澤及流浸膏納米材料干預結核性創(chuàng)面的臨床研究
——附31例臨床資料

朱 珠 施 怡 鈕曉紅 高金輝 傅良杰 薛倩一

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210023；2.南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇南京210014）

結核病在全球范圍內仍威脅著人類的健康。2019年，我國統(tǒng)計報告了結核病新發(fā)患者86.6萬余例[1]。研究發(fā)現(xiàn)，肺外結核占所有結核病總數(shù)的20%～50%[2]，肺外結核患者中約有50%可發(fā)生結核性創(chuàng)面[3]，其中淋巴結核創(chuàng)面占比最 高[4]86。巨噬細胞作為機體免疫的重要防線，吞噬入侵的結核分枝桿菌（MTB）[5]，引發(fā)細胞凋亡。澤及流浸膏為鈕曉紅教授經驗方，臨床治療結核性創(chuàng)面安全有效[6-7]。但澤及流浸膏為液態(tài)制劑，灌注竇道后，藥液紗條填塞過緊不利于引流，過松則藥液易從竇道流出。前期研究顯示，納米材料載入水溶性藥物時具有良好的降解緩釋作用，可延長藥物在創(chuàng)面的停留時間，促進瘡面腐肉脫落，納米纖維還能促進細胞遷移和增殖[8]。與此同時，正常的皮膚組織細胞必須貼附于細胞外基質（ECM）才能生長與分化，納米材料具有與皮膚基質相似的生物學特性和化學成分，有利于維持細胞的壽命，且實驗證明在較長的培養(yǎng)期內，納米材料對部分成纖維細胞增殖有較高的促進作用[9]。為此，我們 與南京理工大學合作研制了澤及流浸膏納米材料，臨床觀察其能夠促進結核性創(chuàng)面的愈合。本研究觀察經澤及流浸膏納米材料干預后結核性創(chuàng)面巨噬細胞超微結構的變化，探究創(chuàng)面愈合動態(tài)過程，并與凡士林紗布做療效對比觀察，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2019年3月至9月南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院瘰疬科病房確診為淋巴結核并出現(xiàn)結核性創(chuàng)面的患者61例，采用隨機數(shù)字表法分為治療組31例和對照組30例。治療組男14例，女17例；平均年齡（37.04±12.38）歲；病程≤6個月18例，6～12個月7例，＞12個月6例；局部病灶≤3 cm者13例，＞3 cm者18例；切開引流15例，已破潰16例。對照組男14例，女16例；平均年齡（34.67±11.04）歲；病程≤6個月19例，6～12個月8例，＞12個月3例；局部病灶≤3 cm者14例，＞3 cm者16例；切開引流13例，已破潰17例。2組患者性別、年齡、病程等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究通過南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院倫理委員會審查，批件號：201807001。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 淋巴結核伴結核性創(chuàng)面西醫(yī)診斷標準參考《臨床診療指南：外科學分冊》[4]87：啞鈴型膿腫反復破潰流膿，創(chuàng)面經久不愈；病理確定為結核，創(chuàng)面組織或膿液做實時熒光PCR-結核分枝桿菌rpoB基因檢測為陽性。

1.2.2 中醫(yī)診斷標準 參考《中醫(yī)病證診斷療效標準》[10]中瘰疬病陰虛火旺證診斷標準。主證：膿腫潰破，瘡面肉芽疏松、色蒼白或黯紅，可有潛行性空腔，竇道迂曲復雜，流出清稀膿液，夾有敗絮樣物或豆渣樣物，瘡周皮色紫黯或黯紅。次證：潮熱盜汗，舌紅少苔，脈細數(shù)。主證必備，結合次證，即可診斷。1.3 納入標準 符合中西醫(yī)診斷標準；創(chuàng)面面積1～18 cm2，竇道長度1～18 cm；年齡18～65歲；患者自愿參加本研究并簽署知情同意書。

1.4 排除標準 非結核性創(chuàng)面者；對本研究用藥過敏者；合并其他機能系統(tǒng)嚴重原發(fā)性疾病者；肌酐（CRE）＞1×N（N為正常值上限），谷丙轉氨酶（ALT）＞2×N（N為正常值上限）；精神性疾病患者或孕產婦。

2 治療方法

2.1 基礎治療 予異煙肼（杭州民生藥業(yè)有限公司，批號：T18F009）每次0.3 g，每日1次，口服；利福平（沈陽紅旗制藥有限公司，批號：1812291），每次0.45 g，每日1次，晨起空腹頓服；鹽酸乙胺丁醇（上海新亞藥業(yè)閔行有限公司，批號：063180753），每次0.75 g，每日1次，口服；雙環(huán)醇（北京協(xié)和藥廠，批號：180606），每次25 mg，每日3次，口服。

2.2 治療組 予基礎治療聯(lián)合澤及流浸膏納米材料外用。消毒皮膚、清創(chuàng)去除病灶內壞死組織及膿性分泌物，根據(jù)創(chuàng)面深度和寬度剪裁澤及流浸膏納米材料，填塞進創(chuàng)腔內，松緊適宜，醫(yī)用紗布或醫(yī)用棉墊外覆，醫(yī)用膠布固定，每2 d換藥1次。

澤及流浸膏由南京市中西醫(yī)結合醫(yī)院制劑室提供，制備方法：取澤漆、白及、貓爪草按8.33∶1.00∶1.67 劑量配比，水煎濃縮至流浸膏劑型，每毫升含生藥4.37 g。納米材料的主要成分為殼聚糖和纖維素，此二者也是常用于創(chuàng)面敷料的材料，安全無毒[11]。室溫下將殼聚糖溶解于2%的醋酸溶液中，得到濃度為1%的殼聚糖醋酸溶液。磁力攪拌殼聚糖醋酸溶液并緩慢滴加濃度為4%的氫氧化鈉溶液至殼聚糖完全析出，最終得到均一的殼聚糖凝膠沉淀的懸濁液。將懸濁液離心洗滌得到純凈的殼聚糖凝膠沉淀，置于冰箱保存。于凝膠沉淀中加入提純的澤及流浸膏（殼聚糖凝膠沉淀與澤及流浸膏質量比為10∶1）后混合均勻，纖維素經羧甲基化后得到羧甲基纖維素，最后按比例加入氧化羧甲基纖維素和甘油，冷凍24 h后再凍干2 d，得到最終的澤及流浸膏納米材料（由南京理工大學材料學院制備）。

2.3 對照組 予基礎治療聯(lián)合醫(yī)用凡士林油紗布外用。消毒清創(chuàng)等方法同治療組，予醫(yī)用凡士林油紗布（新鄉(xiāng)市華西衛(wèi)材有限公司，6 cm×20 cm，批號：1933007）填塞創(chuàng)腔，每2 d換藥1次。

2組療程均為28 d。

3 療效觀察

3.1 觀察指標

3.1.1 創(chuàng)面及皮膚組織巨噬細胞超微結構 于換藥第1、15、28日在創(chuàng)面及邊緣皮膚同一位置取得大小為1 mm×1 mm×1 mm的組織，務必做到“快，準，小，冷”，取材后置于標記序號的裝有4%戊二醛溶液的離心管中，冰箱冷藏室固定4 h以上。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，脫水，包埋，最后超薄切片后置于透射電鏡（型號：JEM-1010，南京醫(yī)科大學電鏡分析測試中心）下觀察巨噬細胞情況。

3.1.2 創(chuàng)面寬度、深度 于換藥第1、28日行彩超檢查，記錄膿腔上下徑、左右徑、前后徑的測量值。

3.1.3 安全性觀察及復發(fā)情況 于換藥第1、28日抽取2 組患者靜脈血，查血常規(guī)、肝腎功能主要指標。治療結束后隨訪6 個月，統(tǒng)計2 組痊愈患者的復發(fā)情況。

3.2 療效判定標準 參考《中藥新藥臨床研究指導原則》[12]擬定療效判定標準，于療程結束后判定療效。臨床痊愈：全身癥狀消失，創(chuàng)面愈合，實驗室檢查指標正常；顯效：創(chuàng)面縮小1/2以上，或數(shù)量減少1/2以上，實驗室檢查指標正常；有效：創(chuàng)面縮小或數(shù)量減少不足1/2，實驗室檢查指標有改善；無效：創(chuàng)面大小及數(shù)量無改善。

3.3 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用方差分析，組間療效差異性比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3.4 治療結果

3.4.1 2組患者臨床療效比較 見表1。

表1 治療組與對照組患者臨床療效比較 單位：例

3.4.2 2組患者創(chuàng)面及皮膚組織巨噬細胞超微結構比較 見圖1。換藥第1日：2組患者創(chuàng)面組織巨噬細胞形態(tài)結構特征基本一致，鏡下均可見大量線粒體腫脹呈空泡狀，細胞核崩解為小碎片，核膜消失，提示核碎裂，細胞內高爾基體、內質網、溶酶體等結構基本不存在，提示細胞死亡。換藥第15日：治療組創(chuàng)面組織巨噬細胞的大量線粒體擴張呈空泡狀，相互聚集擠壓，部分線粒體嵴結構存在，可見數(shù)個髓樣小體，部分內質網輕度擴張呈囊泡狀；對照組創(chuàng)面巨噬細胞可見大量線粒體無線粒體嵴呈空泡狀，核外形雖存在但核仁消失，可見少量次級溶酶體。換藥第28日：治療組創(chuàng)面巨噬細胞結構明顯生長良好，可觀察到大量結構完整規(guī)則的內質網和線粒體，線粒體嵴結構明顯，內質網上附著大量核糖體，可見細胞膜形態(tài)完整，細胞核膜結構清晰，核仁形態(tài)正常，溶酶體數(shù)量減少；對照組創(chuàng)面巨噬細胞仍可見線粒體腫脹溶解，大量呈空泡狀，僅見少量線粒體嵴結構明顯的線粒體，內質網輕度擴張，吞噬小體內可見殘余細胞器。

換藥第1日：2組患者皮膚組織巨噬細胞形態(tài)結構特征基本一致，鏡下均可見大量線粒體腫脹呈空泡狀，偶可見線粒體嵴，染色質碎片分散在胞核內，核膜消失，呈核壞死的表現(xiàn)，細胞內高爾基體、內質網、溶酶體等結構及細胞膜基本不存在。換藥第15日：治療組皮膚組織巨噬細胞出現(xiàn)較多線粒體，其嵴結構顯現(xiàn)，相互聚集擠壓，細胞膜結構完整，可見少量偽足，核仁清晰，細胞質內可見吞噬小體，部分內質網輕度擴張；對照組皮膚組織巨噬細胞僅可見線粒體膜結構，細胞內質網輕度擴張，可見少量高爾基體。2組均可見細胞周圍皮膚組織特有的膠原纖維。換藥第28日：治療組皮膚組織巨噬細胞結構明顯生長良好，可觀察到大量結構完整規(guī)則的線粒體、粗面內質網，線粒體嵴結構明顯，細胞核膜結構清晰，核仁形態(tài)正常，核體積無增大，核內物質結構穩(wěn)定，細胞膜形態(tài)完整，偽足清晰可見；對照組皮膚組織巨噬細胞可見線粒體腫脹溶解，大量呈空泡狀，僅見少量線粒體嵴結構明顯的線粒體，細胞膜部分溶解，核體積略增大，內質網輕度擴張，吞噬小體內可見殘余細胞器。2組均可見細胞周圍皮膚組織特有的膠原纖維。

3.4.3 2組患者治療前后創(chuàng)面寬度、深度比較 見表2。

3.5 安全性觀察及隨訪復發(fā)情況 2組患者治療前后血常規(guī)及肝腎功能指標均在正常值范圍。隨訪6個月，治療組痊愈病例創(chuàng)腔愈合好，無全身不適，無復發(fā)，對照組有1例復發(fā)。

4 討論

結核性創(chuàng)面最常見于淋巴結核中后期寒性膿腫破潰，其特點是長期流膿難愈。根據(jù)淋巴結核診療指南，在用抗結核藥物基礎治療的同時對寒性膿腫可采取切開引流術或竇道切除術，但手術存在病灶清除不徹底，術中損傷神經、血管或淋巴管，術后創(chuàng)面難愈等風險[13-14]，因此如何提高結核性創(chuàng)面的療效仍是亟待解決的難題。淋巴結核屬于中醫(yī)學“瘰疬”范疇，其核心病機是毒、瘀、腐、虛。毒為標，素體本虛染毒而發(fā)病，毒邪瘀滯，為生腐之源，瘀腐積熱，日久傷陰，故成瘰疬病陰虛火旺之證。瘀腐纏綿，新肉不生，損耗逾甚。毒、瘀、腐、虛四者互為因果，循環(huán)往復，使瘡面難以向愈。治療當以解毒祛瘀、化腐生肌為大法，我們采用澤及流浸膏納米材料直接作用于瘡面起到祛腐拔毒、提膿斂瘡、生肌收口的作用。

圖1 換藥各時期治療組與對照組創(chuàng)面組織、皮膚組織巨噬細胞超微結構（醋酸鈾、檸檬酸鉛染色法）

表2 治療組與對照組患者治療前后創(chuàng)面各徑測量值比較（） 單位：mm

表2 治療組與對照組患者治療前后創(chuàng)面各徑測量值比較（） 單位：mm

注： 與本組治療前相同徑比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組治療后相同徑比較，##P＜0.01。

組別 例數(shù) 治療前 治療后上下徑 左右徑 前后徑 上下徑 左右徑 前后徑治療組 31 27.77±7.23 22.84±6.01 29.90±8.93 7.97±3.93**## 5.07±3.79**## 5.36±3.92**##對照組 30 24.37±9.46 25.10±7.40 25.20±10.22 19.17±7.44* 18.00±5.69** 19.53±8.22*

明·鄺璠《便民圖纂》云：“男婦瘰疬，貓兒眼睛草一二捆……乃搽此膏，數(shù)次愈。”指出貓兒眼睛草（即澤漆）外用瘰疬瘡面數(shù)次可愈。明·李時珍《本草綱目》記載：白及主治“發(fā)背瘰疬……生肌止痛”。澤漆殺蟲消腫、化痰祛瘀，貓爪草解毒祛腐、化痰散結，白及收斂消腫、生肌止痛。澤漆與貓爪草味辛，能散能行，有散結行瘀之效，可將瘡面的瘀腐拔除；澤漆與白及性微寒、味苦，滋陰降火；白及與貓爪草味甘，能補虛生新?，F(xiàn)代研究也表明這三種草藥具有良好的抗結核作用[15-17]。

MTB是一種可寄生于宿主巨噬細胞的細胞內病原體，巨噬細胞可以通過不同的方式消除MTB，因此在結核性創(chuàng)面治療過程中起到關鍵的作用。結核性創(chuàng)面液化壞死高峰期時，創(chuàng)腔內存在大量壞死組織，清除這些組織不僅是去除了創(chuàng)面收縮的障礙，同時也去除了內含的MTB以及其他削弱宿主免疫力的物質，因此清除壞死組織對結核性創(chuàng)面的愈合至關重要。澤及流浸膏納米材料的優(yōu)勢在于祛腐以促肌生，并可以調控和誘導巨噬細胞分化，吸收滲液，在瘡面創(chuàng)造相對潔凈的微環(huán)境，有利肉芽、皮膚的生長。

透射電鏡結果表明，治療初始時2組患者創(chuàng)面和皮膚組織巨噬細胞可見大量線粒體腫脹呈空泡狀，各大細胞器結構紊亂不可辨。換藥15 d，2組患者創(chuàng)面和皮膚組織巨噬細胞均可見溶酶體樣結構而治療組明顯多于對照組。換藥28 d，治療組的各大細胞器超微結構恢復。說明澤及流浸膏納米材料能改善因結核桿菌入侵而導致的內質網的重度擴張狀態(tài)，重建核仁。值得關注的是，本研究觀察到巨噬細胞超微病理恢復正常與彩超測得的膿腔上下、左右、前后徑的縮小呈正相關，即隨著巨噬細胞的細胞器改善，創(chuàng)面膿腔也隨之愈合，且治療組的愈合程度遠大于對照組。

綜上，澤及流浸膏納米材料外用治療結核性創(chuàng)面效果明顯優(yōu)于醫(yī)用凡士林紗布，并對創(chuàng)面和皮膚組織巨噬細胞有明顯的修復作用，安全有效。澤及流浸膏納米材料使中藥行瘀祛腐、解毒生肌的功效通過納米材料的緩釋及降解作用得以充分發(fā)揮，明顯促進了結核性創(chuàng)面愈合，值得臨床推廣，并擬進行藥效學及分子生物學方面的深入研究。