)胞凋亡，上調(diào)Caspase-3及Caspase-9的活化水平，表明馬齒莧酰胺E通過(guò)下調(diào)Ki67、PCNA表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3、Caspase-9活化，從而調(diào)節(jié)786-O細(xì)胞增殖與凋亡的平衡。腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲與細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)，作為降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，當(dāng)MMP分泌增加時(shí)可加劇腫瘤侵襲[29-30]。本研究結(jié)果顯示，馬齒莧酰胺E可有效下調(diào)786-O細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞的遷移與侵襲，表明馬齒莧酰胺E通過(guò)抑制MMP-2、MMP-9表達(dá)，從而抑制786-O細(xì)胞遷移與侵襲能力。VHL/HIF信號(hào)通路在腎癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用[31-32]。VHL作為重要的抑癌因子，其異常表達(dá)可導(dǎo)致HIF-1α處于穩(wěn)定狀態(tài)，降解減少。HIF-1α的累積可激活一系列缺氧反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲，最終導(dǎo)致腎癌的發(fā)生與發(fā)展[33-34]。本研究結(jié)果顯示，馬齒莧酰胺E可有效上調(diào)786-O細(xì)胞中抑癌因子VHL蛋白表達(dá)，抑制其下游蛋白HIF-1α表達(dá)，表明馬齒莧酰胺E可通過(guò)調(diào)控VHL/HIF-1α信號(hào)通路，從而抑制786-O細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。裸鼠腎癌移植瘤模型結(jié)果顯示，馬齒莧酰胺E可有效降低裸鼠腫瘤組織質(zhì)量與體積，抑制腫瘤組織內(nèi)部細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)控VHL/HIF-1α信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，馬齒莧酰胺E可通過(guò)下調(diào)Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平，抑制786-O細(xì)胞增殖；通過(guò)上調(diào)Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)786-O細(xì)胞凋亡；下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平，抑制786-O細(xì)胞遷移與侵襲；并可通過(guò)調(diào)控VHL/HIF-1α信號(hào)通路，從而治療腎癌。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I,. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]., 2018, 68(6): 394-424.

[2] Lou S, Ren L, Xiao J,. Expression profiling based graph-clustering approach to determine renal carcinoma related pathway in response to kidney cancer [J]., 2012, 16(6): 775-780.

[3] 趙振威, 李延江. 腎細(xì)胞癌流行病學(xué)的研究進(jìn)展 [J]. 山東醫(yī)藥, 2013, 53(7): 95-97.

[4] Janzen N K, Kim H L, Figlin R A,. Surveillance after radical or partial nephrectomy for localized renal cell carcinoma and management of recurrent disease [J]., 2003, 30(4): 843-852.

[5] Lecis D, Sangaletti S, Colombo M P,. Immune checkpoint ligand reverse signaling: Looking back to go forward in cancer therapy [J]., 2019, 11(5): 624.

[6] 劉睿, 鄧躍毅. 腎癌術(shù)后的中醫(yī)藥治療體會(huì) [J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志, 2009, 10(7): 629.

[7] 周小海. 淺談中醫(yī)治療腎腫瘤 [J]. 醫(yī)學(xué)信息, 2014, 27(27): 527.

[8] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2015: 49-50.

[9] 王天寧, 劉玉婷, 肖鳳琴, 等. 馬齒莧化學(xué)成分及藥理活性的現(xiàn)代研究整理 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2018, 24(6): 224-234.

[10] 秦月雯, 侯金麗, 王萍, 等. 馬齒莧“成分-活性-中藥功效-疾病”研究進(jìn)展及關(guān)聯(lián)分析 [J]. 中草藥, 2020, 51(7): 1924-1938.

[11] 鮑守民, 賈紅梅, 鄒忠梅, 等. 馬齒莧生物堿的研究進(jìn)展[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2020, 43(6): 1174-1182.

[12] Xiang L, Xing D, Wang W,. Alkaloids fromL. [J]., 2005, 66(21): 2595-2601.

[13] 李玲玉. 馬齒莧酰胺E和馬齒莧提取物的神經(jīng)保護(hù)和抗炎活性研究[D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué), 2018.

[14] 孫洪祥. 馬齒莧酰胺E對(duì)帕金森病模型的保護(hù)作用研究 [D]. 濟(jì)南: 山東大學(xué), 2016.

[15] Wen J, Li H Z, Ji Z G,. Human urothelial carcinoma cell response to sunitinib malate therapy[J]., 2015, 15: 26.

[16] 姜小良, 尹志康, 譚兵, 等. 藤黃酸聯(lián)合舒尼替尼抑制腎癌細(xì)胞的增殖 [J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 36(7): 687-690.

[17] Li L, Jiao Y, Jin T,. Phenolic alkaloid oleracein E attenuates oxidative stress and neurotoxicity in AlCl3- treated mice [J]., 2017, 191: 211-218.

[18] 孫飛達(dá). 舒尼替尼對(duì)裸鼠腎癌干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究 [D]. 太原: 山西醫(yī)科大學(xué), 2012.

[19] Farhadieh R D, Smee R, Ow K,. Down-regulation of KAI1/CD82 protein expression in oral cancer correlates with reduced disease free survival and overall patient survival [J]., 2004, 213(1): 91-98.

[20] 牛少曦, 馬鑫, 張瑜, 等. miR-223在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)與功能 [J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 35(3): 338-342.

[21] Khan M I, Sobocińska A A, Brodaczewska K K,. Involvement of the CB2cannabinoid receptor in cell growth inhibition and G0/G1cell cycle arrest via the cannabinoid agonist WIN55,212-2 in renal cell carcinoma [J]., 2018, 18(1): 583.

[22] 周微紅, 奚穎. 周維順治療腎癌經(jīng)驗(yàn)[J]. 江西中醫(yī)藥, 2012, 43(2): 12.

[23] 崔虎軍. 中醫(yī)藥治療腎癌淺探 [J]. 實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志, 2008, 22(3): 39-40.

[24] Nice E C, Fabri L, Hammacher A,. The purification of a Rap1 GTPase-activating protein from bovine brain cytosol [J]., 1992, 267(3): 1546-1553.

[25] 馬志君, 吉潔. Ki67與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)醫(yī)療前沿, 2012, 7(7): 15-17.

[26] 佘茁萃, 姜毅, 劉濤, 等. 腸艾舒對(duì)小鼠CT-26大腸癌組織Ki67和PCNA表達(dá)的影響 [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志, 2014, 21(4): 52-54.

[27] Le T D, Jin D, Rho S R,. Capsaicin-induced apoptosis of FaDu human pharyngeal squamous carcinoma cells [J]., 2012, 53(4): 834-841.

[28] Green D R, Kroemer G. The pathophysiology of mitochondrial cell death [J]., 2004, 305(5684): 626-629.

[29] Tang S W, Yang T C, Lin W C,. Nicotinamide-methyltransferase induces cellular invasion through activating matrix metalloproteinase-2 expression in clear cell renal cell carcinoma cells [J]., 2011, 32(2): 138-145.

[30] Kawata N, Nagane Y, Hirakata H,. Significant relationship of matrix metalloproteinase 9 with nuclear grade and prognostic impact of tissue inhibitor of metalloproteinase 2 for incidental clear cell renal cell carcinoma [J]., 2007, 69(6): 1049-1053.

[31] 涂福平, 黃莉, 王祥財(cái). 缺氧環(huán)境下VHL和HIF-1α的變化 [J]. 醫(yī)療裝備, 2017, 30(5): 93-94.

[32] Liu Q, Tong D, Liu G,. HIF2A germline-mutation- induced polycythemia in a patient with VHL-associated renal-cell carcinoma [J]., 2017, 18(12): 944-947.

[33] Liontos M, Trigka E A, Korkolopoulou P,. Expression and prognostic significance of VEGF and mTOR pathway proteins in metastatic renal cell carcinoma patients: A prognostic immunohistochemical profile for kidney cancer patients [J]., 2017, 35(3): 411-419.

[34] Cho H, Du X L, Rizzi J P,. On-target efficacy of a HIF-2α antagonist in preclinical kidney cancer models [J]., 2016, 539(7627): 107-111.

Effect and mechanism of oleracein E on renal carcinoma

CHEN Sheng-ye, HUANG Hang, YE Ting-yu, PAN Yue

Department of Urological Surgery, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China

To investigate the effect and mechanism of oleracein E on proliferation, invasion, and migration of human renal carcinoma 786-O cells.Human renal carcinoma 786-O cells were culturedand treated with oleracein E (10, 20, and 40 μmol/L) for intervention. CCK-8 method was used to detect cell proliferation; Scratch test was used to detect cell migration ability; Transwell chamber method was used detect cell invasion ability; AO/EB kit was used to detect cell apoptosis rate. Kidney cancer model of transplanted tumor in nude mice was established and treated with oleracein E (3, 15 mg/kg) for intervention. Weight and volume of tumor in nude mice was determined, pathology changes of tumor tissue were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. Western blotting was used to detect expressions of cell proliferation marker such as Ki67 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA), apoptosis marker such as activated cysteine protease-3 (Cleaved Caspase-3) and Cleaved Caspase-9, invasion-related protein such as matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and MMP-9, Von Hippel-Lindau (VHL)/hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) pathway related proteins such as VHL and HIF-1α in 786-O cells and tumor tissues of nude mice.Viability of 786-O cells was significantly inhibited (< 0.05, 0.01), expressions of Ki-67 and PCNA were down-regulated (< 0.05, 0.01); Apoptosis of 786-O cells was significantly promoted (< 0.05, 0.01), expressions of Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 were up-regulated (< 0.05, 0.01); Migration and invasion ability of 786-O cells were effectively improved (< 0.05, 0.01), expressions of MMP-2 and MMP-9 were significantly reduced (< 0.05, 0.01); VHL protein expression was significantly up-regulated (< 0.05, 0.01) and HIF-1α protein expression was significantly down-regulated (< 0.01) by oleracein E. Weight and volume of tumor in tumor-bearing nude mice were effectively reduced (< 0.05, 0.01), proliferation of tumor cells was inhibited and apoptosis of tumor cells was promoted, Ki67, PCNA, MMP-2, MMP-9, HIF-1α expression were significantly down-regulated (< 0.05, 0.01), expressions of Cleaved Caspase-3, Cleaved Caspase-9, and VHL were significantly up-regulated (< 0.05, 0.01) by oleracein E.Oeracein E can effectively inhibit the proliferation, migration, and invasion of 786-O cells, promote the apoptosis of 786-O cells, and effectively reduce the tumor weight and volume of tumor-bearing nude mice, of which mechanism may be related to the regulation of VHL/HIF pathway and its downstream protein expression.

renal cancer; migration; invasion; oleracein E; VHL/HIF-1α signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2021)06 - 1672 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.016

2020-12-01

浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y202045313）

陳盛燁，男，副主任醫(yī)師，主要從事泌尿外科的臨床與基礎(chǔ)研究。Tel: 13857736357 E-mail: 734623202@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]