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    西藏牦牛源沙門菌的分離鑒定及耐藥分析

    2021-10-30 03:53:06李天嬌周賽賽斑馬澤郎盧姊豪尹力鴻呂家煌趙曉慧索朗斯珠西藏農牧學院動物科學學院西藏林芝860000江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所江蘇南京2008
    中國獸醫(yī)學報 2021年10期
    關鍵詞:林芝沙門血清型

    李天嬌,周賽賽,斑馬澤郎,吳 丹,盧姊豪,尹力鴻,2,呂家煌,2,趙曉慧,李 霞,索朗斯珠* (.西藏農牧學院 動物科學學院,西藏 林芝 860000;2.江蘇省農業(yè)科學院 獸醫(yī)研究所,江蘇 南京 2008)

    沙門菌(Salmonella)屬腸桿菌科沙門菌屬,為革蘭陰性短小桿菌。沙門菌血清型較多,國內常見血清型均具有一定致病性,可引發(fā)人畜共患病[1-2]。據國內外文獻報道[3-11],沙門菌在禽類、家畜、寵物和野生動物中均有發(fā)現,并引發(fā)相關疫?。灰渤T谑澄锛捌湓牧现写嬖?,引起人類食物中毒[12-14]。同時,沙門菌呈全球性分布,由沙門菌引起的疫情曾在世界多國大規(guī)模暴發(fā)[15]。動物感染沙門菌常引發(fā)腹瀉、腸炎、流產和敗血癥等疾病[16]。沙門菌的流行也嚴重威脅著牛群的健康:成牛感染沙門菌的臨床特征表現為水樣或血性腹瀉,常伴有發(fā)熱、食欲不振、精神沉郁等癥狀;犢牛感染沙門菌的死亡率遠高于成牛[17]。

    牦牛是生長于我國高海拔地區(qū)的獨特物種,也是西藏當地牧民的主要經濟來源之一,西藏更是我國牦牛的主產區(qū)之一[18]。沙門菌在牧區(qū)長期處于流行狀態(tài),主要通過糞口傳播,加之牧區(qū)牦牛的養(yǎng)殖模式主要以放牧為主,因此環(huán)境中的水源和食物極易被污染,從而使其他健康牛也被感染患病,甚至死亡,嚴重影響牦牛及其產業(yè)的健康發(fā)展[19]。目前,國內外關于牦牛源沙門菌的研究報道較少,有關西藏地區(qū)沙門菌的研究更少[20]。因此本研究從西藏部分地區(qū)腹瀉牦牛的糞便中分離沙門菌,并對其進行血清型分型、遺傳進化分析、耐藥表型和耐藥基因分析,為西藏牦牛源沙門菌的防治、后續(xù)相關研究以及臨床用藥提供科學的指導。

    1 材料與方法

    1.1 樣品本試驗共采集西藏腹瀉牦牛糞便91份,其中拉薩市44份、林芝市21份、那曲市26份,將采集的糞便樣品編號后置于-80℃保存。

    1.2 主要試劑BPW培養(yǎng)基、MRSV培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基購自美國BD上海有限公司;SS培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、TSI培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂及12種抗菌藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司;革蘭染色試劑盒購自青島海博生物技術有限公司;TR101沙門菌屬診斷血清試劑盒購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司;Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0)、DL2000 DNA Marker購自大連寶生物有限公司。

    1.3 細菌分離純化參照GB4789.4-2010[21]和LIU等[22]的方法對樣品中的細菌進行分離鑒定。利用BPW培養(yǎng)基對糞便樣品進行預增菌,在MRSV半固體培養(yǎng)基上對增菌液進行初篩,初篩后在SS瓊脂和BS瓊脂選擇性培養(yǎng)基上復篩,對篩選出的單菌落進行革蘭染色并鏡檢。

    1.4 生化試驗用純培養(yǎng)的菌液轉種TSI斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)12 h后觀察結果,判定標準見表1。

    表1 沙門菌生化試驗判定標準

    1.5 特異性基因鑒定通過PCR技術檢測分離菌株的特異性基因invA[23-24],利用引物序列:5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′;5′-TC-ATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′對分離菌株進行PCR鑒定,通過1.0%瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳分析。

    1.6 血清型檢測沙門菌的血清型鑒定嚴格按照寧波天潤生物藥業(yè)有限公司提供的TR101沙門菌屬血清診斷說明書操作,觀察凝集的情況,記錄結果。

    1.7 藥敏試驗參照世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)推薦的K-B法進行該試驗[36]。將純培養(yǎng)菌液均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂上,將12種藥敏片貼于平皿中央,于37℃倒置培養(yǎng)24 h。參照NCCLS(2013)公布的標準,根據抑菌圈大小,對結果做出判定,藥敏結果判定標準見表2。

    表2 藥敏結果判定標準

    1.8 耐藥基因檢測參考文獻[26-29],選擇與6類抗生素相關的15種耐藥基因進行PCR擴增,引物序列見表3。

    表3 沙門菌耐藥基因擴增引物及相關信息

    1.9 構建系統(tǒng)發(fā)育樹對分離菌株的invA基因進行PCR檢測后,回收特異性擴增片段,將之克隆至pMD18-T載體并進行測序。用NCBI網站在線BLAST程序對測序結果進行比對;利用MEAG 7.0軟件,選取部分在GenBank已登錄的序列進行比對并構建遺傳進化樹。

    2 結果

    2.1 細菌培養(yǎng)分離菌株在BS培養(yǎng)基上形成表面光滑、有金屬光澤的黑色單菌落,同時也會形成另一種灰綠色菌落;在SS培養(yǎng)基上形成中心有黑點的無色單菌落;革蘭染色的鏡檢結果顯示其為革蘭陰性短小桿菌(圖1)。

    圖1 西藏牦牛源分離菌株革蘭染色鏡檢結果(1 000×)

    2.2 生化鑒定11株分離菌株均能與三糖鐵反應產生H2S,并生成黑色沉淀,能產氣、產酸且具有動力,結果見圖2。

    圖2 西藏牦牛源分離菌株生化試驗結果

    2.3 特異性基因鑒定對分離菌株invA基因進行PCR擴增,產物條帶大小約280 bp,與目的條帶大小一致,確定分離獲得11株沙門菌,鑒定結果見圖3,總檢出率為12.08%(11/91),其中拉薩市3株、那曲市5株、林芝市3株,沙門菌地理位置占比見圖4。

    M.DL2000 DNA Marker;+.陽性對照;-.陰性對照;L1~L2.拉薩市樣品;Z1~Z2.林芝市樣品;N1~N2.那曲市樣品圖3 牦牛源沙門菌invA基因PCR擴增結果

    圖4 11株牦牛源沙門菌地理位置分布及占比

    2.4 血清型鑒定血清型分型鑒定結果顯示:都柏林沙門菌3株,占比27.18%(3/11);丙型副傷寒沙門菌3株,占比27.28%(3/11);傷寒沙門菌2株,占比18.19%(2/11);紐波特沙門菌、阿邦尼沙門菌以及腸炎沙門菌各1株,占比9.10%(1/11)。

    2.5 藥物敏感性試驗由表4可知,分離菌株對6類藥物均表現出不同程度的耐藥,其中對β-內酰胺類藥物的耐藥率最高, 對AM、CAZ和CTX的耐藥率均為81.82%(9/11),對CFZ的耐藥率為72.73%(8/11);對喹諾酮類藥物敏感性較高,對NA、CIP的耐藥率均為18.18%(2/11)。林芝市分離的菌株耐藥情況與其他地區(qū)相比較為嚴重(圖5),分離菌株普遍存在多重耐藥現象,普遍對3種(L1、N1)及3種以上抗生素耐藥,個別菌株(Z2)對10種抗生素耐藥。

    表4 11株西藏牦牛源沙門菌對12種抗生素藥物敏感性試驗結果

    注:S.敏感;I.中介;R.耐藥圖5 11株西藏牦牛源沙門菌分離株藥物敏感性檢測結果

    2.6 耐藥基因檢測6類藥物相關耐藥基因的PCR檢測結果如表5顯示:3個地區(qū)分離的菌株均對喹諾酮類藥物不耐藥;拉薩市的3株分離菌和那曲市的5株分離菌均對其余5類藥物耐藥;林芝市的3株分離菌對其余4類藥物耐藥,對磺胺類藥物不耐藥。此外,四環(huán)素類耐藥基因tetA的檢出率高達90.91%;其次是β-內酰胺類耐藥基因blaTEM和氯霉素類耐藥基因floR,檢出率為81.82%;而喹諾酮類耐藥基因gyrA和gyrB均未檢出。

    表5 11株西藏牦牛源沙門菌耐藥基因PCR檢測結果

    2.7 構建系統(tǒng)發(fā)育樹對6株(每個地區(qū)2株不同血清型沙門菌)牦牛源沙門菌分離株的invA基因序列與GenBank登錄的核苷酸序列進行同源性比對分析并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果如圖7顯示,西藏牦牛源沙門菌與人源(CP054827.1、CP050728.1)、禽源(CP043563.1、CP051286)、豬源(CP053294.1)、羊源(CP034716.1)、牛源(CP025241.1)以及食物源(CP060507.1)沙門菌同源性為99%~100%;拉薩市分離株L2與那曲分離株N2在同一分支;林芝市分離株與其他分離株同屬另一分支;拉薩市分離株L1與食物源沙門菌(CP033255.2、CP033352.2)在同一分支;那曲市分離株N1和林芝市分離株Z2在同一分支,林芝市分離株Z1單獨屬于一個分支。

    注:L1,L2.拉薩市分離菌;Z1,Z2.林芝市分離菌;N1,N2.那曲市分離菌;標尺表示遺傳距離,指每個位點有0.000 5個氨基酸替換圖7 西藏牦牛源沙門菌invA基因序列進化樹

    3 討論

    本試驗對采集自西藏拉薩、那曲和林芝3個地區(qū)的腹瀉牦牛糞便進行了細菌的分離培養(yǎng),并對分離菌進行了染色鏡檢和生化試驗鑒定,結合特異性基因檢測結果確定獲得了沙門菌11株,分離率為12.08%(11/91)。同儲倩等[30]從四川甘孜、阿壩兩地牦牛糞便中分離沙門菌的分離率(8.17%)和柏雪等[31]從青藏高原部分地區(qū)牦牛糞便中分離沙門菌的分離率(9.23%)相比較高。其中,那曲市牦牛源沙門菌的分離率為19.23%(5/26),占總分離菌數的百分比為45.46%(5/11),遠高于其他兩地。那曲市與其他兩地相比,海拔更高,牦牛生長環(huán)境更惡劣;同時西藏牦牛養(yǎng)殖主要以放牧為主,導致病牛不能被及時發(fā)現,以至于攜帶病原的糞便易污染水源和食物,造成健康牛只感染。因此,建議定期檢查牛群腹瀉情況,適當更換放牧地點;定期清理牛舍,保持牛舍清潔干燥,定期消毒;同時一旦發(fā)現腹瀉及時醫(yī)治;做好疫病防控的同時,加強養(yǎng)殖環(huán)境的管理。

    本試驗分離到的西藏牦牛源沙門菌經血清型鑒定,分為都柏林沙門菌、丙型副傷寒沙門菌、傷寒沙門菌、紐波特沙門菌、阿邦尼沙門菌以及腸炎沙門菌6種。其中都柏林沙門菌、丙型副傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型,該結果與關龍伏等[32]、詹發(fā)茂等[33]和張斌等[34]對不同地區(qū)牦牛源沙門菌優(yōu)勢血清型的研究結果相似。牛作為都柏林沙門菌的天然宿主易被感染,易導致母牛流產,嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)的健康發(fā)展,該結果的發(fā)現應當引起重視[35]。丙型副傷寒沙門菌、傷寒沙門菌和腸炎沙門菌是引起人類腹瀉的主要血清型,同時孔雪英等[36]曾從牦牛肉中分離得到丙型副傷寒沙門菌,因此,相關血清型的公共衛(wèi)生學意義值得引起關注。此外,本次試驗中首次從牦牛源中分離出阿邦尼沙門菌。據文獻報道,阿邦尼沙門菌毒性較強,可引起類似于傷寒沙門菌病的相關癥狀[32,37-38],提醒我們需加強監(jiān)管。

    invA基因作為沙門菌的特異性鑒定基因,編碼沙門菌的入侵蛋白,該蛋白在沙門菌的致病性上起重要作用,invA基因在沙門菌不同種屬間具有高度同源性,與其他生物種屬的核苷酸序列無同源關系[23-24]。本試驗對6株牦牛源沙門菌(6種血清型各一株)與GenBank中已登錄的沙門菌進行對比,結果顯示:西藏牦牛源沙門菌與多種動物源(CP054827.1、CP050728.1、CP043563.1、CP053294.1、CP025241.1等)在同一分支上,說明其親緣性較近,提示我們不同血清型的沙門菌可感染不同的宿主,應加強食品衛(wèi)生管理,避免沙門菌通過食物感染人,從而引起食物中毒等疾病。

    對分離到的11株牦牛源沙門菌進行藥物敏感性試驗,結果顯示:分離菌株普遍具有較高的耐藥性。其中,對β-內酰胺類藥物(氨芐西林、頭孢唑林、頭孢噻肟)的耐藥率最高,為81.82%,該結果比劉玉英等[39]報道的36.17%高出許多,同時其相關耐藥基因blaTEM檢出率為81.82%;而對喹諾酮類藥物(萘啶酸和環(huán)丙沙星)的耐藥率為18.18%,相關耐藥基因gyrA和gyrB則未檢出。此外,對四環(huán)素的耐藥率為54.55%,該結果與柏雪等[31]發(fā)現的四環(huán)素藥物耐藥率為60%的結果相近,相關耐藥基因tetB檢出率為45.46%,與柏雪等[31]的研究結果相一致;耐藥基因tetA檢出率為90.91%,耐藥表型與耐藥基因檢出率略有差異,該結果與王華然等[40]發(fā)現的沙門菌四環(huán)素耐藥基因檢出率(80.99%)較為接近。本次試驗中耐藥率和耐藥基因檢測結果基本一致,說明西藏牦牛源耐藥表型與基因型逐漸趨于相同,且存在相關性;但部分結果的差異提示,具體耐藥機制還需深入研究。同時,本次實驗分離的耐藥菌株均表現出不用程度的多重耐藥,主要集中在3~9耐,其中以4耐為主,然后是2耐和6耐,分別占總菌株數的36.36%和18.18%。此次試驗結果說明西藏部分地區(qū)牦牛源沙門菌的耐藥情況較為普遍,單一菌對多種藥物的耐藥情況越來越嚴重,存在同時攜帶多種耐藥基因的情況,提醒我們急需改善臨床用藥的種類和抗生素使用方法。

    綜上,本研究發(fā)現沙門菌目前在西藏牦牛中存在一定的流行趨勢,且不同動物源沙門菌存在同源性,而單一菌株的對藥物的耐藥情況和耐藥基因攜帶情況也越來越嚴重,提示相關部門需重視沙門菌的防治,加強監(jiān)管;相關養(yǎng)殖戶需重視養(yǎng)殖環(huán)境,做好衛(wèi)生清潔;同時也應當注重臨床用藥,考慮采取多種藥物交叉使用,避免超級耐藥菌的出現。

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