• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    西藏牦牛源沙門菌的分離鑒定及耐藥分析

    2021-10-30 03:53:06李天嬌周賽賽斑馬澤郎盧姊豪尹力鴻呂家煌趙曉慧索朗斯珠西藏農牧學院動物科學學院西藏林芝860000江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所江蘇南京2008
    中國獸醫(yī)學報 2021年10期
    關鍵詞:林芝沙門血清型

    李天嬌,周賽賽,斑馬澤郎,吳 丹,盧姊豪,尹力鴻,2,呂家煌,2,趙曉慧,李 霞,索朗斯珠* (.西藏農牧學院 動物科學學院,西藏 林芝 860000;2.江蘇省農業(yè)科學院 獸醫(yī)研究所,江蘇 南京 2008)

    沙門菌(Salmonella)屬腸桿菌科沙門菌屬,為革蘭陰性短小桿菌。沙門菌血清型較多,國內常見血清型均具有一定致病性,可引發(fā)人畜共患病[1-2]。據國內外文獻報道[3-11],沙門菌在禽類、家畜、寵物和野生動物中均有發(fā)現,并引發(fā)相關疫?。灰渤T谑澄锛捌湓牧现写嬖?,引起人類食物中毒[12-14]。同時,沙門菌呈全球性分布,由沙門菌引起的疫情曾在世界多國大規(guī)模暴發(fā)[15]。動物感染沙門菌常引發(fā)腹瀉、腸炎、流產和敗血癥等疾病[16]。沙門菌的流行也嚴重威脅著牛群的健康:成牛感染沙門菌的臨床特征表現為水樣或血性腹瀉,常伴有發(fā)熱、食欲不振、精神沉郁等癥狀;犢牛感染沙門菌的死亡率遠高于成牛[17]。

    牦牛是生長于我國高海拔地區(qū)的獨特物種,也是西藏當地牧民的主要經濟來源之一,西藏更是我國牦牛的主產區(qū)之一[18]。沙門菌在牧區(qū)長期處于流行狀態(tài),主要通過糞口傳播,加之牧區(qū)牦牛的養(yǎng)殖模式主要以放牧為主,因此環(huán)境中的水源和食物極易被污染,從而使其他健康牛也被感染患病,甚至死亡,嚴重影響牦牛及其產業(yè)的健康發(fā)展[19]。目前,國內外關于牦牛源沙門菌的研究報道較少,有關西藏地區(qū)沙門菌的研究更少[20]。因此本研究從西藏部分地區(qū)腹瀉牦牛的糞便中分離沙門菌,并對其進行血清型分型、遺傳進化分析、耐藥表型和耐藥基因分析,為西藏牦牛源沙門菌的防治、后續(xù)相關研究以及臨床用藥提供科學的指導。

    1 材料與方法

    1.1 樣品本試驗共采集西藏腹瀉牦牛糞便91份,其中拉薩市44份、林芝市21份、那曲市26份,將采集的糞便樣品編號后置于-80℃保存。

    1.2 主要試劑BPW培養(yǎng)基、MRSV培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基購自美國BD上海有限公司;SS培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、TSI培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂及12種抗菌藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司;革蘭染色試劑盒購自青島海博生物技術有限公司;TR101沙門菌屬診斷血清試劑盒購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司;Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0)、DL2000 DNA Marker購自大連寶生物有限公司。

    1.3 細菌分離純化參照GB4789.4-2010[21]和LIU等[22]的方法對樣品中的細菌進行分離鑒定。利用BPW培養(yǎng)基對糞便樣品進行預增菌,在MRSV半固體培養(yǎng)基上對增菌液進行初篩,初篩后在SS瓊脂和BS瓊脂選擇性培養(yǎng)基上復篩,對篩選出的單菌落進行革蘭染色并鏡檢。

    1.4 生化試驗用純培養(yǎng)的菌液轉種TSI斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)12 h后觀察結果,判定標準見表1。

    表1 沙門菌生化試驗判定標準

    1.5 特異性基因鑒定通過PCR技術檢測分離菌株的特異性基因invA[23-24],利用引物序列:5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′;5′-TC-ATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′對分離菌株進行PCR鑒定,通過1.0%瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳分析。

    1.6 血清型檢測沙門菌的血清型鑒定嚴格按照寧波天潤生物藥業(yè)有限公司提供的TR101沙門菌屬血清診斷說明書操作,觀察凝集的情況,記錄結果。

    1.7 藥敏試驗參照世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)推薦的K-B法進行該試驗[36]。將純培養(yǎng)菌液均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂上,將12種藥敏片貼于平皿中央,于37℃倒置培養(yǎng)24 h。參照NCCLS(2013)公布的標準,根據抑菌圈大小,對結果做出判定,藥敏結果判定標準見表2。

    表2 藥敏結果判定標準

    1.8 耐藥基因檢測參考文獻[26-29],選擇與6類抗生素相關的15種耐藥基因進行PCR擴增,引物序列見表3。

    表3 沙門菌耐藥基因擴增引物及相關信息

    1.9 構建系統(tǒng)發(fā)育樹對分離菌株的invA基因進行PCR檢測后,回收特異性擴增片段,將之克隆至pMD18-T載體并進行測序。用NCBI網站在線BLAST程序對測序結果進行比對;利用MEAG 7.0軟件,選取部分在GenBank已登錄的序列進行比對并構建遺傳進化樹。

    2 結果

    2.1 細菌培養(yǎng)分離菌株在BS培養(yǎng)基上形成表面光滑、有金屬光澤的黑色單菌落,同時也會形成另一種灰綠色菌落;在SS培養(yǎng)基上形成中心有黑點的無色單菌落;革蘭染色的鏡檢結果顯示其為革蘭陰性短小桿菌(圖1)。

    圖1 西藏牦牛源分離菌株革蘭染色鏡檢結果(1 000×)

    2.2 生化鑒定11株分離菌株均能與三糖鐵反應產生H2S,并生成黑色沉淀,能產氣、產酸且具有動力,結果見圖2。

    圖2 西藏牦牛源分離菌株生化試驗結果

    2.3 特異性基因鑒定對分離菌株invA基因進行PCR擴增,產物條帶大小約280 bp,與目的條帶大小一致,確定分離獲得11株沙門菌,鑒定結果見圖3,總檢出率為12.08%(11/91),其中拉薩市3株、那曲市5株、林芝市3株,沙門菌地理位置占比見圖4。

    M.DL2000 DNA Marker;+.陽性對照;-.陰性對照;L1~L2.拉薩市樣品;Z1~Z2.林芝市樣品;N1~N2.那曲市樣品圖3 牦牛源沙門菌invA基因PCR擴增結果

    圖4 11株牦牛源沙門菌地理位置分布及占比

    2.4 血清型鑒定血清型分型鑒定結果顯示:都柏林沙門菌3株,占比27.18%(3/11);丙型副傷寒沙門菌3株,占比27.28%(3/11);傷寒沙門菌2株,占比18.19%(2/11);紐波特沙門菌、阿邦尼沙門菌以及腸炎沙門菌各1株,占比9.10%(1/11)。

    2.5 藥物敏感性試驗由表4可知,分離菌株對6類藥物均表現出不同程度的耐藥,其中對β-內酰胺類藥物的耐藥率最高, 對AM、CAZ和CTX的耐藥率均為81.82%(9/11),對CFZ的耐藥率為72.73%(8/11);對喹諾酮類藥物敏感性較高,對NA、CIP的耐藥率均為18.18%(2/11)。林芝市分離的菌株耐藥情況與其他地區(qū)相比較為嚴重(圖5),分離菌株普遍存在多重耐藥現象,普遍對3種(L1、N1)及3種以上抗生素耐藥,個別菌株(Z2)對10種抗生素耐藥。

    表4 11株西藏牦牛源沙門菌對12種抗生素藥物敏感性試驗結果

    注:S.敏感;I.中介;R.耐藥圖5 11株西藏牦牛源沙門菌分離株藥物敏感性檢測結果

    2.6 耐藥基因檢測6類藥物相關耐藥基因的PCR檢測結果如表5顯示:3個地區(qū)分離的菌株均對喹諾酮類藥物不耐藥;拉薩市的3株分離菌和那曲市的5株分離菌均對其余5類藥物耐藥;林芝市的3株分離菌對其余4類藥物耐藥,對磺胺類藥物不耐藥。此外,四環(huán)素類耐藥基因tetA的檢出率高達90.91%;其次是β-內酰胺類耐藥基因blaTEM和氯霉素類耐藥基因floR,檢出率為81.82%;而喹諾酮類耐藥基因gyrA和gyrB均未檢出。

    表5 11株西藏牦牛源沙門菌耐藥基因PCR檢測結果

    2.7 構建系統(tǒng)發(fā)育樹對6株(每個地區(qū)2株不同血清型沙門菌)牦牛源沙門菌分離株的invA基因序列與GenBank登錄的核苷酸序列進行同源性比對分析并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果如圖7顯示,西藏牦牛源沙門菌與人源(CP054827.1、CP050728.1)、禽源(CP043563.1、CP051286)、豬源(CP053294.1)、羊源(CP034716.1)、牛源(CP025241.1)以及食物源(CP060507.1)沙門菌同源性為99%~100%;拉薩市分離株L2與那曲分離株N2在同一分支;林芝市分離株與其他分離株同屬另一分支;拉薩市分離株L1與食物源沙門菌(CP033255.2、CP033352.2)在同一分支;那曲市分離株N1和林芝市分離株Z2在同一分支,林芝市分離株Z1單獨屬于一個分支。

    注:L1,L2.拉薩市分離菌;Z1,Z2.林芝市分離菌;N1,N2.那曲市分離菌;標尺表示遺傳距離,指每個位點有0.000 5個氨基酸替換圖7 西藏牦牛源沙門菌invA基因序列進化樹

    3 討論

    本試驗對采集自西藏拉薩、那曲和林芝3個地區(qū)的腹瀉牦牛糞便進行了細菌的分離培養(yǎng),并對分離菌進行了染色鏡檢和生化試驗鑒定,結合特異性基因檢測結果確定獲得了沙門菌11株,分離率為12.08%(11/91)。同儲倩等[30]從四川甘孜、阿壩兩地牦牛糞便中分離沙門菌的分離率(8.17%)和柏雪等[31]從青藏高原部分地區(qū)牦牛糞便中分離沙門菌的分離率(9.23%)相比較高。其中,那曲市牦牛源沙門菌的分離率為19.23%(5/26),占總分離菌數的百分比為45.46%(5/11),遠高于其他兩地。那曲市與其他兩地相比,海拔更高,牦牛生長環(huán)境更惡劣;同時西藏牦牛養(yǎng)殖主要以放牧為主,導致病牛不能被及時發(fā)現,以至于攜帶病原的糞便易污染水源和食物,造成健康牛只感染。因此,建議定期檢查牛群腹瀉情況,適當更換放牧地點;定期清理牛舍,保持牛舍清潔干燥,定期消毒;同時一旦發(fā)現腹瀉及時醫(yī)治;做好疫病防控的同時,加強養(yǎng)殖環(huán)境的管理。

    本試驗分離到的西藏牦牛源沙門菌經血清型鑒定,分為都柏林沙門菌、丙型副傷寒沙門菌、傷寒沙門菌、紐波特沙門菌、阿邦尼沙門菌以及腸炎沙門菌6種。其中都柏林沙門菌、丙型副傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型,該結果與關龍伏等[32]、詹發(fā)茂等[33]和張斌等[34]對不同地區(qū)牦牛源沙門菌優(yōu)勢血清型的研究結果相似。牛作為都柏林沙門菌的天然宿主易被感染,易導致母牛流產,嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)的健康發(fā)展,該結果的發(fā)現應當引起重視[35]。丙型副傷寒沙門菌、傷寒沙門菌和腸炎沙門菌是引起人類腹瀉的主要血清型,同時孔雪英等[36]曾從牦牛肉中分離得到丙型副傷寒沙門菌,因此,相關血清型的公共衛(wèi)生學意義值得引起關注。此外,本次試驗中首次從牦牛源中分離出阿邦尼沙門菌。據文獻報道,阿邦尼沙門菌毒性較強,可引起類似于傷寒沙門菌病的相關癥狀[32,37-38],提醒我們需加強監(jiān)管。

    invA基因作為沙門菌的特異性鑒定基因,編碼沙門菌的入侵蛋白,該蛋白在沙門菌的致病性上起重要作用,invA基因在沙門菌不同種屬間具有高度同源性,與其他生物種屬的核苷酸序列無同源關系[23-24]。本試驗對6株牦牛源沙門菌(6種血清型各一株)與GenBank中已登錄的沙門菌進行對比,結果顯示:西藏牦牛源沙門菌與多種動物源(CP054827.1、CP050728.1、CP043563.1、CP053294.1、CP025241.1等)在同一分支上,說明其親緣性較近,提示我們不同血清型的沙門菌可感染不同的宿主,應加強食品衛(wèi)生管理,避免沙門菌通過食物感染人,從而引起食物中毒等疾病。

    對分離到的11株牦牛源沙門菌進行藥物敏感性試驗,結果顯示:分離菌株普遍具有較高的耐藥性。其中,對β-內酰胺類藥物(氨芐西林、頭孢唑林、頭孢噻肟)的耐藥率最高,為81.82%,該結果比劉玉英等[39]報道的36.17%高出許多,同時其相關耐藥基因blaTEM檢出率為81.82%;而對喹諾酮類藥物(萘啶酸和環(huán)丙沙星)的耐藥率為18.18%,相關耐藥基因gyrA和gyrB則未檢出。此外,對四環(huán)素的耐藥率為54.55%,該結果與柏雪等[31]發(fā)現的四環(huán)素藥物耐藥率為60%的結果相近,相關耐藥基因tetB檢出率為45.46%,與柏雪等[31]的研究結果相一致;耐藥基因tetA檢出率為90.91%,耐藥表型與耐藥基因檢出率略有差異,該結果與王華然等[40]發(fā)現的沙門菌四環(huán)素耐藥基因檢出率(80.99%)較為接近。本次試驗中耐藥率和耐藥基因檢測結果基本一致,說明西藏牦牛源耐藥表型與基因型逐漸趨于相同,且存在相關性;但部分結果的差異提示,具體耐藥機制還需深入研究。同時,本次實驗分離的耐藥菌株均表現出不用程度的多重耐藥,主要集中在3~9耐,其中以4耐為主,然后是2耐和6耐,分別占總菌株數的36.36%和18.18%。此次試驗結果說明西藏部分地區(qū)牦牛源沙門菌的耐藥情況較為普遍,單一菌對多種藥物的耐藥情況越來越嚴重,存在同時攜帶多種耐藥基因的情況,提醒我們急需改善臨床用藥的種類和抗生素使用方法。

    綜上,本研究發(fā)現沙門菌目前在西藏牦牛中存在一定的流行趨勢,且不同動物源沙門菌存在同源性,而單一菌株的對藥物的耐藥情況和耐藥基因攜帶情況也越來越嚴重,提示相關部門需重視沙門菌的防治,加強監(jiān)管;相關養(yǎng)殖戶需重視養(yǎng)殖環(huán)境,做好衛(wèi)生清潔;同時也應當注重臨床用藥,考慮采取多種藥物交叉使用,避免超級耐藥菌的出現。

    猜你喜歡
    林芝沙門血清型
    一株雞白痢沙門菌噬菌體的發(fā)酵及后處理工藝研究
    中國飼料(2022年5期)2022-04-26 13:42:36
    沙門菌噬菌體溶菌酶LysSHWT1的制備及抑菌活性分析
    林芝市雷電風險區(qū)劃
    2013-2017年北京市順義區(qū)腹瀉病例中沙門菌流行特征
    林芝桃花香
    A new species of the genus Amolops (Amphibia: Ranidae) from southeastern Tibet, China
    通遼地區(qū)牛肉與牛肉制品沙門氏菌血清型調查
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:36:44
    廣東地區(qū)水禽大腸桿菌血清型鑒定
    肺炎鏈球菌血清型鑒定的分子生物學檢測方法
    西藏的江南
    ——林芝
    地理教學(2014年7期)2014-01-13 07:40:14
    极品教师在线视频| av在线老鸭窝| 国产精品一区二区在线观看99 | 夫妻午夜视频| 国产有黄有色有爽视频| av免费观看日本| 麻豆国产97在线/欧美| 毛片一级片免费看久久久久| 午夜激情福利司机影院| 国产探花在线观看一区二区| 国内精品一区二区在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 国产毛片a区久久久久| 国内精品一区二区在线观看| 精品酒店卫生间| 久久鲁丝午夜福利片| 久久久久久久久久成人| 欧美潮喷喷水| 欧美潮喷喷水| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩国内少妇激情av| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 日日干狠狠操夜夜爽| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久久精品免费免费高清| av在线老鸭窝| 成人综合一区亚洲| 亚洲人成网站高清观看| 老女人水多毛片| 直男gayav资源| 嘟嘟电影网在线观看| 免费看日本二区| 精品久久久久久成人av| 高清毛片免费看| 嘟嘟电影网在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲精品456在线播放app| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产在线男女| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲综合精品二区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久久久久久久久久免费av| 国产不卡一卡二| 一级毛片久久久久久久久女| 国产v大片淫在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| ponron亚洲| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产伦精品一区二区三区四那| 大话2 男鬼变身卡| 777米奇影视久久| 亚洲欧美清纯卡通| 国产淫语在线视频| 我的老师免费观看完整版| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 日韩视频在线欧美| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 舔av片在线| 久久精品夜色国产| 国产伦在线观看视频一区| 国产极品天堂在线| 日本免费a在线| 99热6这里只有精品| 欧美潮喷喷水| 人人妻人人澡欧美一区二区| 91在线精品国自产拍蜜月| 嘟嘟电影网在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲真实伦在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 三级国产精品片| 看黄色毛片网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲在线自拍视频| 免费观看av网站的网址| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 青春草视频在线免费观看| 免费观看在线日韩| 久久久久久国产a免费观看| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日日啪夜夜撸| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 国产大屁股一区二区在线视频| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲精品一二三| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费av观看视频| 国产精品99久久久久久久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品无大码| 国产精品国产三级国产av玫瑰| av在线天堂中文字幕| 免费看美女性在线毛片视频| 一本一本综合久久| 国产乱来视频区| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品一区www在线观看| 免费在线观看成人毛片| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 欧美bdsm另类| 国产三级在线视频| eeuss影院久久| 国产精品久久久久久精品电影| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久久久久久久久成人| 国产男女超爽视频在线观看| 两个人的视频大全免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人免费观看mmmm| 黑人高潮一二区| 99九九线精品视频在线观看视频| 乱系列少妇在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 白带黄色成豆腐渣| 男人舔奶头视频| 国产 一区精品| 婷婷六月久久综合丁香| 精品国产三级普通话版| 久久久精品94久久精品| 91久久精品国产一区二区成人| 国内精品宾馆在线| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久久免费精品人妻一区二区| 高清午夜精品一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 最新中文字幕久久久久| 国产精品三级大全| 国产黄色小视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久韩国三级中文字幕| 精品欧美国产一区二区三| 国产单亲对白刺激| 一级爰片在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 免费av不卡在线播放| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲自拍偷在线| 精品久久久久久电影网| 男女国产视频网站| 国产黄片视频在线免费观看| 成人av在线播放网站| 免费看av在线观看网站| av黄色大香蕉| 国产在线男女| 波野结衣二区三区在线| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲欧美一区二区三区国产| 三级国产精品片| 国产大屁股一区二区在线视频| av在线亚洲专区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲最大成人手机在线| 麻豆成人av视频| 亚洲国产av新网站| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 免费在线观看成人毛片| 又爽又黄a免费视频| 日韩视频在线欧美| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产一级毛片七仙女欲春2| eeuss影院久久| 成人特级av手机在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 一个人看视频在线观看www免费| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品久久久久久电影网| 亚洲国产最新在线播放| 99久国产av精品| 日韩国内少妇激情av| 久久国产乱子免费精品| 亚洲精品色激情综合| 亚洲av免费在线观看| 国产精品一及| 精品人妻视频免费看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产一区亚洲一区在线观看| 有码 亚洲区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日本av手机在线免费观看| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲va在线va天堂va国产| 乱系列少妇在线播放| 久久精品久久久久久久性| 女人被狂操c到高潮| 亚洲图色成人| 国产探花在线观看一区二区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 一个人看的www免费观看视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日本黄大片高清| 蜜臀久久99精品久久宅男| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲自偷自拍三级| 国产精品精品国产色婷婷| 在线观看免费高清a一片| 99久久精品国产国产毛片| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 看黄色毛片网站| 欧美日本视频| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩电影二区| 国产亚洲精品av在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产亚洲5aaaaa淫片| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 我要看日韩黄色一级片| 丝袜美腿在线中文| 2021少妇久久久久久久久久久| 少妇人妻精品综合一区二区| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲在线观看片| 国产精品99久久久久久久久| 99久久九九国产精品国产免费| 波野结衣二区三区在线| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 成人亚洲欧美一区二区av| av.在线天堂| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲怡红院男人天堂| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 熟女人妻精品中文字幕| 精品久久久久久成人av| 99久久精品一区二区三区| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲精品色激情综合| 国国产精品蜜臀av免费| 天天躁日日操中文字幕| 国产麻豆成人av免费视频| av线在线观看网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 身体一侧抽搐| 日本色播在线视频| 亚洲精品色激情综合| 亚洲av中文av极速乱| 最新中文字幕久久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久精品性色| 中文字幕制服av| 日韩欧美一区视频在线观看 | a级一级毛片免费在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 69av精品久久久久久| 国产中年淑女户外野战色| 在线观看人妻少妇| 久久久久久久久久成人| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 婷婷六月久久综合丁香| 激情五月婷婷亚洲| av国产久精品久网站免费入址| 水蜜桃什么品种好| 99久久人妻综合| 成人美女网站在线观看视频| 久久久久久久久久成人| 永久免费av网站大全| 久久久久精品久久久久真实原创| 成人特级av手机在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日韩一区二区三区影片| av在线老鸭窝| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 美女国产视频在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 日本一二三区视频观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 色网站视频免费| 精品人妻视频免费看| 国产成人精品婷婷| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 97精品久久久久久久久久精品| 免费黄频网站在线观看国产| 一个人看视频在线观看www免费| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 91久久精品国产一区二区三区| 久99久视频精品免费| 亚洲欧美成人精品一区二区| 91av网一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 黄色欧美视频在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 免费观看性生交大片5| 日日啪夜夜爽| 国产高潮美女av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 极品教师在线视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 七月丁香在线播放| 午夜免费激情av| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 老司机影院毛片| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲国产最新在线播放| 天堂影院成人在线观看| 亚洲电影在线观看av| 色吧在线观看| 丝袜美腿在线中文| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产伦理片在线播放av一区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 中文欧美无线码| 欧美另类一区| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲天堂国产精品一区在线| 99久久九九国产精品国产免费| 街头女战士在线观看网站| 91久久精品国产一区二区三区| av女优亚洲男人天堂| 日韩欧美国产在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| 午夜亚洲福利在线播放| 国产乱来视频区| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲av日韩在线播放| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产高潮美女av| 欧美精品国产亚洲| 性色avwww在线观看| 日本三级黄在线观看| 黄色配什么色好看| 久久99精品国语久久久| 久久久精品94久久精品| 在线 av 中文字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲精品第二区| 看黄色毛片网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 在线免费十八禁| 青春草视频在线免费观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 99久久人妻综合| 1000部很黄的大片| 搡老乐熟女国产| 亚洲av不卡在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品久久久久久av不卡| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品久久久久久久久久久久久| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩在线高清观看一区二区三区| 黄片无遮挡物在线观看| 国精品久久久久久国模美| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 亚洲最大成人手机在线| 中文字幕久久专区| 亚洲精品视频女| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲精品一区蜜桃| 日本免费在线观看一区| 亚洲内射少妇av| 久久久久性生活片| 国产精品99久久久久久久久| 在线观看一区二区三区| 欧美zozozo另类| 亚洲天堂国产精品一区在线| 午夜福利网站1000一区二区三区| 男女国产视频网站| 嘟嘟电影网在线观看| .国产精品久久| 亚洲av成人av| 欧美3d第一页| 免费观看在线日韩| av在线播放精品| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲精品色激情综合| 色视频www国产| 黄色配什么色好看| 亚洲伊人久久精品综合| 大片免费播放器 马上看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产成人精品久久久久久| 久久久久久久午夜电影| 久久精品久久久久久久性| 亚洲最大成人中文| 国产精品无大码| 国精品久久久久久国模美| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日本-黄色视频高清免费观看| 男女边吃奶边做爰视频| 国产亚洲一区二区精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 草草在线视频免费看| 毛片女人毛片| 人人妻人人看人人澡| av免费观看日本| 一区二区三区乱码不卡18| 国产淫语在线视频| 国产三级在线视频| 在线观看免费高清a一片| 老女人水多毛片| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 日本免费a在线| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产伦理片在线播放av一区| 26uuu在线亚洲综合色| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产探花在线观看一区二区| 免费看a级黄色片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 老女人水多毛片| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 校园人妻丝袜中文字幕| 九九爱精品视频在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 丰满少妇做爰视频| 伦精品一区二区三区| 一级a做视频免费观看| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲经典国产精华液单| 国产黄片视频在线免费观看| 免费观看精品视频网站| 日日撸夜夜添| 亚洲成人一二三区av| 婷婷色麻豆天堂久久| 日韩欧美精品免费久久| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 伊人久久国产一区二区| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产麻豆成人av免费视频| 1000部很黄的大片| 美女内射精品一级片tv| 亚洲一区高清亚洲精品| 99久久九九国产精品国产免费| 男女国产视频网站| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久久久久大av| 亚洲国产精品国产精品| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 我的老师免费观看完整版| 午夜精品在线福利| 久久久久国产网址| 日本免费a在线| 成人美女网站在线观看视频| 欧美日韩在线观看h| 三级国产精品片| 1000部很黄的大片| 观看美女的网站| 日韩视频在线欧美| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品一区蜜桃| 日韩制服骚丝袜av| 欧美丝袜亚洲另类| 看免费成人av毛片| 有码 亚洲区| 精品久久久噜噜| 2018国产大陆天天弄谢| 观看免费一级毛片| 97超视频在线观看视频| 国模一区二区三区四区视频| 成人亚洲精品一区在线观看 | 91久久精品国产一区二区三区| 日韩视频在线欧美| 亚洲熟女精品中文字幕| 老司机影院成人| 三级国产精品欧美在线观看| videossex国产| 波野结衣二区三区在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 九草在线视频观看| 视频中文字幕在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产成人freesex在线| 听说在线观看完整版免费高清| av在线亚洲专区| 乱人视频在线观看| 欧美+日韩+精品| or卡值多少钱| 中文资源天堂在线| 青春草亚洲视频在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲真实伦在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 成年女人看的毛片在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 美女被艹到高潮喷水动态| 99久久精品热视频| 高清毛片免费看| 日本与韩国留学比较| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲经典国产精华液单| 天美传媒精品一区二区| 日本熟妇午夜| 日韩av免费高清视频| 国产一区有黄有色的免费视频 | 又大又黄又爽视频免费| 18禁动态无遮挡网站| 久久久亚洲精品成人影院| 国产黄色视频一区二区在线观看| 欧美区成人在线视频| 观看美女的网站| 99re6热这里在线精品视频| 舔av片在线| 91狼人影院| 久久久精品94久久精品| 看黄色毛片网站| 国产黄a三级三级三级人| 成人欧美大片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品国内亚洲2022精品成人| 高清日韩中文字幕在线| 国产高清三级在线| 99久久精品热视频| 国产单亲对白刺激| 国产极品天堂在线| 国产亚洲一区二区精品| 男人舔奶头视频| 一级黄片播放器| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 好男人视频免费观看在线| 欧美区成人在线视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 大话2 男鬼变身卡| 最近的中文字幕免费完整| 日本wwww免费看| 18+在线观看网站| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩欧美 国产精品| 国产中年淑女户外野战色| 日日撸夜夜添| 欧美激情国产日韩精品一区| 国模一区二区三区四区视频| 国产黄频视频在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品精品国产色婷婷| 免费观看在线日韩| 秋霞在线观看毛片| 亚洲精品乱久久久久久| 天天一区二区日本电影三级| 国产在视频线精品| 日本色播在线视频| 伊人久久国产一区二区| 97在线视频观看| 欧美最新免费一区二区三区| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲美女视频黄频| 中文资源天堂在线| 一区二区三区四区激情视频| 中文字幕av成人在线电影| 天堂俺去俺来也www色官网 | 亚洲精品第二区| 七月丁香在线播放| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美成人a在线观看| 久久99精品国语久久久| 亚洲在线自拍视频| 激情 狠狠 欧美| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 午夜激情福利司机影院| 国产成人免费观看mmmm| 不卡视频在线观看欧美| 午夜老司机福利剧场| 91aial.com中文字幕在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲最大成人av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲欧美一区二区三区国产| av免费在线看不卡| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日本一二三区视频观看| 欧美bdsm另类| 中文字幕久久专区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 国产单亲对白刺激| 国产精品日韩av在线免费观看| av天堂中文字幕网| 午夜激情欧美在线| 日韩三级伦理在线观看| 国产精品.久久久| 好男人在线观看高清免费视频| 日本wwww免费看| 国产精品99久久久久久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 日韩伦理黄色片|