亞甲基四氫葉酸還原酶C677T基因多態(tài)性及相關(guān)代謝物與內(nèi)耳疾病的關(guān)系

宋穎慧，索利敏，董美，范林靜，白瑞，李赟，李強，趙長青

(1.山西醫(yī)科大學(xué),山西 太原 030001； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,山西 太原 030001; 3.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 中心實驗室,山西 太原 030001)

內(nèi)耳疾病指各種致病因素引起耳蝸前庭功能受損，臨床表現(xiàn)為聽力下降、眩暈、耳鳴等，常見有突發(fā)性聾、感音神經(jīng)性聾、梅尼埃病、前庭功能障礙、耳鳴等，大多數(shù)病因及發(fā)病機制不清，內(nèi)耳微循環(huán)損傷被認(rèn)為是其重要病理生理機制。大量研究發(fā)現(xiàn)亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因多態(tài)性是血管及細(xì)胞功能損傷的遺傳危險因素。MTHFR催化5，IO-亞甲基四氫葉酸還原成5-亞甲基四氫葉酸，基因多態(tài)性會使此關(guān)鍵酶活性下降，導(dǎo)致葉酸缺乏、高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血癥等，進(jìn)一步損傷血管細(xì)胞功能。本研究分析內(nèi)耳疾病患者與健康體檢者M(jìn)THFR基因多態(tài)性、血清Hcy及血清葉酸結(jié)果，探討相互關(guān)系，為內(nèi)耳疾病機制研究、預(yù)防及臨床診治提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019年4月—2019年11月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院住院進(jìn)行內(nèi)科治療的內(nèi)耳疾病患者175例作為疾病組，其中男84例，女91例；年齡38～65歲，平均年齡(51.35±14.22)歲。主要癥狀以聽力下降和眩暈、頭暈、耳鳴為主，統(tǒng)計疾病組患者的一般資料、MTHFRC677T基因多態(tài)性檢測結(jié)果、血清Hcy及血清葉酸水平結(jié)果，并將根據(jù)病因及臨床診斷分為突發(fā)性聾(sudden sensorineural hearing loss，SSHL)組80例、梅尼埃病(Meniere’s disease，MD)組36例、感音神經(jīng)性聾(sensorineural hearing loss，SHL)組18例和前庭功能障礙(vestibular dysfunction，VD)組41例。選取同期的健康體檢者175例作為對照組，其中男92例，女83例；年齡38～64歲，平均年齡(52.64±11.40)歲。兩組均排除嚴(yán)重心血管疾病、妊娠期婦女、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、中耳疾病、耳解剖結(jié)構(gòu)異常、耳良惡性腫瘤、頭部耳部外傷史、中耳內(nèi)耳手術(shù)史等。兩組的年齡、性別分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 實驗方法

MTHFR基因檢測方法為抽取抗凝外周血，進(jìn)行DNA提取，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增后，采用焦磷酸/毛細(xì)管電泳測序平臺對MTHFR基因常見突變位點(rs1801133)進(jìn)行基因測序。采用雙試劑循環(huán)酶法檢測血清Hcy水平，血清Hcy濃度升高>15 μmol/L為異常；血清葉酸濃度<10 nmol/L為異常。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基因型及等位基因分布頻率比較

MTHFRC677T基因檢測產(chǎn)生3種基因型，分別為CC、CT和TT,其中CT、TT均屬于突變型。疾病組基因型結(jié)果為CC 21例(12.0%)、CT 104例(59.4%)、TT 50例(28.6%)，對照組為CC 35例(20.0%)、CT 93例(53.1%)、TT 47例(26.9%),兩組均進(jìn)行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，符合遺傳平衡(P>0.05)，均具有群體代表性。兩組基因型總體分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各基因型頻率比較，疾病組CC型頻率低于對照組，突變型頻率(CT+TT)高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CT型、TT型頻率均略高于對照組(P>0.05)。疾病組等位基因頻率為C(41.7%)和T(58.3%),對照組為C(53.4%)和T(46.6%)，兩組等位基因分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，疾病組C頻率低于對照組，T頻率明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2 MTHFR基因多態(tài)性與內(nèi)耳疾病發(fā)生風(fēng)險

突變型(CT+TT)發(fā)生內(nèi)耳疾病的風(fēng)險是CC的1.397倍(OR=1.397，P<0.05)，風(fēng)險增加39.7%。其中CT是CC的1.408倍(OR=1.408，P<0.05)，風(fēng)險增加40.8%，TT是CC的1.375倍(OR=1.375，P>0.05)，TT是CT的0.976倍(OR=0.976，P>0.05)。等位基因T發(fā)生內(nèi)耳疾病風(fēng)險是C的1.264倍，增加26.4%(OR=1.264,P<0.05)。見表2。

2.3 各組內(nèi)耳疾病MTHFR C677T基因型及等位基因分布

將疾病組分為SSHL組80例、MD組36例、SHL組18例和VD組41例。各組與對照組相比，基因型總體分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；除SHL以外，其余各組等位基因C、T分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，T頻率高于對照組，C頻率低于對照組(P均<0.05)。各基因型頻率比較，MD組CC頻率低于對照組，突變型(CT+TT)頻率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；SHL組TT頻率低于對照組(P<0.05)。其余兩組各基因型頻率與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3、4。

2.4 各組內(nèi)耳疾病的發(fā)病風(fēng)險估計

突變型(CT+TT)發(fā)生MD的風(fēng)險是CC的3.615倍(OR=3.615，P<0.05)，風(fēng)險增加2.615倍，其中TT是CC的4.476倍(OR=4.476，P<0.05)，CT是CC的3.138倍(OR=3.138，P>0.05)，TT是CT的1.426倍(OR=1.426，P>0.05)。見表5。等位基因T突變發(fā)生SSHL、MD、VD的風(fēng)險分別是C的1.329倍(OR=1.329，P<0.05)、2.11倍(OR=1.329，P<0.05)、1.676倍(OR=1.676，P<0.05)。見表6。

表1 MTHFR基因C677T位點的基因型分布頻率及等位基因分布頻率 [例(%)]

表2 MTHFR基因C677T基因多態(tài)性與內(nèi)耳疾病發(fā)生風(fēng)險關(guān)系 (例)

表3 各分類疾病MTHFR基因C677T位點的基因型分布 [例(%)]

表4 各分類疾病MTHFR基因C677T位點的等位基因分布 [例(%)]

表5 MTHFR C677T基因型與MD發(fā)生風(fēng)險關(guān)系 (例)

表6 MTHFR C677T等位基因與各組內(nèi)耳疾病發(fā)生風(fēng)險關(guān)系 [例(%)]

2.5 血清Hcy與內(nèi)耳疾病、MTHFR基因多態(tài)性的關(guān)系

疾病組血清Hcy平均濃度(12.78±9.44)μmol/L高于對照組的(11.18±4.64)μmol/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但疾病組血清Hcy異常38例(21.7%)高于對照組23例(13.1%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。疾病組各基因型中血清Hcy平均濃度均高于對照組，并在TT型中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表7。

2.6 內(nèi)耳疾病中血清Hcy、葉酸情況

疾病組中不同基因型間血清Hcy濃度及異常率存在差異(P均=0.000)；其中TT 型血清Hcy濃度(17.62±13.22)μmol/L高于CT 型(10.93±6.60)μmol/L、CC 型(10.43±6.35)μmol/L，CT 型高于CC 型，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；TT 型Hcy異常23例(46%)高于CT型13例(9.29%)、CC 型2例(9.52%)(P均<0.05)，CT型Hcy異常13例(9.29%)低于CC 型2例(9.52%)(P>0.05)；CC型發(fā)生Hcy異常的風(fēng)險分別是CT、TT型的0.762倍(OR=0.762，P>0.05)、0.207倍(OR=0.207，P<0.05)，CT型是TT型的0.272倍(OR=0.272，P=0.000)。葉酸平均濃度(16.67±10.17)nmol/L，異常率26.9%，各基因型間均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表8、9。

3 討論

目前內(nèi)耳疾病發(fā)生機制尚不明確，但其微循環(huán)損傷仍是重要的病理生理基礎(chǔ)。內(nèi)耳具有獨特的循環(huán)特點，血供主要來自迷路動脈，到達(dá)內(nèi)耳分為3支，分別供給前庭、半規(guī)管及耳蝸。這些動脈沿途分出眾多輻射狀小動脈，形成復(fù)雜的終末血管網(wǎng)，走形極度扭曲，無側(cè)枝循環(huán)，直徑小且血流速度緩慢，甚至僅允許單個紅細(xì)胞通過，極易導(dǎo)致循環(huán)損傷。當(dāng)各種致病因素?fù)p傷內(nèi)耳微循環(huán)時，可以影響內(nèi)耳功能細(xì)胞代謝及內(nèi)淋巴穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致內(nèi)耳聽覺平衡功能受損，內(nèi)耳疾病發(fā)生。

MTHFR基因多態(tài)性是近年來發(fā)現(xiàn)的常見遺傳性血管危險因素，與H型高血壓、腦梗死、冠心病、深靜脈血栓等血管性疾病密切相關(guān)。MTHFR基因位于1p36.3號染色體上，有11個外顯子，研究最多的多態(tài)性位點是第4號外顯子677位(C677T,rs1801133)，該位點的堿基胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)置換，從而使編碼的丙氨酸被纈氨酸替代，直接影響 MTHFR 酶功能，表現(xiàn)為不同程度的酶活性和耐熱性降低。MTHFR是葉酸和Hcy代謝的關(guān)鍵酶，其催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原成5-亞甲基四氫葉酸。后者參與血中Hcy甲基化生成甲硫氨酸，以維持血Hcy水平，為核酸、蛋白質(zhì)合成和甲基化提供甲基供體。酶活性降低可能引起低葉酸、高Hcy血癥、核酸合成和甲基化的異常，進(jìn)一步損傷血管與功能細(xì)胞。C突變T后產(chǎn)生3種基因型，分別為 CC型(野生型)、CT型(雜合突變型)、TT型(純合突變型)，其中 CT 型酶活性降低 65%，TT 型降低30%[1]。

表7 兩組血同型半胱氨酸水平及異常情況比較 [例(%)]

表8 內(nèi)耳疾病患者 MTHFR C677T位點各基因型血清同型半胱氨酸、血清葉酸情況

表9 各基因型間血清同型半胱氨酸兩兩比較

目前對MTHFRC677T多態(tài)性與內(nèi)耳疾病的關(guān)系研究存在較大爭議。Capaccio等認(rèn)為MTHFR基因多態(tài)性與SHL[2]、SSHL[3-4]存在相關(guān)性，可成為發(fā)病的危險因素，并參與相關(guān)的血管損傷。Uchida[5]、Gross[6]、Hamidi[7]等支持上述觀點，并認(rèn)為此基因突變與其他遺傳性因素(MTHFR A1298C、ApoE等)共同作用于內(nèi)耳，或是一個獨立于血葉酸和Hcy的危險因素[5]。也有學(xué)者持否定觀點，認(rèn)為MTHFR基因多態(tài)性與SSHL之間無關(guān)聯(lián)[6-11]。在其他內(nèi)耳疾病上，Uchida[12]、Manche[13]等發(fā)現(xiàn)MTHFRC677T純合TT型與老年性聽力損傷顯著相關(guān)，增加了老年聾的風(fēng)險。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)MTHFRC677T和A1298C多態(tài)性與MD風(fēng)險相關(guān)，并認(rèn)為C677T多態(tài)性是MD的保護因素，這可能與多態(tài)性導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)高水平5,10-亞甲基四氫葉酸鹽有關(guān)，可防止DNA合成過程中核苷酸的不平衡，確保DNA復(fù)制的高保真度。但只在葉酸含量較高時保護作用明顯[15]。

本研究中疾病組CC型頻率低于對照組，CT+CT型頻率高于對照組(P<0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義，CT型、TT型均略高于對照組，表明MTHFRC677T基因多態(tài)性與內(nèi)耳疾病具有一定相關(guān)性。發(fā)病風(fēng)險估計顯示MTHFR C677T基因突變可增加內(nèi)耳疾病發(fā)生風(fēng)險，其中CT型、TT型分別是CC型的1.408倍(P<0.05)、1.375倍(P>0.05)，而TT型是CT型的0.976倍(P>0.05)，相比較而言，CT型更易患內(nèi)耳疾病。在等位基因?qū)用?，T等位基因在不同人群中差異很大，在地中?；騺喼薜脑S多民族中超過30%[16]。在中國漢族人群中，則呈由南向北逐步升高的趨勢，在海南最低 (24%)，其次是湖北(40.3%)和江蘇(43.5%)，在山東觀察到最高頻率(63.1%)[17]。本研究中疾病組T基因頻率為58.3%，與我國其他地區(qū)相比，突變率處于高值，且明顯高于對照組(46.6%)，使內(nèi)耳疾病發(fā)生風(fēng)險增加0.264倍(P均<0.05)，進(jìn)一步證明MTHFRC677T多態(tài)性與內(nèi)耳疾病密切相關(guān)，T等位基因可成為內(nèi)耳疾病的危險因素。而一項Meta分析發(fā)現(xiàn)在歐洲人群中MTHFRC677T多態(tài)性與SSHL顯著相關(guān)，而亞洲人群中無相關(guān)性[18]。張樂[11]也發(fā)現(xiàn)山東漢族人SSHL組與對照組在MTHFR基因型與等位基因分布無顯著差異，這可能與地域、種族差異等有關(guān)。MTHFR基因多態(tài)性也存在性別、年齡等差異，Pollak等[19]發(fā)現(xiàn)在男性患者中，MTHFRC677T與聽力損失程度呈劑量依賴性相關(guān)，且在對Hcy的影響中，男性比女性更明顯。而在本研究中尚未進(jìn)行性別、年齡分組研究，有待于進(jìn)一步深入。

MTHFR基因多態(tài)性可獨立或協(xié)同低葉酸、高Hcy等血管危險因素作用于內(nèi)耳。Capaccio 等[4]證明了MTHFR突變與SHL之間顯著相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)兩組的Hcy、葉酸水平有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，進(jìn)一步支持MTHFR突變與SHL微血管損傷的關(guān)系。Fusconi 等[20-21]發(fā)現(xiàn)SSHL高Hcy血癥與MTHFRC677T純合突變有關(guān)，認(rèn)為SSHL是由這兩個變量共同作用的結(jié)果。在本研究中，兩組血清Hcy異常率存在顯著差異(P<0.05)，各基因型間血清Hcy濃度均高于對照組，并在TT型中具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明血清Hcy與內(nèi)耳疾病、MTHFR多態(tài)性相關(guān)。疾病組中各基因型間血清Hcy水平和異常率均具有顯著差異，且CC型發(fā)生Hcy異常風(fēng)險分別是CT、TT型的0.762倍(P>0.05)、0.207倍(P<0.05)，CT型是TT型的0.272倍(P=0.000)，表明MTHFR基因多態(tài)性與血清Hcy關(guān)系密切，可增加血清Hcy升高風(fēng)險，尤其基因型為TT型時，共同參與內(nèi)耳疾病的發(fā)病機制，這與Fusconi 研究結(jié)果相似。未能發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性與血清葉酸間的相關(guān)性(P>0.05)，可能與生活環(huán)境、飲食等因素有關(guān)。

一種內(nèi)耳疾病中可能涉及多種病因及發(fā)病機制，本研究中根據(jù)病因及臨床診斷將內(nèi)耳疾病分類進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)MD組中基因型CC頻率低于對照組，突變型(CT+TT)頻率高于對照組(P<0.05)，CT+TT型發(fā)生MD的風(fēng)險是CC型的3.615倍(P<0.05)，其中TT、CT分別是CC型的4.476倍(P<0.05)，3.138倍(P>0.05)，同時等位基因C、T分布存在差異(P<0.05)，T突變使發(fā)生MD的風(fēng)險增加1.11倍(P<0.05)，這些表明MTHFRC677T基因突變與MD關(guān)系密切，可明顯增加MD發(fā)生風(fēng)險，T基因可成為發(fā)病的危險因素，且TT型更易患梅尼埃病。這與Yang 等[14]研究結(jié)果相反。SSHL組和VD組各基因型頻率與對照組比較無明顯差異(P>0.05)，但等位基因T頻率明顯高于對照組，C頻率低于對照組(P均<0.05)，T突變增加了兩者的發(fā)生風(fēng)險，說明MTHFR基因多態(tài)性與兩者可能存在相關(guān)性，需進(jìn)一步研究證明，臨床上應(yīng)予以關(guān)注。SHL組與對照組比較，等位基因分布無差別(P>0.05)，而基因型比較，TT型頻率低于對照組(P<0.05)，可能是樣本不足導(dǎo)致，此組中樣本量小，TT型僅有1例。

MTHFRC677T基因多態(tài)性與內(nèi)耳疾病相關(guān)，可作為危險因素或協(xié)同Hcy參與內(nèi)耳病機制，對單一內(nèi)耳疾病而言，MTHFR基因突變與MD關(guān)系密切，T基因突變也可能增加SSHL、VD的發(fā)生風(fēng)險，故臨床上應(yīng)對此類人群予以關(guān)注，加強預(yù)防。但本研究存在一定的局限，有待于深入癥狀、年齡、性別等分類研究，對MTHFR基因多態(tài)性與其他獲得性或遺傳性血管因素，如MTRR A66G、凝血酶原G20210A、各項凝血指標(biāo)等關(guān)系進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討內(nèi)耳疾病的發(fā)病機制。