東北刺人參總皂苷改善睡眠的作用及機(jī)制研究

于 爽，閆金銘，黃莉莉，羅煜婷，卞宏生，王艷艷，李廷利

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

東北刺人參（Oplopanax elatus Nakai），又名刺參，為五加科刺人參屬的一種多年生藥用植物[1]，其幼葉可食用，根莖部位常作藥用[2]。東北刺人參的生長(zhǎng)地區(qū)具有顯著的地域特點(diǎn)，目前發(fā)現(xiàn)僅在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、朝鮮北部山區(qū)和我國(guó)的吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)有其自然分布[3]，由于來源的稀少也被定為國(guó)家二類保護(hù)植物及吉林省一類保護(hù)植物。

現(xiàn)代藥物化學(xué)研究顯示東北刺人參具有多種活性物質(zhì)，主要為多糖類、皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油、不飽和脂肪酸等[4-5]。其藥理作用也涉及神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)的多個(gè)方面。東北刺人參在臨床上可用于治療神經(jīng)衰弱、失眠等癥，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明小鼠腹腔注射刺人參油乳劑，可出現(xiàn)安靜、伏臥、眼瞼下垂的表現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，初步確定了東北刺人參改善睡眠的有效部位為60 %乙醇洗脫組分，有效成分主要為皂苷類成分[6]，其改善睡眠作用與中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量有關(guān)[7]，但并未探究其改善睡眠的其他潛在機(jī)制。本研究結(jié)合以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過觀察東北刺人參總皂苷對(duì)小鼠自主活動(dòng)及小鼠翻正反射的影響，探討其改善睡眠的作用。通過測(cè)定東北刺人參總皂苷對(duì)睡眠剝奪小鼠腦部海馬、皮質(zhì)、下丘腦中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素4（IL-4）及白細(xì)胞介素10（IL-10）含量的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ZZ-6型小鼠自主活動(dòng)儀（成都泰盟科技有限公司）；Synergy MX型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）；XH-B型漩渦混勻器（美堰市康健醫(yī)療器具有限公司）；CT15E型低溫離心機(jī)（日本日立公司）。

1.2 試藥

東北刺人參，由吉林省集安市野生藥材種植基地提供；地西泮片（山東信宜制藥有限公司，批號(hào)：170101）；戊巴比妥鈉（Sigma公司，批號(hào)：160R03257Y）；對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA，Sigma公司，批號(hào)：MFCD00002601）；IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)R&D公司，批號(hào)：E20180301A）；TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)R&D公司，批號(hào)：E20180320A）；IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)R&D公司， 批號(hào)：E20180205A）；IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)R&D公司，批號(hào)：E20180210A）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR品系小鼠，SPF級(jí)，體重18～22 g，雄性。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)碼：SCXK（黑）2018-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)動(dòng)物房，溫度24±2 ℃，濕度55 %±15 %，12:12 h明暗交替，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可自由攝取食物和水。

2 方法

2.1 東北刺人參總皂苷的制備

稱取一定量東北刺人參藥材的根莖部，用10倍量的蒸餾水浸泡2 h，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濾過濃縮至折合生藥1 g/ml。取D101大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理，用乙醇浸泡4 h后，用乙醇以2 BV/h的流速通過樹脂層，洗至流出液加水不呈白色渾濁為止。將刺人參水煎液通過經(jīng)預(yù)處理的D101大孔樹脂，靜態(tài)吸附3 h后以蒸餾水反復(fù)沖洗，直至用薄層色譜檢測(cè)無糖顯色，再用4 BV 30 %乙醇洗脫，最后用6 BV 60 %乙醇洗脫直至無皂苷顯色。收集60 %乙醇洗脫液，減壓回收，水浴蒸干，得刺人參總皂苷。

2.2 東北刺人參總皂苷對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

將50只小鼠隨機(jī)分為空白組、刺人參總皂苷低、中、高劑量組及地西泮組，每組10只。其中實(shí)驗(yàn)藥物組經(jīng)灌胃途徑給予刺人參總皂苷（150，300，600 mg/kg），空白對(duì)照組給予同體積蒸餾水，連續(xù)7 d。陽性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予同體積蒸餾水，連續(xù)6 d，第7天灌胃給予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）。以上各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于末次灌胃30 min后，放入自主活動(dòng)測(cè)試儀內(nèi)適應(yīng)環(huán)境20 min。適應(yīng)后，測(cè)定各組小鼠10 min內(nèi)自主活動(dòng)次數(shù)及站立次數(shù)。

2.3 東北刺人參總皂苷對(duì)閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠潛伏期、睡眠時(shí)間的影響

將60只小鼠隨機(jī)分為空白組、刺人參總皂苷低、中、高劑量組及地西泮組，每組12只。其中實(shí)驗(yàn)藥物組經(jīng)灌胃途徑給予不同劑量刺人參總皂苷，空白對(duì)照組給予同體積蒸餾水，連續(xù)7 d。陽性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予同體積蒸餾水，連續(xù)6 d，第7天灌胃給予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）。以上各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于末次灌胃30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）。分別記錄各組小鼠從注射戊巴比妥鈉至翻正反射消失的時(shí)間及翻正反射消失的時(shí)間至翻正反射恢復(fù)的時(shí)間，即睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間。

2.4 東北刺人參總皂苷對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發(fā)生率的影響

將36只小鼠隨機(jī)分為空白組、刺人參總皂苷組及地西泮組，每組12只。給藥組灌胃給予刺人參總皂苷（300 mg/kg），連續(xù)7 d，其他兩組給藥方式同前。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于末次灌胃30 min后，腹腔注射閾下劑量戊巴比妥鈉（35 mg/kg）。以小鼠翻正反射消失為指標(biāo)，記錄30 min內(nèi)各組入睡動(dòng)物只數(shù)。

2.5 東北刺人參總皂苷對(duì)PCPA所致睡眠剝奪小鼠睡眠影響的作用

將30只小鼠隨機(jī)分為空白組、PCPA組及刺人參總皂苷+PCPA組，每組10只。刺人參+PCPA組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)灌胃途徑給予刺人參總皂苷（300 mg/kg）；空白組與PCPA組給予同體積蒸餾水，連續(xù)7 d。灌胃第5天，除空白組外的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)皮下注射途徑給予PCPA（350 mg/kg），空白組經(jīng)皮下注射途徑給予同體積的生理鹽水溶液，連續(xù) 2 d。各組均于末次注射30 min后，經(jīng)腹腔注射途徑給予戊巴比妥鈉50 mg/kg，記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間。

2.6 東北刺人參總皂苷對(duì)PCPA所致睡眠剝奪小鼠大腦海馬、皮質(zhì)、下丘腦中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響

將36只小鼠隨機(jī)分為空白組、PCPA組和刺人參總皂苷組，每組12只。給藥組經(jīng)灌胃途徑給予刺人參總皂苷（300 mg/kg），空白組及PCPA組給予同體積的蒸餾水，連續(xù)7 d。在灌胃第5天，除空白組外的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)皮下注射途徑給予PCPA（350 mg/kg），空白組經(jīng)皮下注射途徑給予同體積的生理鹽水溶液，連續(xù) 2 d。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物末次注射30 min后，斷頭取腦，分離海馬、皮質(zhì)、下丘腦。用冰生理鹽水將各部分腦組織勻漿后，取上清，待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫法，測(cè)定小鼠海馬、皮質(zhì)、下丘腦中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10的含量。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 東北刺人參總皂苷對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比較，刺人參總皂苷中劑量與高劑量能降低小鼠自主活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)；刺人參總皂苷中劑量與高劑量小鼠活動(dòng)次數(shù)顯著多于陽性對(duì)照組，但在站立次數(shù)方面，與陽性組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 刺人參總皂苷對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響（±s,n=10）

表1 刺人參總皂苷對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響（±s,n=10）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對(duì)照組；#P＜0.05 vs 陽性對(duì)照組

組別 劑量/mg·kg-1 活動(dòng)次數(shù)/次·(10 min)-1站立次數(shù)/次·(10 min)-1空白組 - 202.6±43.9 182.4±94.1刺人參總皂苷 150 189.7±43.4 180.7±34.1 300 142.8±62.8*# 112.7±60.9*600 131.3±32.2*# 122.3±43.6*地西泮 2.5 100.4±32.8** 94.7±30.1**

3.2 東北刺人參總皂苷對(duì)閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時(shí)間的影響

結(jié)果見表2。由表2可見，與空白對(duì)照組相比，刺人參總皂苷能顯著延長(zhǎng)小鼠睡眠時(shí)間，縮短睡眠潛伏期，但與空白對(duì)照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陽性對(duì)照組比較，刺人參總皂苷對(duì)小鼠睡眠潛伏期與睡眠時(shí)間的影響差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 刺人參總皂苷對(duì)閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時(shí)間的影響（±s,n=12）

表2 刺人參總皂苷對(duì)閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時(shí)間的影響（±s,n=12）

注：*P＜0.05 vs 空白對(duì)照組

組別 劑量/mg·kg-1 潛伏期/min 睡眠時(shí)間/min空白組 - 6.87±2.61 17.14±4.94刺人參總皂苷 150 6.06±1.13 22.47±6.93 300 5.92±1.15 32.07±9.26*600 5.62±1.28 32.26±11.34*地西泮 2.5 4.81±1.75* 36.65±10.58*

3.3 東北刺人參總皂苷對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發(fā)生率的影響

結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比較，刺人參總皂苷能提高小鼠睡眠發(fā)生率；與陽性對(duì)照組比較，刺人參總皂苷對(duì)小鼠睡眠發(fā)生率的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 刺人參總皂苷對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發(fā)生率的影響（n=12）

3.4 東北刺人參總皂苷對(duì)PCPA所致睡眠剝奪小鼠睡眠的影響

結(jié)果表明，給予PCPA可縮短戊巴比妥鈉所致小鼠的睡眠持續(xù)時(shí)間，與空白組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明模型復(fù)制成功。給予刺人參總皂苷后，與PCPA組比較，刺人參總皂苷可縮短戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠潛伏期，結(jié)果見表4。

表4 刺人參總皂苷聯(lián)合PCPA對(duì)戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響（±s,n=10）

表4 刺人參總皂苷聯(lián)合PCPA對(duì)戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的影響（±s,n=10）

注：*P＜0.05 vs 空白對(duì)照組；#P＜0.05 vs PCPA組

組別 劑量/mg·kg-1 潛伏期/min 睡眠時(shí)間/min空白組 - 3.62±0.59 86.2±22.9 PCPA組 350 4.04±0.76 58.7±16.31*刺人參+PCPA組 300/350 2.95±0.38*# 70.2±28.89

3.5 東北刺人參總皂苷對(duì)PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內(nèi)海馬、皮質(zhì)、下丘腦中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響

與空白組比較，PCPA組小鼠腦內(nèi)IL-1β、TNF-α含量明顯降低，IL-4及IL-10含量升高。給予刺人參總皂苷后，睡眠剝奪小鼠腦內(nèi)IL-1β及TNF-α含量升高，IL-4及IL-10含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表5～7。

表5 刺人參總皂苷對(duì)PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內(nèi)海馬中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

表5 刺人參總皂苷對(duì)PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內(nèi)海馬中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

注：*P＜0.05 vs 空白對(duì)照組；#P＜0.05 vs PCPA組

組別 IL-1β含量/pg·ml-1 TNF-α含量/pg·ml-1 IL-4含量/pg·ml-1 IL-10含量/pg·ml-1空白組 160.58±22.18 511.25±54.76 84.50±13.79# 320.33±36.77 PCPA組 146.92±23.18 480.50±64.76 100.40±20.01* 316.00±42.80給藥組 147.83±12.58 485.50±80.85 89.65±12.63 314.00±41.36

表6 刺人參總皂苷對(duì)PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

表6 刺人參總皂苷對(duì)PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對(duì)照組；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PCPA組

組別 IL-1β含量/pg·ml-1 TNF-α含量/pg·ml-1 IL-4含量/pg·ml-1 IL-10含量/pg·ml-1空白組 171.08±17.08## 534.25±66.3# 106.65±14.31 307.00±29.94#PCPA組 134.33±26.25** 451.50±50.92* 94.95±16.33 346.83±39.40*給藥組 138.92±8.73** 491.50±54.06 89.25±16.25* 325.83±31.32

表7 刺人參總皂苷對(duì)PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內(nèi)下丘腦中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

表7 刺人參總皂苷對(duì)PCPA所致睡眠剝奪小鼠腦內(nèi)下丘腦中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影響（±s,n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白對(duì)照組；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PCPA組

組別 IL-1β含量/pg·ml-1 TNF-α含量/pg·ml-1 IL-4含量/pg·ml-1 IL-10含量/pg·ml-1空白組 158.42±11.00 522.75±42.46 88.85±13.02 346.33±34.41 PCPA組 155.42±15.60 510.25±49.81 102.00±13.63 349.83±26.67給藥組 162.00±18.46 672.00±44.44**## 92.75±29.83 331.50±24.55

4 討論

本實(shí)驗(yàn)首先從動(dòng)物行為藥理學(xué)研究入手，探討了東北刺人參總皂苷對(duì)小鼠自主活動(dòng)及閾上閾下戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時(shí)間和睡眠發(fā)生率的影響。目前評(píng)價(jià)藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)是比較簡(jiǎn)單、易行的藥理學(xué)方法之一[8]。藥物對(duì)中樞的興奮或抑制作用通常能通過自發(fā)活動(dòng)次數(shù)反映，興奮時(shí)活動(dòng)次數(shù)增加，抑制時(shí)活動(dòng)次數(shù)減少，所以小鼠自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[9]。本實(shí)驗(yàn)通過東北刺人參總皂苷對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響可看出東北刺人參有效成分能顯著減少小鼠自主活動(dòng)，具有明確的鎮(zhèn)靜、抑制中樞的作用。

戊巴比妥鈉協(xié)同實(shí)驗(yàn)是考察鎮(zhèn)靜催眠藥物的常用方法[10]。受試藥物若能延長(zhǎng)閾劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時(shí)間或縮短睡眠潛伏期或增加閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發(fā)生率，則說明受試藥物與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用，且單純抑制肝藥酶，減少戊巴比妥鈉代謝的藥物不會(huì)明顯影響閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發(fā)生率[11]。本實(shí)驗(yàn)中給予了東北刺人參總皂苷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)閾劑量戊巴比妥鈉能明顯縮短睡眠潛伏期和延長(zhǎng)睡眠時(shí)間，對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠發(fā)生率也有顯著提高，且作用與陽性對(duì)照藥物無明顯差異，這些結(jié)果均顯示東北刺人參總皂苷具有改善睡眠的作用，且此種作用與肝藥酶無關(guān)。

一般認(rèn)為，改善睡眠可降低對(duì)免疫相關(guān)疾病的易感性，提高免疫力也可改善睡眠狀態(tài)[12]。因此，許多免疫增強(qiáng)劑及免疫調(diào)節(jié)劑都具有調(diào)節(jié)睡眠時(shí)相，改善睡眠質(zhì)量的作用。同樣的，由于睡眠期間免疫系統(tǒng)會(huì)維持其平衡功能，因此，睡眠也成為免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)劑。另一方面，睡眠不足會(huì)影響新陳代謝，可能是慢性炎癥和代謝性疾病發(fā)展的危險(xiǎn)因素。促炎性細(xì)胞因子IL-1，IL-6和TNF會(huì)增加非快速眼動(dòng)睡眠，而消炎性細(xì)胞因子（如IL-4和IL-10）會(huì)減少睡眠時(shí)間[13]。東北刺人參為五加科植物，以往實(shí)驗(yàn)報(bào)道證明了東北刺人參具有增強(qiáng)免疫的作用[14]。因此本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了東北刺人參改善睡眠的細(xì)胞因子機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦內(nèi)不同部位與睡眠相關(guān)的細(xì)胞因子均發(fā)生了不同程度的含量變化，總體顯示為促進(jìn)睡眠的細(xì)胞因子含量增高，抑制睡眠的細(xì)胞因子含量降低。說明細(xì)胞因子機(jī)制可能是刺人參總皂苷改善睡眠作用的機(jī)制之一。