番石榴葉提取物調節(jié)白色脂肪組織棕色化作用機制研究

代 培，許光遠，劉銅華，高 明，蘇 通，周靜鑫，喬 羽，郭翔宇

(1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078；2.首都醫(yī)科大學附屬復興醫(yī)院，北京 100038；3.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；4．日本武庫川女子大學藥學部，日本 兵庫 6638179；5.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院通州院區(qū)，北京 101121)

隨著人們生活方式的改變，糖尿病患病率逐年升高[1]?，F代醫(yī)學認為超重和肥胖是糖尿病的獨立危險因素。中醫(yī)學對肥胖導致糖尿病的觀點早在《素問·奇病論》中就有明確提出：“脾癉為肥美之人所發(fā)也，此人必數食甘美而多肥也，肥者令人熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉為消渴”?！爸沃蕴m，除陳氣也”是糖尿病治療的原則。番石榴葉(Guava leaf)具有燥濕健脾、清熱解毒的功效，是中醫(yī)用來治療糖尿病的常用藥材。本研究中，通過細胞實驗，觀察番石榴葉提取物對db/db小鼠成肌細胞過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)、Ⅲ型纖連蛋白域包含蛋白5(Type Ⅲ fibronectin domain contains protein 5，FNDC5)以及脂肪組織SVF細胞PR結構域16(PR domain-containing 16，Prdm16)蛋白表達的影響，進一步揭示番石榴葉提取物調節(jié)脂質代謝的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究動物：購買6周齡雄性SPF級db/db(品系為C57BLKS)小鼠24只、同齡C57BL/6J正常組小鼠6只，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心。

1.1.2 主要儀器與試劑：血糖儀(Bayer公司)，DMEM培養(yǎng)基(Lot:31331093，Thermo Fisher公司)，胎牛血清(Lot：10100147，Gibco-BRL公司)，胰蛋白酶(Lot：T2600000，Sigma公司)，膠原酶(Lot：C6079，Sigma公司)，Ficoll400(Lot:20190530，Pharmacia公司)，結蛋白單克隆Desmin抗體(批號 ZA-0610，中杉生物公司)，MTT Assay試劑盒(Lot：211091，Amerison公司)，CD31單克隆抗體(Lot：77699S，CST公司)，CD34單克隆抗體(Lot：3569，CST公司)，Anti-PGC-1α抗體(Lot：ab191838，Abcam公司)，重組Anti-FNDC5抗體(Lot：ab174833，Abcam公司)，Anti-Prdm16抗體(Lot：ab106410，Abcam公司)，Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody(Lot：7074，CST公司)，猴抗山羊FITC二抗(Lot：F4891，Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗藥物制備：番石榴葉提取物由北京中醫(yī)藥大學藥學院制備。提取工藝具體操作如下：番石榴葉片粉碎后取粗粉1.1 kg，用3倍量乙酸乙酯在25 ℃、超聲50 MHz條件下提取10 min，重復共7次，過濾取藥渣，用5倍量的乙醇超聲提取15 min，重復4次，留取過濾液， 濃縮得浸膏。浸膏與4倍量水制成混懸液，6000 r/min條件下離心15 min得上清液1；乙醇提取剩余藥渣用5倍量水超聲提取40 min，重復2次，將2次過濾所得濾液合并，在6000 r/min的條件下離心15 min得上清液2，合并上清液1、2，采用改良明膠法去除鞣質，再次過濾后濾液上聚酰胺 (100～200目) 柱，依次用水洗脫，洗脫液減壓濃縮，制得水浸膏64.07 g。

1.2.2 動物分組及給藥：適應性喂養(yǎng)2周后，禁食12 h，斷尾后用血糖儀檢測空腹血糖。將空腹血糖≥7.0 mmol/L的db/db小鼠納入實驗，隨機分為模型組和番石榴葉提取物高劑量組、番石榴葉提取物中劑量組、番石榴葉提取物低劑量組，四組各6只，同齡C57BL/6J小鼠6只為正常組。用體表面積法計算每日小鼠給藥量，番石榴葉提取物按高(14 mg/kg)、番石榴葉提取物中劑量(7 mg/kg)、番石榴葉提取物低劑量(3.5 mg/kg)，每日灌胃1次，正常組和模型組灌予等體積蒸餾水，連續(xù)4周。實驗期間，小鼠均以普通飼料喂養(yǎng)，且除實驗要求空腹禁食外，均自由進食、飲水。

1.2.3 觀察指標：觀察小鼠一般情況、每2周檢測空腹血糖及體重，處死、取材及檢測生化指標。實驗末即第29天空腹脫臼處死所有小鼠，眼眶取血，檢測空腹血糖、甘油三酯(Triglycerides，TG)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)。

1.2.4 細胞培養(yǎng)：①原代成肌細胞培養(yǎng)及純化：空腹脫臼處死db/db小鼠、C57BL/6J小鼠后，取后腿腓腸肌組織剪碎，0.125%胰酶消化分離細胞，離心后用配置好的培養(yǎng)基(含15%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基)制備細胞懸液，并按2×105個/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，在顯微鏡下觀察細胞生長情況。將制備好的Ficoll400梯度液用D-Hanks液配制成200 g/L，進行稀釋配制成梯度離心液。取原代培養(yǎng)第2天的細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。②原代脂肪組織SVF細胞培養(yǎng)、接種和傳代：空腹脫臼處死db/db小鼠和C57BL/6J小鼠后，取皮下脂肪組織剪碎，用1%BSA和0.1% N型膠原酶消化分離細胞，間斷振蕩后終止消化，離心后重懸計數，移入含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當鏡下觀察到細胞生長約70%～80%時即會傳代。

1.2.5 細胞實驗分組：取對數生長期的成肌細胞、第3代脂肪組織SVF細胞，以1×105個/ml密度接種至96孔板。對細胞進行實驗分組，具體分組情況如下：正常對照組、模型組、番石榴葉提取物高劑量組、番石榴葉提取物中劑量組、番石榴葉提取物低劑量組(終濃度分別為10、50、100 μg/ml)。

1.2.6 蛋白水平檢測：各組細胞連續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞并提取蛋白。Western blot法檢測各組成肌細胞PGC-1α、FNDC5蛋白表達；并檢測各組脂肪組織SVF細胞Prdm16蛋白表達。

2 結 果

2.1 各組小鼠體重及空腹血糖比較 第4周時，和正常組相比，模型組小鼠體重、空腹血糖均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，番石榴葉提取物高劑量組小鼠體重及血糖均低，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 各組小鼠血脂情況比較 和正常組相比，模型組小鼠血清TC、TG和LDL含量明顯升高，HDL含量明顯降低，組間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與模型組比較，番石榴葉提取物各劑量組小鼠TC含量無明顯改善，TG含量降低，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；番石榴葉提取物中劑量組、番石榴葉提取物低劑量組HDL明顯升高，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；番石榴葉提取物高劑量組LDL水平降低，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組小鼠體重及空腹血糖比較

表2 各組小鼠血脂情況比較(mmol/L)

2.3 各組成肌細胞PGC-1α、FNDC5蛋白以及脂肪組織SVF細胞Prdm16蛋白表達比較 與正常組小鼠成肌細胞比較，模型組小鼠成肌細胞的PGC-1α、FNDC5蛋白及脂肪組織SVF細胞Prdm16蛋白表達均低，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組小鼠成肌細胞比較，番石榴葉提取物高劑量組小鼠成肌細胞的PGC-1α、FNDC5蛋白及脂肪組織的SVF細胞Prdm16蛋白表達均高，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3(圖1、2)。

表3 各組成肌細胞PGC-1α、FNDC5蛋白及脂肪組織SVF細胞Prdm16蛋白表達比較

NC：正常組；DM：模型組；FSL-H：番石榴葉提取

NC：正常組；DM：模型組；FSL-H：番石榴葉提取

3 討 論

超重和肥胖是2型糖尿病的主要危險因素之一[2]。肥胖多由于脂肪組織分布不均導致，哺乳動物的脂肪組織主要有白色脂肪組織(White adipose tissue，WAT)和棕色脂肪組織(Brown adipose tissue，BAT)，WAT具有機械保護、隔熱和儲能的作用，BAT主要調節(jié)產熱[3-5]，肥胖的特征在于WAT質量的增加[6-7]。PGC-1α、FNDC5、Irisin等代謝因子，能促進線粒體生成、調節(jié)脂質代謝、增加能量代謝，從而減少代謝性疾病的發(fā)病率[8]。PGC-1α主要存在于線粒體含量豐富的組織，如骨骼肌、BAT，在WAT棕色化中發(fā)揮了重要作用[9-10]。Prdm16是BAT特異性輔助因子，與WAT細胞相比，該輔助因子在BAT細胞中高度表達，對于BAT細胞的形成至關重要[11]，同時，Prdm16也促進了WAT棕色化[12]，Prdm16通過與C末端結合蛋白相互作用來抑制經典的WAT細胞基因，并刺激WAT中參與產熱作用的PGC-1α、解偶聯(lián)蛋白1(Uncouple protein 1，UCP1)的轉錄[13-14]。

番石榴葉具有燥濕健脾、清熱解毒的功效。多項實驗證明，番石榴葉提取物具有降低血糖、體重、血脂等作用[15-17]。在前期動物實驗中，我們已經證實了番石榴葉提取物可通過調節(jié)骨骼肌的AMPK-PGC-1α-FNDC5信號通路轉導，誘導白色脂肪組織棕色化減輕體重[18]。本研究中，我們觀察了番石榴葉提取物對db/db小鼠成肌細胞PGC-1α、FNDC5，以及脂肪組織SVF細胞Prdm16蛋白表達的影響。結果發(fā)現，在動物實驗中，番石榴葉提取物高劑量組能明顯降低糖尿病小鼠的體重、血糖、LDL水平，在細胞實驗中，番石榴葉提取物能顯著提高小鼠成肌細胞PGC-1α、FNDC5以及脂肪組織SVF細胞Prdm16蛋白表達。番石榴葉提取物分別上調成肌細胞PGC-1α、FNDC5和脂肪組織SVF細胞Prdm16蛋白水平，說明番石榴葉提取物可以通過促進白色脂肪細胞向棕色脂肪細胞分化，提高棕色脂肪水平，從而通過增加機體的能量代謝來調節(jié)脂質代謝。

番石榴葉提取物促進白色脂肪細胞向棕色脂肪細胞分化的實驗結果充實了“治之以蘭，除陳氣也”的理論基礎，為臨床匯總燥濕健脾類中藥降低血糖、體重提供了新思路。