加速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大棗中3種五環(huán)三萜酸

張 萍，何 婷，王 穎，胡克特，顧 丁，陳榮祥

（遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000）

大棗為鼠李科植物棗樹（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果實(shí)，不僅作為食物，還是傳統(tǒng)中醫(yī)藥中的常用藥材。大棗富含氨基酸、多糖、三萜酸、環(huán)核苷酸和黃酮類化合物，有抗過敏、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、保肝、抗炎、抗氧化等藥理作用[1-2]。研究表明，五環(huán)三萜酸是大棗的主要活性成分之一，主要包括齊墩果酸、熊果酸、樺木酸等[3]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，棗中樺木酸、齊墩果酸和熊果酸對多種疾病有治療作用。齊墩果酸有抑制細(xì)菌生長、降低血脂、保肝、增強(qiáng)免疫力等生理功能[4]。熊果酸有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、保肝、降血糖作用[5]。樺木酸有顯著的抗腫瘤和抗病毒作用，及抗炎、抗糖尿病、抗高血脂等藥理作用[6]。因此，研究大棗中五環(huán)三萜酸的含量和組成對其質(zhì)量控制有積極意義。

加速溶劑萃取法（ASE）是一種利用傳統(tǒng)的液體溶劑在高溫高壓下提取化合物的自動(dòng)化提取技術(shù)，有回收率高、速度快、溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)[7]，在萃取復(fù)雜體系中化合物方面有一定優(yōu)勢，可用于提取食品、藥品中的多環(huán)芳烴、無機(jī)離子和藥物殘留等[8-13]。有文獻(xiàn)[14]證明采用ASE萃取中草藥中的齊墩果酸和熊果酸的提取效率優(yōu)于超聲提取法。但目前尚未見大棗中多種五環(huán)三萜酸的的ASE提取相關(guān)報(bào)道。

目前，植物源五環(huán)三萜酸的檢測方法主要采用高效液相色譜法，紫外檢測器/二極管陣列檢測器[15-16]、蒸發(fā)光散射檢測器[17]、串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）檢測器[18]等均可用于檢測[19-20]。五環(huán)三萜酸最大吸收波長在200 nm附近，但干擾嚴(yán)重，響應(yīng)較低，對于含量較高的中草藥可直接測定，而對低含量的樣品靈敏度不足，如大棗、赤芍中的五環(huán)三萜酸需用分散液-液萃取、離子液體萃取等方式加以富集[21-22]。相對于光學(xué)檢測器，MS/MS靈敏度高，與超高液相色譜法（UPLC）聯(lián)用可進(jìn)一步縮短分離時(shí)間、提高靈敏度。研究表明，采用UPLC可將齊墩果酸和熊果酸的分離時(shí)間由20～40 min縮短至約10 min[23-24]。本研究擬采用ASE從大棗中提取齊墩果酸、熊果酸和樺木酸（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1），用UPLC分離，MS/MS進(jìn)行檢測，為篩選優(yōu)質(zhì)品種棗和開發(fā)大棗保健功能食品提供技術(shù)支持。

圖1 齊墩果酸、熊果酸和樺木酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC-Xevo TQ-S超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，MassLynx V.4.1工作站軟件控制（美國Waters公司）；ASE-350型加速溶劑萃取儀（配有34 ml不銹鋼萃取池，賽默飛世爾科技公司）；SB-5200DT型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ME104E電子天平，F(xiàn)E28 pH計(jì)[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；PURELAB Chorus 2純水及超純水系統(tǒng)（英國埃爾格）；microfuge 20離心機(jī)（德國貝克曼）；0.22 μm尼龍濾膜[月旭科技（上海）有限公司]。

1.2 材料

乙腈（質(zhì)譜純，霍尼韋爾貿(mào)易有限公司）；齊墩果酸對照品（批號(hào)E1525063，純度大于97 %），熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)L1411037，純度大于98 %），甲醇、氨水、乙酸銨為色譜純（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；樺木酸對照品（批號(hào)AMW002，純度大于97 %，Ark Pharm）；硅藻土（賽默飛世爾科技公司）。其他試劑均為分析級。大棗購自當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備 將大棗樣品切片，90 ℃烘干后粉碎過60目篩，精密稱取粉碎均勻的試樣0.5 g，加入硅藻土混合均勻，裝入34 ml萃取池中進(jìn)行萃取。萃取條件：提取溶劑80 %甲醇水溶液，萃取溫度100 ℃，壓力1500 psi，循環(huán)1次，靜態(tài)萃取時(shí)間15 min，沖洗體積為提取池體積50 %。氮?dú)獯祾?0 s。收集全部提取液于量瓶中，并定容至100 ml，10 000 r/min離心10 min后過0.22 μm尼龍濾膜即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸、熊果酸、樺木酸的對照品，用甲醇溶解并定容于10 ml量瓶中，配制成濃度為1 mg/ml的對照品儲(chǔ)備液。使用時(shí)，根據(jù)需要移取對照品儲(chǔ)備液適量，以甲醇稀釋，配制成系列質(zhì)量濃度的混合對照品工作液。

2.1.3 液相色譜條件分析 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A相：乙腈；B相：15 mmoL/L乙酸銨溶液（氨水調(diào)節(jié)pH 9.3），采用梯度洗脫，0～4 min，75 %A，4～5 min為75 %A→95 %A，5～6.5 min為95 % A，6.5～7 min為95 %A→75%A，體積流量0.2 ml/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量1 μl。

2.1.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，在負(fù)離子檢測模式下多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）檢測。毛細(xì)管電壓：3.5 kV：蒸發(fā)溫度600 ℃；氣流量：750 L/h。進(jìn)一步對錐孔電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1。

表1 3種化合物質(zhì)譜參數(shù)

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 ASE條件的優(yōu)化 ASE的提取效率主要取決于提取溶劑的種類、提取溫度、提取次數(shù)和靜態(tài)提取時(shí)間。本研究中，所有提取均在1500 psi下進(jìn)行，提取池的沖洗體積為50 %，用氮?dú)獯祾?0 s。

2.2.2 提取溶劑的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)以甲醇為提取溶劑，考察不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇對3種組分提取效果的影響（見圖2）。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為80 %時(shí)，3個(gè)組分的提取效率均達(dá)到最高。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)大于80 %，提取率下降，因此可確定甲醇的體積分?jǐn)?shù)為80 %。

圖2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對于提取效率的影響

2.2.3 提取溫度的優(yōu)化 溫度是影響提取回收率的重要因素，本實(shí)驗(yàn)考察了不同溫度（60，80，100，110，120 ℃）對3種組分提取效率的影響（見圖3）。結(jié)果表明，100 ℃時(shí)3組分的提取率最高，超過100 ℃時(shí)，提取效率逐漸降低，因此，可確定提取溫度為100 ℃。

圖3 溫度對于提取效率的影響

2.2.4 提取時(shí)間的優(yōu)化 采用80 %甲醇在100 ℃下考察不同提取時(shí)間（靜態(tài)提取3，10，15，20，30 min）對3組分提取效率的影響（圖4）。結(jié)果表明，15～20 min時(shí)，3組分的提取率最高。因此，選擇提取時(shí)間為15 min。

圖4 提取時(shí)間對于提取效率的影響

2.2.5 提取次數(shù)優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取次數(shù)對3種組分提取效果的影響（見圖5）。結(jié)果表明，提取1～3次時(shí)，3種組分峰面積基本保持不變，為了減少提取時(shí)間，節(jié)省溶劑，選擇提取次數(shù)為1次。

圖5 提取次數(shù)對于提取效率的影響

2.2.6 色譜條件優(yōu)化 采用UPLC EBH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）為固定相，考察乙酸銨水溶液pH值（氨水濃度調(diào)節(jié)pH 7～10）對分離的影響。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相的pH＞9時(shí)，3種分析物的響應(yīng)更強(qiáng)，分離度更好。最終選擇乙腈和乙酸銨（15 mmol/L，pH 9.3）為流動(dòng)相。

2.2.7 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 以甲醇為溶劑，制備齊墩果酸、熊果酸和樺木酸的對照品溶液，濃度為300 μg/L。在全掃描模式下選擇前體離子，在負(fù)電離模式下優(yōu)化錐孔電壓。然后在產(chǎn)物離子掃描模式下選擇產(chǎn)物離子，在MRM模式下優(yōu)化了各產(chǎn)物離子的碰撞能量。優(yōu)化的前體離子、產(chǎn)物離子和碰撞能量參數(shù)見表1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限 精密稱取齊墩果酸、熊果酸、樺木酸對照品適量，配成混合對照品溶液，在同一色譜條件下進(jìn)樣，確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間，然后各取一定體積配成不同濃度的混合對照品溶液，進(jìn)樣量1 μl，記錄色譜圖，以峰面積對濃度（mg/L）進(jìn)行線性回歸，3種化合物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。齊墩果酸、熊果酸、樺木酸在0.5～10 mg/L濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。3種分析物的信噪比為3時(shí)的LOD分別為54，13，42 μg/L。

表2 線性方程與范圍、檢出限結(jié)果

2.3.2 加標(biāo)回收試驗(yàn) 精確稱取已測得含量的大棗樣品0.5 g，分別準(zhǔn)確加入一定量的對照品，根據(jù)優(yōu)化的提取條件對加標(biāo)樣品進(jìn)行處理，并在相同的色譜條件下進(jìn)行分析，將測得的峰面積代入回歸方程計(jì)算各化合物的含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。齊墩果酸、熊果酸和樺木酸的回收率分別為98.4 %～101.3 %，97.3 %～101.7 %，93.6 %～96.1 %，RSD分別為1.18 %～5.30 %，4.79 %～6.83 %，2.50 %～6.19 %之間，表明回收率良好。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

圖6 3種對照品（A）和樣品（B）化合物的色譜圖

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指從基質(zhì)中洗脫的其他組分對ESI源的影響，在電離過程中會(huì)對目標(biāo)化合物產(chǎn)生抑制或增強(qiáng)作用，從而影響檢測的準(zhǔn)確度和檢出限。本文比較了在基質(zhì)和空白溶劑中制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，以評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。以大棗提取物為原料，制備了0.5，1，2，5，10 mg/L系列基質(zhì)匹配溶液。計(jì)算方法如下：基質(zhì)效應(yīng)（%）=基質(zhì)匹配樣品溶液的平均斜率/標(biāo)準(zhǔn)溶液（甲醇配制）的平均斜率×100 %。結(jié)果表明：齊墩果酸、熊果酸和樺木酸的基質(zhì)效應(yīng)分別為98.61 %，92.67 %，95.82 %，樣品與溶劑之間無顯著的基質(zhì)效應(yīng)。

2.5 樣品測定

根據(jù)優(yōu)化后的ASE條件處理樣品，得供試品溶液，利用質(zhì)譜進(jìn)樣分析，計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果/mg·kg-1

2.6 ASE與超聲提取的比較

本研究比較了ASE和超聲輔助提取[25]對大棗中齊墩果酸、熊果酸和樺木酸的提取效率，結(jié)果見表5。ASE提取大棗中齊墩果酸、熊果酸和樺木酸的含量優(yōu)于超聲輔助提取法。因此，ASE更適于棗中五環(huán)三萜酸的提取。

表5 ASE與超聲提取效果比較

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于ASE-UPLC-MS/MS測定大棗中齊墩果酸、熊果酸和樺木酸含量的方法。與超聲輔助提取相比，該提取方法更有效，自動(dòng)化程度更高。采用弱堿性流動(dòng)相和UPLC色譜柱，在5 min內(nèi)分離出3種化合物，與其他色譜方法相比，大大縮短了分析時(shí)間且靈敏度顯著高于液相色譜法。本方法簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠，適用于大棗中齊墩果酸和熊果酸、樺木酸的同時(shí)測定。