小米粥油制備及抑菌和吸附內(nèi)毒素作用的研究

陳樹俊 郭 琪 楊 寶

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1，太原 030006) (太原市食品藥品檢驗(yàn)所2，太原 030006)

大米或小米熬粥時，表面上會凝聚一層黏稠米湯，營養(yǎng)學(xué)稱其為“米油”[1]，小米熬制的也叫“小米粥油”。小米熬粥后，米湯中占有大部分營養(yǎng)，尤以粥油中最為豐富[2]。細(xì)菌是引起小兒感染性腹瀉的因素之一，如致病克雷伯菌、沙門菌、志賀菌等[1]；還有內(nèi)毒素性腹瀉，內(nèi)毒素主要作用于腸道，影響腸細(xì)胞代謝，降低腸細(xì)胞氧利用率，導(dǎo)致屏障細(xì)胞壞死脫落，腸豁膜通透性增加，引發(fā)內(nèi)毒素易位、血癥，繼而反饋性使細(xì)菌進(jìn)入形成腸源性感染[3，4]。多項(xiàng)研究表明，米油在治療腹瀉方面有很好療效[5-7]，鄭向華等[8]研究米湯的保健功能，發(fā)現(xiàn)米湯加鹽可以減少水和電解質(zhì)大量流失，從而治療急性腹瀉引起的脫水癥狀。其含有較多的ω-3多不飽和脂肪酸可以降低細(xì)胞炎癥及免疫反應(yīng)[9]，小米油脂中80%以上為不飽和脂肪酸[10]。因此，通常稱米油為“天然抗生素”[11]。如今，食療性緩解小兒腹瀉的報道較少，而小米粥油良好的口感相比傳統(tǒng)藥物更利于患兒接受，制備輔助治療小兒腹瀉食品具有重要意義。

目前對米油的報道較少，楊軍紅等[1]利用大米油進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)和吸附內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)，有顯著效果，并且發(fā)現(xiàn)米油對實(shí)驗(yàn)性大鼠腸屏障損傷有修復(fù)作用[11]。有研究報道，對危重癥、急性腹瀉、炎癥性腸病、外科術(shù)后啟動腸道功能的患者早期給予大米米油對癥支持，收到了良好效果[8]。山西是我國優(yōu)質(zhì)小米產(chǎn)地，小米量大質(zhì)優(yōu)[12]，小米粥油含有高濃度淀粉、豐富的水溶性蛋白質(zhì)、大量游離氨基酸，小分子肽，維生素，纖維素[1]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證小米粥油的功能特性，本研究對小米粥油進(jìn)行制備并以抑菌圈大小作為評價指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化，采用真空冷凍干燥技術(shù)制備小米粥油粉，利用小米粥油進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并探索其抑菌機(jī)理；利用小米粥油粉進(jìn)行吸附細(xì)菌內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)，為開發(fā)利用小米粥油提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

東方亮一級小米；金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏標(biāo)準(zhǔn)菌株、大腸埃希標(biāo)準(zhǔn)菌株、痢疾志賀標(biāo)準(zhǔn)菌株、肺炎克雷伯標(biāo)準(zhǔn)菌株(太原市食品藥品檢驗(yàn)所提供)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ACS-15型電子臺秤；PYX-DHS-50X65-S-Ⅱ隔熱式電熱恒溫培養(yǎng)箱；JXZDYR-8粉碎機(jī)；TFDS25真空冷凍干燥成套設(shè)備；UV-5100型紫外可見分光光度計(jì)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小米粥油制備

小米→清洗→浸泡→熬煮→趁熱過濾→靜止放冷→成品

選取新鮮小米，在粉碎機(jī)中研磨2次，每次10 s，加水浸泡，以一定料液比熬煮，熬煮結(jié)束后用80目篩過濾并冷卻到常溫，即為小米粥油。

2.1.1 制備小米粥油工藝優(yōu)化

通過肺炎克雷伯菌抑菌圈大小，考察浸泡時間(0、30、60、80、100 min)，料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)，煮粥時間(20、25、30、35、38 min)三因素對小米粥油抑菌性的影響，設(shè)計(jì)單因素、正交實(shí)驗(yàn)。

2.2 小米粥油粉制備

最佳工藝條件制作出小米粥油，靜止放冷，在-47 ℃冰箱中冷凍12 h，置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，結(jié)束后將成品快速粉碎，過80目篩，密封備用。

2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

2.3.1 菌株活化和制備菌懸液

將5種供試菌種接種至平板，36 ℃培養(yǎng)16 h，培養(yǎng)出菌落后，配成濃度為104～105CFU/mL的菌懸液。

2.3.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

將1 μL待測菌懸液均勻涂布于平板中，取2個牛津杯對稱放置其中，放入料液比為1∶20的小米粥油。36 ℃培養(yǎng)16 h后，測量抑菌圈直徑大小，觀察小米粥油對各菌種的抑制效果。

2.3.3 最低抑菌濃度(MIC)的測定

小米粥油制備料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35的樣品。

取5 mL樣品于10 mL培養(yǎng)基中，搖勻后倒平板，取100 μL菌懸液，均勻涂布于平板，36 ℃培養(yǎng)16 h，以培養(yǎng)皿中第1個出現(xiàn)單菌落平板的抑菌劑濃度為MIC[13]，不加小米粥油的平板為空白對照。

2.3.4 小米粥油對菌體生長曲線的影響

參照文獻(xiàn)[14]。取小米粥油MIC的樣液，按照體積比菌懸液：樣液為1∶50加入液體培養(yǎng)基中。每種菌的處理時間為24 h，分別在600 nm處每隔2 h測定OD值。以小米粥油MIC為對照組并記錄其吸光值。

2.3.5 核酸含量的測定

參照文獻(xiàn)[15]，取1 000 μL對數(shù)生長期菌液，離心后收集，用生理鹽水沖洗3次，再加入1 000μL生理鹽水，加入料液比為1:20的小米粥油100 μL，在培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)3 h后，離心，測定上清液在260 nm波長處吸光度值，對照組不加小米粥油，只加菌液與生理鹽水作為空白對照。

2.3.6 電導(dǎo)率的測定

將供試菌種接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心，收集菌體，生理鹽水清洗3次，離心，置于生理鹽水中，加入1 MIC小米粥油，對照組用生理鹽水進(jìn)行校正，放于37 ℃搖床中培養(yǎng)6 h，每隔1 h取出測電導(dǎo)率[16]。

2.4 小米粥油粉吸附內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)

采用鱟試劑顯色基質(zhì)法進(jìn)行小米粥油粉的內(nèi)毒素測試[17，18]。制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，陰性對照為檢查用水。

將小米粥油粉去除內(nèi)毒素[1]。加1.0 mL檢查用水，使小米粥油粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%。劇烈振蕩6 min，離心，取上清液，測吸光度值。在1 mL檢查用水中溶解內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(5 EU/支)，用旋渦混合器將溶液混合5 min。用檢查用水將其稀釋為0.75 EU/mL。試管中加入1.2 mL內(nèi)毒素溶液并測定液體吸光值，即可得到吸附前內(nèi)毒素含量。再加入小米粥油粉使其質(zhì)數(shù)分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，劇烈振蕩6 min，離心，取上清液，測定吸光值，并減去陰性對照，即可得吸附后的內(nèi)毒素含量。

內(nèi)毒素吸附率的計(jì)算公式：

吸附率=

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果與討論

3.1 制備小米粥油工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1可以看出，隨著時間的增加，浸泡時間與熬煮時間對抑菌圈的直徑先增大后減小，因?yàn)樾∶捉?jīng)過水浸泡之后，小米表皮變軟，小米中的淀粉分子被釋放，充分水化的淀粉顆?？梢蕴嵘w凝膠網(wǎng)絡(luò)體系的膠著性和黏度[19]，且營養(yǎng)成分被大量溶出；在熬煮25 min之前，由于濕熱作用，淀粉分子劇烈膨脹、作用力減小、結(jié)構(gòu)逐漸破壞[20-21]，使得小米中營養(yǎng)物質(zhì)快速被釋放出來，所以小米粥油的抑制作用加強(qiáng)。浸泡時間超過60 min、熬煮時間超過25 min后抑菌圈減小，這可能是因?yàn)檫^長時間的浸泡會是的小米中的固形物大量受到損害[22]，使得營養(yǎng)物質(zhì)受到損失，抑菌性下降；熬煮時間超過25 min之后，由于加熱時間越來越長，營養(yǎng)物質(zhì)被受到破壞，抑菌作用也逐漸減弱。隨著料液比的增加，抑菌圈大小呈明顯下降趨勢，這是因?yàn)殡S著料液比的增加，小米粥油濃度下降，抑菌作用也隨著下降，濃度過大時，小米粥油濃度過于稠密幾乎難以過濾，水分大部分蒸發(fā)，考慮到實(shí)際工藝條件，選擇料液比1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)，浸泡時間30、60、80 min，熬煮時間20、25、30 min進(jìn)行正交試驗(yàn)研究。

圖1 各因素對抑菌圈的影響

3.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

為確定最佳小米粥油制備工藝條件，選擇浸泡時間、料液比、熬煮時間3個因素，以抑菌圈直徑大小為評價指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

表1 制備小米粥油實(shí)驗(yàn)因素與水平

由表2可知，影響抑菌性因素強(qiáng)弱順序：料液比>熬煮時間>浸泡時間，小米粥油制備最佳工藝條件為：浸泡時間30 min，料液比1∶20，熬煮時間25 min，結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)略有差異。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到的抑菌圈直徑大小為(10.1±0.11) mm

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 小米粥油抑菌作用及最低抑菌濃度的測定。

根據(jù)3.1制備出小米粥油測定其抑菌作用，金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌、肺炎克雷伯菌出現(xiàn)明顯抑菌圈，說明小米粥油對金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌和肺炎克雷伯菌有抑制作用，其他供試菌種抑菌作用不明顯。表3小米粥油MIC測定結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，對照組菌落總數(shù)顯著多于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，3種供試菌種均在料液比為1∶20制備的小米粥油開始出現(xiàn)菌落，可知小米粥油對這3種供試菌種最小抑制濃度(MIC)即料液比均為1∶20。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，設(shè)置的最低樣品濃度(料液比1∶35)與對照組相比較，金黃色葡萄球菌降低了大約60%，痢疾志賀菌降低了大約40%，肺炎克雷伯菌降低了大約58%；所以小米粥油對菌種的抑制順序?yàn)椋航瘘S色葡萄球菌>肺炎克雷伯菌>疾痢志賀菌。

表3 小米粥油最低抑菌濃度結(jié)果

3.2.2 對菌體生長曲線的影響

從圖2～圖4可看出，對照組供試菌種生長曲線均呈現(xiàn)典型的S型，細(xì)菌生長穩(wěn)定，均有對數(shù)生長期和穩(wěn)定生長期。而加入小米粥油后，3種供試菌生長速率顯著減緩，延滯期明顯增加，對數(shù)增長期延后。最大生物量與對照組相比也明顯降低，基本在17 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，生長曲線趨于平緩，由此可見小米粥油對供試菌種的生長繁殖有抑制作用。

圖2 金黃色葡萄球菌生長曲線

圖3 痢疾志賀氏菌生長曲線

圖4 肺炎克雷伯菌生長曲線

3.2.3 核酸含量的測定

小米粥油對供試菌種核酸溶出的影響如圖5所示，加入小米粥油的供試菌種吸光度值顯著增加(P<0.05)，表示菌液中核酸釋放量增大，小米粥油破壞了細(xì)胞膜的完整性，核酸等大分子物質(zhì)外泄，導(dǎo)致細(xì)胞代謝受損，細(xì)胞失去保護(hù)，最終導(dǎo)致菌體死亡[23]。

圖5 對供試菌種核酸溶出的影響

3.2.4 電導(dǎo)率的測定

由圖6可知，對照組電導(dǎo)率增長平緩，有輕微的增長趨勢，是由于菌體細(xì)胞的自然衰亡與溶解[23]引起的；由于小米粥油本身含有離子導(dǎo)致初始電導(dǎo)率大于對照組，加入小米粥油供試菌種菌懸液的電導(dǎo)率開始增大，顯著高于對照(P<0.01)，電導(dǎo)率反映了小米粥油對菌體細(xì)胞膜通透性的影響。K、Na、H等可以通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，這些離子在維持細(xì)胞膜電位以及維持菌體細(xì)胞正常代謝等方面起重要作用，從而維持細(xì)胞的正常功能[24]。而小米粥油能使菌體細(xì)胞破裂，使菌體細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外泄，菌體代謝無法進(jìn)行，最終導(dǎo)致菌體死亡；這與菌懸液核酸含量增加結(jié)果一致。

圖6 對供試菌種電導(dǎo)率的測試

3.3 內(nèi)毒素吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=2.416 8X+0.030 6，R2=0.996 9。

根據(jù)表4可得出，隨著小米粥油粉濃度的增加，內(nèi)毒素的吸附率逐漸增加，吸附性效果顯著，內(nèi)毒素為細(xì)菌壁的最外側(cè)成分，細(xì)菌繁殖擴(kuò)散的過程中，細(xì)菌壁釋放內(nèi)毒素而進(jìn)入人體腸道中[25]。內(nèi)毒素的上升能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增加腸上皮細(xì)胞等的損傷，促進(jìn)器官功能的衰竭。

表4 小米粥油粉內(nèi)毒素試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

藥物治療小兒腹瀉癥狀是目前主要方法，對人體具有潛在危害性且患兒接受藥物治療難度系數(shù)大，所以采用食品進(jìn)行治療與預(yù)防腹瀉受到重視。小米作為一種常見的谷物，其對治療腹瀉具有輔助作用。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)方法對小米粥油制備工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到在浸泡時間30 min，料液比1∶20(g/mL)，熬煮時間25 min條件下，小米粥油的抑菌圈最大。在此條件下制備的小米粥油進(jìn)行真空冷凍干燥制得小米粥油粉。結(jié)果表明小米粥油對導(dǎo)致小兒腹瀉的病原菌有很好的抑制作用，小米粥油會引起細(xì)菌細(xì)胞壁破碎，延長細(xì)菌延滯期，降低對數(shù)期，阻礙了細(xì)菌正常生長繁殖。而小米粥油制成的小米粥油粉能吸附內(nèi)毒素，對腸細(xì)胞的吸收和分泌功能起到了維持作用，阻止病原微生物的攻擊[26]。給予細(xì)菌性腹瀉病兒，小米粥油治療能有效抑制病原菌生長、吸附內(nèi)毒素，效果顯著。