雙液相萃取棉仁粉工藝中甲醇相棉子糖s的精制

顧 恒 朱慶莉 云 志 蘭宏兵

(金陵科技學院1，南京 211169)(南京工業(yè)大學2，南京 211816)(鄭州輕工業(yè)大學3，鄭州 450001)

棉子糖(Raffinose)是由半乳糖、果糖和葡萄糖結(jié)合而成的一種三糖，也被稱為蜜三糖、蜜里三糖。它是一種植物體內(nèi)普通存在的功能性低聚糖，具有很好的雙歧桿菌增殖作用和良好的整腸功效[1]，還能促進人體對鈣的吸收，阻止癌細胞生長，延長器官等的保存時間，故廣泛地應用于食品、醫(yī)療、化妝品等行業(yè)[2-4]。

棉花是我國主要的經(jīng)濟作物之一，棉籽是棉花主要副產(chǎn)品，因此從棉籽中提取棉子糖，不僅獲得高價值產(chǎn)品，還提高資源的綜合利用率[5]。近幾十年來，眾多科研者圍繞如何從棉籽中提取棉子糖開展許多工作，如采用酶解提取結(jié)合離子交換樹脂法[6]，光波提取、陶瓷膜過濾，結(jié)合離子吸附法[7]提純棉子糖。崔勝成等[8]采用乙醇提取棉子糖，濃縮提取液，淡鹽水洗滌，結(jié)晶過濾得到棉子糖。趙永強等[9]公開一種經(jīng)乙醇浸泡，過濾，加入晶種，再加入3～5倍乙醇，羥基型陰離子除雜，醋酸乙醇洗脫，濃縮等步驟從棉籽粕中獲得高純度棉子糖的方法。曹通等[10]公開一種以脫脂棉粕為原料，通過低濃度弱堿性有機溶劑萃取棉酚，從脫酚液中提取棉子糖，但未公開具體的提取過程與產(chǎn)率。

本課題組采用甲醇和石油醚按一定比例(3∶1)混合組成的雙液相溶劑(TPS)浸取處理棉仁粉[11-13]。通過該操作過程，棉仁粉中棉籽油、甾醇、維生素E等脂溶性物質(zhì)進入到上層石油醚相；而棉子糖、棉酚、色素等則進入下層甲醇相。該過程通過一步萃取，實現(xiàn)了不同極性物質(zhì)的分離。同時兩相溶劑相互洗脫，使得各自萃取得到的物質(zhì)相對較純，提高萃取效率。經(jīng)分離得到的下層溶液甲醇相中富含棉子糖，但同時也含有棉酚、色素、蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)，這些雜質(zhì)嚴重影響棉子糖的色澤及純度，因此欲得到高純度的棉子糖，還需要進一步精制[14]。課題組雖采取了一系列提高棉子糖純度的措施[15，16]，但未能兼顧純度與產(chǎn)率，也缺乏整體連貫性，未見從原料(雙液相溶劑萃取棉仁粉工藝中甲醇相)直接到達產(chǎn)品(高純度棉子糖)的整體操作路線。

本實驗以雙液相溶液萃取棉仁粉中的甲醇相為原料，依次通過脫色、脫蛋白及重結(jié)晶操作，擬獲得高純度、高產(chǎn)率的棉子糖產(chǎn)品，欲拓展雙液相溶劑(TPS)處理棉籽的工藝路線，進一步提升這一工藝的實用價值。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

棉仁粉，江蘇連云港棉籽，經(jīng)電動粉碎后去棉粕得棉仁粉；甲醇相溶液，自制[7]，雙液相溶劑萃取棉仁粉后，固液分離，溶液靜置分層，分離后下層溶液即為甲醇相；硅藻土、粉末活性炭、棉子糖標品；無水乙醇、丙酮、乙醇、三氯乙酸均為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜，外壓式中空纖維超濾器(表1)，RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

表1 膜組件技術指標及規(guī)格

1.3 預處理

甲醇相中含有棉酚和棉子糖。棉酚不溶于水，在低濃度的甲醇溶液中也幾乎不溶，而棉子糖在水中溶解度大，因此利用棉酚與棉子糖在低濃度甲醇溶液中溶解度不同將棉酚除去。具體操作步驟為：向甲醇相中加入甲醇相體積30%的蒸餾水，再減壓蒸餾蒸出甲醇，大部分的棉酚在水相中析出，抽濾去除后，收集得到含糖水相，其組成成分見表2。

表2 含糖水相主要成分

1.4 棉子糖純化工藝

1.4.1 硅藻土與活性炭混合物處理棉子糖粗品

將含糖水相溶解于無水乙醇中，含糖水相與無水乙醇體積比1∶10，充分振蕩混合液使其均勻。將溶液置于離心管中，在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min。將上層清液去除，下層移至燒杯中，放入真空干燥箱中干燥除去溶劑。取干燥后的2 g粗品溶解于25 mL的蒸餾水中，加入硅藻土與活性炭的混合物(混合物中兩者的比例為1∶1)，超聲波輔助機械攪拌15 min，真空抽濾，并用100 mL的蒸餾水分次洗滌，收集合并濾液，50 ℃真空干燥。

1.4.2 棉子糖溶液超濾除蛋白質(zhì)

脫色處理后的棉子糖粗品中仍含有水溶性蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。為了避免蛋白溶液的起泡影響后續(xù)的濃縮過程及得到高純度產(chǎn)品。實驗采用膜超濾分離技術處理棉子糖粗品中蛋白。超濾實驗裝置見圖1所示。

取10 g棉子糖粗品配制成1.5 L棉子糖溶液，將其放入料液貯槽1，啟動料液泵2，由閥門3和6控制超濾膜內(nèi)料液流量，壓力表4和5顯示膜的進口壓力和出口壓力。料液由泵入超濾系統(tǒng)后，采用全循環(huán)模式，即滲透液循環(huán)回至原料液貯槽，透過液收集于滲透壓儲存槽。

注：1 料液貯槽；2 料液泵；3 進口調(diào)節(jié)閥；4 進口壓力表；5 出口壓力表；6 出口調(diào)節(jié)閥；7 濃縮液；8 原料液；9 滲透液；10 滲透液貯槽；11 控溫水浴。圖1 超濾實驗裝置圖

式(1)計算超濾壓力，式(2)計算超濾膜通量，膜通量通常用單位時間內(nèi)通過單位膜面積的透過液的體積來表示[17]。質(zhì)量分數(shù)30%的三氯乙酸(TCA)溶液用于檢測超濾透過液是否含有蛋白物質(zhì)[18]。

(1)

式中：P為膜操作壓力/MPa；Pin為超濾膜進口處的壓力/MPa；Pout為超濾膜出口處的壓力/MPa。

(2)

式中：J為超濾通量/L·m-2·h-1；V為取樣體積/L；t為取樣時間/h；A為膜面積/m2。

1.4.3 棉子糖的重結(jié)晶

經(jīng)脫色、超濾處理后的棉子糖溶液真空干燥，所得棉子糖樣品仍還有雜質(zhì)，需進一步精制。具體步驟如下：取一定量棉子糖粗品，在超聲加熱下，溶解于重結(jié)晶溶劑(丙酮-乙醇-水，體積比2∶1∶0.5)中，直至粗品溶解。趁熱過濾，濾液室溫下超聲輔助冷卻結(jié)晶。濾液再置冰箱中冷凍結(jié)晶，一段時間后，振蕩抽濾得到晶體，晶體分別經(jīng)石油醚、乙醇洗滌兩次。晶體真空干燥，稱重，計算其收率及純度。

1.5 分析方法

1.5.1 色值分析

色值表示糖品顏色深淺的數(shù)值，是評價糖品質(zhì)量的重要指標。實驗用國際糖分析統(tǒng)一方法委員會(ICUMSA)規(guī)定的糖色值分析方法進行測定[19]。

(3)

式中：IU560為560 nm處國際糖溶液色值；A560為560 nm處測得的樣液吸光度；

b為比色皿厚度，1 cm；c為樣液干物質(zhì)質(zhì)量濃度/mg/mL。

1.5.2 棉子糖的檢測，及脫色率及收率計算

采用高效液相色譜法(HPLC)檢測棉子糖的含量，具體檢測方法參照文獻[14]。

圍繞“實踐”概念所產(chǎn)生的爭論如此之多，并不是中國獨有的現(xiàn)象。再回到布爾迪厄所在的法國，對他的批評同樣猛烈而曠日持久。

(4)

(5)

式中：V1、V2分別為脫色前后溶液的體積/mL；C1、C2分別為脫色前后溶液中棉子糖的質(zhì)量濃度/mg/mL。

(6)

2 結(jié)果與討論

2.1 硅藻土與活性炭混合物處理棉子糖粗品

2.1.1 脫色溫度的確定

溫度升高有利于降低溶液黏度，增強分子的擴散運動。圖2a映了隨著溫度的升高，脫色效果幾乎呈線性提高，但與此同時棉子糖收率逐漸降低，當溫度高于50 ℃后，可能發(fā)現(xiàn)一些副反應，收率急劇下降。因此選擇50 ℃作為適宜的脫色溫度。

2.1.2 脫色時間的確定

混合物與棉子糖溶液有一定的接觸時間是提高脫色率的必要條件。從圖2b可以看出，隨著脫色時間的延長，脫色率不斷提高，當脫色時間延長至2.5 h后，脫色率沒有明顯增加趨勢；但隨著時間的延長，收率不斷下降，而且下降的速率越來越明顯，因此從經(jīng)濟，脫色率及收率等方面考慮，確定脫色時間為2 h。

2.1.3 硅藻土與活性炭混合物用量的確定

硅藻土和活性炭作為脫色劑最佳的脫色條件：混合物用量為3%，在50 ℃下脫色2 h。在此條件下，棉子糖的收率為85.6%，脫色率為89.1%。

2.2 棉子糖溶液超濾脫蛋白

2.2.1 超濾時間對膜通量的影響

取棉子糖溶液，測定pH為6，總蛋白質(zhì)濃度為3.2%，在40 ℃下進行實驗，膜通量隨時間的變化如圖3所示。隨著超濾時間的延長，膜通量逐漸減小。開始膜通量下降得較快，而后其下降速率隨時間延長而變得緩慢，超濾進行至20～30 min后，膜通量趨于穩(wěn)定。

2.2.2 操作壓力對膜通量的影響

壓差是超濾過程的推動力，分別取蒸餾水和脫色后的棉子糖溶液，在40 ℃下穩(wěn)定運行20 min后，調(diào)節(jié)進出口閥，在不同操作壓力下的測定膜通量。從圖3可看出，膜通量隨壓力升高而增大，而后逐漸趨于穩(wěn)定，0.016 MPa后膜通量幾乎不再增大。這可能是因為隨著壓差的增大，大分子物質(zhì)會不斷被溶劑帶至膜表面積累，形成由膜表面到主體溶液之間的濃度差，形成濃差極化現(xiàn)象。隨著濃差極化程度的加劇，膜表面的溶質(zhì)質(zhì)量分數(shù)急劇增加。當膜表面的質(zhì)量分數(shù)達到飽和時，就在膜面形成凝膠層，產(chǎn)生了凝膠層阻力，此時膜通量的變化不再依賴于壓力。因此本實驗選擇操作壓力0.016 MPa。

圖2 各因素對棉子糖脫色率與收率的影響

圖3 各因素對膜通量的影響

2.2.3 料液溫度對膜通量的影響

取蒸餾水和脫色處理后的棉子糖溶液，在膜允許的溫度范圍內(nèi)(5～45 ℃)調(diào)節(jié)料液的溫度，在操作壓力0.016 MPa的條件下運行20 min，測定其膜通量。由圖3可知，在超濾過程允許的工作溫度下，隨著料液溫度的升高，膜通量相應增加，溫度和膜通量速度變化基本呈線性關系。這是由于溫度升高，加快膜中聚合物鏈節(jié)的微觀布朗運動，使單位時間單位體積形成小孔的可能性增加，從而使透過速度增大，其次分子熱運動速度加快，各種分子向膜表面及其由膜表面向溶液主體擴散速度加快，即增大了傳質(zhì)系數(shù)，從而提高了膜通量。而且糖溶液隨溫度升高黏度下降，溶劑更容易透過膜；蛋白質(zhì)溶解度隨糖溶液溫度升高而增加，可降低膜表面對蛋白質(zhì)的吸附。為了提高效率，應選擇較高的物料溫度，但操作溫度的選擇還受到膜材料耐熱性和物料熱敏性的限制，為了延長膜的使用壽命，本實驗選擇操作溫度為40 ℃。

2.2.4 pH對膜通量的影響

從圖3可以看出，當料液溫度(40 ℃)、操作壓力(0.016 MPa)均保持不變時，溶液的pH值對膜通量有較明顯的影響，與文獻[20]報道相似。在堿性條件下，膜通量較大，隨著溶液pH值減小膜通量逐漸減小，在pH值為5左右時，膜通量達到最低值，pH值再減小時膜通量又趨于增大。這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是糖溶液中所含蛋白質(zhì)中的氨基酸同時具有氨基和羧基，可解離為負電荷和正電荷基團，是一種兩性化合物，當pH為某一特殊值時所帶凈電荷為零，即蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)在等電點處其溶解度最小。由圖3可以看出，棉子糖溶液中蛋白質(zhì)等電點在pH值為5左右，此時蛋白質(zhì)最易析出和聚集在膜的表面，形成最緊密吸附層，對流體的阻力最大，因而膜通量最低。當溶液pH值偏離等電點時，溶液中蛋白將帶有電荷，溶質(zhì)分子間的靜電排斥力變大，溶液黏度變小，膜通量增大。因此膜超濾應該在偏離等電點時進行，可將糖溶液pH調(diào)到8進行實驗。

在溫度40 ℃，壓力0.016 MPa，糖溶液pH=8下進行20 min膜超濾實驗。收集滲透液，用質(zhì)量分數(shù)30%的三氯乙酸進行檢測，超濾后溶液中未檢測出蛋白質(zhì)。

2.3 棉子糖的重結(jié)晶

2.3.1 重結(jié)晶料液比的確定

由圖4可知，在棉子糖粗品質(zhì)量一定的情況下，棉子糖的收率與純度是相互制約的關系。在料液比較小時，析出的晶體中含有大量的棉子糖及雜質(zhì)，產(chǎn)品的收率大，但純度較低；隨著液固比增加，溶解于溶劑中的棉子糖與雜質(zhì)的質(zhì)量上升，使得晶體中棉子糖的含量相對增加，因此產(chǎn)品的純度較高，但其收率小。綜上所述，兼顧產(chǎn)品的收率與純度，選擇較為合適的料液比1∶14。

圖4 重結(jié)晶因素對棉子糖收率和純度的影響(a)料液比(b)結(jié)晶時間

2.3.2 重結(jié)晶時間的確定

由圖4可以看出，隨著重結(jié)晶時間的延長，晶體的質(zhì)量呈先增加后平穩(wěn)的趨勢。當時間延長至24 h后，晶體的析出量已無明顯增加，同時太長的結(jié)晶時間會引起晶體結(jié)塊的現(xiàn)象。因此，從經(jīng)濟及晶體晶型的角度考慮，確定結(jié)晶時間為24 h。

由超聲輔助雙液相溶劑萃取后所得的棉子糖溶液經(jīng)硅藻土與活性炭混合物脫色、再經(jīng)超濾脫蛋白、溶劑重結(jié)晶后，最終得到純度為94.5%，回收率為63.1%的棉子糖(以原料甲醇相為基點計算)。

3 結(jié)論

以雙液相溶劑(甲醇和石油醚)萃取棉籽工藝中甲醇相為原料，在預處理的基礎上，采用3%硅藻土與活性炭(混合物與糖溶液質(zhì)量之比)在50℃下脫色2 h，棉子糖的收率為85.6%，脫色率為89.1%；在溫度40 ℃，壓力0.016 MPa，糖溶液pH=8下超濾膜脫蛋白20 min，可將棉子糖提取液中大分子蛋白有效地除去；在糖溶液與重結(jié)晶溶劑(丙酮-乙醇-水，體積比2∶1∶0.5)料液比為1∶14的條件下，重結(jié)晶棉子糖粗品24 h，最終得到的棉子糖產(chǎn)品純度為94.5%，回收率為63.1%。

該工藝與傳統(tǒng)的棉子糖提取工藝相比，有一些明顯優(yōu)點：避免了高溫處理棉籽，保護了生物質(zhì)的活性；前期萃取過程減少萃取步驟，提高萃取效率，節(jié)約能源；此工藝首次較系統(tǒng)、完整地研究了從原料(甲醇相)到產(chǎn)品(棉子糖)的提純過程；該工藝兼顧棉子糖的回收率與純度，且簡單易行。