雪膽多糖絮凝純化工藝優(yōu)化及其對(duì)橄欖油乳化性研究

梁笑茹，盧迎春，段柯兆，張廣輝，楊生超，趙艷

中藥研究與開發(fā)

雪膽多糖絮凝純化工藝優(yōu)化及其對(duì)橄欖油乳化性研究

梁笑茹1，盧迎春1，段柯兆2，張廣輝1，楊生超1，趙艷1，3

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.云南柯兆生物科技有限公司，云南 昆明 650200；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201

采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化殼聚糖絮凝純化雪膽多糖工藝，并探討雪膽多糖對(duì)橄欖油的乳化穩(wěn)定性。結(jié)合單因素試驗(yàn)，以絮凝時(shí)間、殼聚糖濃度和絮凝溫度為考察因素，以雪膽多糖保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化絮凝工藝。分析雪膽多糖濃度、溫度、金屬離子類型及金屬離子濃度對(duì)橄欖油乳化性的影響。最佳絮凝工藝為：絮凝時(shí)間60 min，殼聚糖濃度1.0 mg/mL，絮凝溫度35 ℃。在此條件下，雪膽多糖保留率為82.60%±1.21%。雪膽多糖對(duì)橄欖油乳化性有顯著影響，當(dāng)多糖濃度為15%時(shí)穩(wěn)定性最佳，65 ℃為最佳乳化溫度，乳化液在0.025 mol/L硫酸鉀溶液中乳化穩(wěn)定性最好。本研究正交設(shè)計(jì)優(yōu)化的雪膽多糖絮凝純化工藝穩(wěn)定可靠，雪膽多糖具有良好的橄欖油乳化穩(wěn)定性。

多糖；雪膽；殼聚糖；絮凝工藝；橄欖油；乳化穩(wěn)定性

雪膽Cogn.為葫蘆科雪膽屬植物，主要生長(zhǎng)在我國(guó)熱帶及亞熱帶地區(qū)，主產(chǎn)于云南、四川、貴州等地[1]。雪膽富含雪膽甲素、雪膽乙素等葫蘆烷型四環(huán)三萜化合物[2-5]，雪膽皂苷A、雪膽皂苷B等20余種齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物[6]，這些三萜類化合物具有抗腫瘤[7]、抗HIV[8]活性，藥用價(jià)值較高。

由于多糖和蛋白質(zhì)均為親水性分子，去除蛋白質(zhì)會(huì)伴隨多糖的損失[9]。目前常用的多糖脫蛋白方法有Sevage法[10-11]、酶法[12-13]和三氯乙酸法[14-15]等，但除雜純化效果有一定差異。在簡(jiǎn)單固液兩相分離的方法中，絮凝沉淀法可以較好地去除雜質(zhì)并保留有效成分[16-17]。絮凝法常用的天然陽離子型絮凝劑殼聚糖具有吸附雜質(zhì)和電中和作用，在中藥制藥[18-20]、食品生產(chǎn)[21-23]等領(lǐng)域應(yīng)用較廣。潘美云等[24]采用響應(yīng)面法優(yōu)化丹參飲水提液殼聚糖絮凝工藝，結(jié)果表明該方法能有效絮凝并沉降提取液中的膠體和蛋白質(zhì)等微粒。張建偉等[25]優(yōu)化殼聚糖絮凝純化白芍工藝，結(jié)果表明殼聚糖能有效去除白芍中的雜質(zhì)成分而有效成分損失少。滿寧等[26]利用微波提取灰樹花子實(shí)體中的多糖并以殼聚糖為絮凝劑進(jìn)行純化，與醇沉法相比，絮凝法操作時(shí)間大大縮短且多糖純度高。

另外，由于多糖是良好的增稠保水劑，來源于植物的水溶性多糖具有高黏度和強(qiáng)吸水性的特點(diǎn)，可以作為天然乳化劑代替合成表面活性劑，應(yīng)用于乳化領(lǐng)域。研究表明，山藥多糖具有乳化性，當(dāng)濃度較低時(shí)就可達(dá)到有效的乳化性能[27]。石莼多糖能提高β-胡蘿卜素的生物利用度，與阿拉伯膠相比，具有更高的脂質(zhì)消化率[28]。張?jiān)铺靃29]研究發(fā)現(xiàn)，青磚茶多糖是一個(gè)良好的天然乳化劑，能夠降低界面張力，具有良好的乳化活性，并能穩(wěn)定乳液儲(chǔ)藏。雪膽多糖的絮凝純化工藝及乳化穩(wěn)定性研究尚未見報(bào)道。本研究以雪膽塊莖為研究材料，結(jié)合單因素試驗(yàn)，通過3因素4水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化雪膽多糖的絮凝純化工藝，并探討雪膽多糖的橄欖油乳化穩(wěn)定性，為雪膽多糖的開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

722N可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），電子天平（Sarrorius公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠），數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

雪膽采自云南柯兆生物科技有限公司的雪膽種植基地，經(jīng)云南民族大學(xué)楊青松副教授鑒定為葫蘆科雪膽屬植物雪膽Cogn.。雪膽塊莖粉碎后過100目篩，置于密封干燥器中，備用。葡萄糖、磷酸二氫鉀、殼聚糖、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸鈉、硫酸鋁、硫酸鎂、硫酸鉀均為分析純（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），氯仿、無水乙醇、正丁醇、濃硫酸、苯酚、冰醋酸均為分析純（重慶川東化工有限公司），橄欖油為分析純（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 雪膽多糖提取液制備及含量測(cè)定

稱取雪膽塊莖粉末5 g，按樣品與水1∶16的料液比，80 ℃水浴加熱2 h，重復(fù)提取3次，離心，取上清液，合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，80 ℃水浴濃縮至原溶液的1/4左右，加無水乙醇混勻后于4 ℃冰箱靜置12 h，將醇沉提取液取出，2500 r/min離心3 min，保留沉淀物質(zhì)。

準(zhǔn)確稱取0.10 g干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品，加蒸餾水制成0.20 mg/mL對(duì)照品溶液。吸取對(duì)照品溶液，分別稀釋為0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL溶液。吸取上述溶液1 mL，加5%苯酚溶液1 mL，再加濃硫酸8 mL，搖勻，40 ℃水浴保溫30 min，室溫冷卻，以加蒸餾水的空白溶液作對(duì)照，于波長(zhǎng)486 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程＝8.072＋0.012 6（2＝0.999 7），線性關(guān)系良好。

2.2 雪膽多糖絮凝工藝優(yōu)化

2.2.1 絮凝劑制備

稱取1 g殼聚糖，加入1%冰醋酸溶液100 mL，混勻溶脹后得到1%殼聚糖溶液。

2.2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.2.1 絮凝時(shí)間

在雪膽多糖提取液中加入1.5 mg/mL殼聚糖溶液，于35 ℃分別處理20、40、60、80、100 min，在波長(zhǎng)486 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度3次，考察絮凝時(shí)間對(duì)雪膽多糖保留率的影響。保留率（%）＝（絮凝前多糖含量－絮凝后多糖含量）÷絮凝前多糖含量×100%。結(jié)果表明，隨絮凝時(shí)間延長(zhǎng)，雪膽多糖保留率呈先升高后趨于平緩再急劇下降的趨勢(shì)，最大保留率出現(xiàn)在60～80 min，見圖1。絮凝20 min時(shí)，殼聚糖與提取液作用時(shí)間過短，此時(shí)蛋白質(zhì)去除效果較弱；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，多糖保留率提高，效果較好；絮凝時(shí)間超過80 min，部分絮凝沉淀物開始溶解，導(dǎo)致保留率降低。因此，選擇絮凝時(shí)間為60～80 min。

2.2.2.2 殼聚糖濃度

在雪膽多糖提取液中分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL殼聚糖溶液，35 ℃絮凝處理60 min，于波長(zhǎng)486 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度3次，考察不同殼聚糖濃度對(duì)雪膽多糖保留率的影響。結(jié)果表明，雪膽多糖保留率隨殼聚糖濃度升高呈下降趨勢(shì)，見圖2。當(dāng)殼聚糖濃度為0.5～1.5 mg/mL時(shí)多糖保留率下降程度較大，殼聚糖濃度為1.5～2.5 mg/mL時(shí)多糖保留率下降趨勢(shì)較為平緩。可能由于殼聚糖濃度增高，導(dǎo)致多糖溶液膠體顆粒表面吸附大量高分子物質(zhì)而產(chǎn)生空間保護(hù)層，使絮凝效果減弱。因此，絮凝時(shí)選擇殼聚糖濃度為1.5 mg/mL。

圖1 不同絮凝時(shí)間的雪膽多糖保留率

圖2 不同殼聚糖濃度的雪膽多糖保留率

2.2.2.3 絮凝溫度

在雪膽多糖提取液中加入1.5 mg/mL殼聚糖溶液，分別于35、45、55、65、75 ℃絮凝處理60 min，于波長(zhǎng)486 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度3次，考察不同絮凝溫度對(duì)雪膽多糖保留率的影響。結(jié)果表明，在35～75 ℃范圍內(nèi)雪膽多糖保留率呈下降趨勢(shì)，見圖3?？赡茈S著溫度升高，提取液中分子運(yùn)動(dòng)加快，增加了殼聚糖與溶液中雜質(zhì)的接觸，使吸附性顯著提高，導(dǎo)致部分多糖絮凝沉淀，故絮凝時(shí)不宜選擇較高溫度。

2.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇絮凝時(shí)間、殼聚糖濃度、絮凝溫度為考察因素，每個(gè)因素選取4個(gè)水平，以雪膽多糖保留率為考察指標(biāo)，采用L16（43）正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化絮凝工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

圖3 不同絮凝溫度的雪膽多糖保留率

表1 雪膽多糖絮凝工藝正交試驗(yàn)因素與水平

表2 雪膽多糖絮凝工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 雪膽多糖絮凝工藝正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

根據(jù)表2、表3分析可知，各因素對(duì)雪膽多糖保留率的影響為絮凝時(shí)間（A）＞殼聚糖濃度（B）＞絮凝溫度（C），其中，絮凝時(shí)間有顯著影響（＜0.01），殼聚糖濃度和絮凝溫度無顯著影響（＞0.05）。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果得到理論優(yōu)化方案為A2B2C1，即絮凝時(shí)間60 min、殼聚糖濃度1.0 mg/mL、溫度35 ℃。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

選擇最優(yōu)工藝條件平行進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明，雪膽多糖保留率為82.60%±1.21%，與正交試驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果82.98%±1.16%相差較小，表明該絮凝工藝具有穩(wěn)定性和可行性。

2.4 雪膽多糖提取液對(duì)橄欖油乳化性的影響

2.4.1 雪膽多糖濃度

取雪膽多糖，分別配制為5%、10%、15%、20%、25%溶液。取不同濃度雪膽多糖溶液3 mL，分別加入1 mL橄欖油，用勻質(zhì)器混勻。用移液槍取200 μL上述不同濃度乳狀溶液于試管中，分別加入1%SDS溶液10 mL，搖勻，于波長(zhǎng)486 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度（A0）3次，剩余乳濁液靜置10 min后再取200 μL，加入1%SDS溶液10 mL，于波長(zhǎng)486 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度（A1）3次，計(jì)算乳化穩(wěn)定性（ESI）。ESI＝[A0／（A0－A1）]×t，式中t為靜置時(shí)間，即10 min。結(jié)果表明，多糖濃度為5%～15%時(shí)，雪膽多糖橄欖油乳化穩(wěn)定性呈上升趨勢(shì)，當(dāng)多糖濃度為15%時(shí)乳化穩(wěn)定性最大，隨多糖濃度升高，其橄欖油乳化穩(wěn)定性呈降低趨勢(shì)，見圖4。乳化液穩(wěn)定的主要原因是水油界面形成了有一定彈性和機(jī)械強(qiáng)度的保護(hù)薄膜，高濃度多糖溶液雖然乳化性較強(qiáng)，但形成的保護(hù)膜不穩(wěn)定，容易破裂，出現(xiàn)破乳現(xiàn)象，導(dǎo)致乳化穩(wěn)定性降低。

圖4 不同濃度雪膽多糖對(duì)橄欖油的乳化穩(wěn)定性

2.4.2 溫度

取15%雪膽多糖溶液3 mL，分別于4、25、45、65、85 ℃放置25 min，加入1 mL橄欖油，用勻質(zhì)器混勻。用移液槍取200 μL乳狀溶液于試管中，加入1%SDS溶液10 mL，搖勻，于波長(zhǎng)486 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度3次，剩余乳濁液放置10 min后再取200 μL，加入1%SDS溶液10 mL，于波長(zhǎng)486 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度3次，計(jì)算ESI。結(jié)果表明，4～45 ℃時(shí)雪膽多糖對(duì)橄欖油的乳化穩(wěn)定性呈先升高后小幅降低趨勢(shì)，45～65 ℃時(shí)升高幅度較大，65 ℃時(shí)達(dá)到最大值，65～85 ℃時(shí)急劇下降，見圖5?？赡苡捎诟邷兀ǔ^65 ℃）使乳化液黏度和多糖在界面上的吸附量降低，導(dǎo)致乳化液穩(wěn)定性降低。

圖5 不同溫度下雪膽多糖對(duì)橄欖油的乳化穩(wěn)定性

2.4.3 金屬離子

于室溫25 ℃取15%雪膽多糖溶液3 mL，分別加入0.01 mol/L的Na2SO4、K2SO4、MgSO4、CuSO4、ZnSO4、Al2(SO4)3、Mn2SO4溶液2 mL，再分別加入1 mL橄欖油，用勻質(zhì)器混勻。用移液槍取200 μL乳狀溶液于試管中，加入1%SDS溶液10 mL，搖勻，于波長(zhǎng)486 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度3次，剩余乳濁液放置10 min后再取200 μL，加入1%SDS溶液10 mL，于波長(zhǎng)486 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度3次，計(jì)算ESI，結(jié)果見圖6。含有K+、Zn2+、Mn2+的溶液中，雪膽多糖對(duì)橄欖油的乳化穩(wěn)定性較好，其中含有K+的溶液穩(wěn)定性最好；含有Na+、Mg2+、Cu2+、Al3+的溶液橄欖油乳化穩(wěn)定性較低，其中含有Al3+的溶液橄欖油乳化穩(wěn)定性最弱。可能由于Mg2+、Al3+等離子與雪膽多糖發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)（如絡(luò)合反應(yīng)、氧化反應(yīng)等），使溶液中多糖含量降低，溶液黏度降低，油滴分子運(yùn)動(dòng)加快，導(dǎo)致乳化穩(wěn)定性降低。

2.4.4 離子濃度

于室溫25 ℃取15%多糖溶液3 mL，選取“2.4.3”項(xiàng)下乳化穩(wěn)定性最優(yōu)的K+溶液，分別向試管中加入0.01、0.025、0.05、0.10 mol/L的K2SO4溶液2 mL，再加1 mL橄欖油，用勻質(zhì)器混勻。用移液槍取200 μL乳狀溶液于試管中，加入1%SDS溶液10 mL，搖勻，于波長(zhǎng)486 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度3次，剩余乳濁液放置10 min后再取200 μL，加入1%SDS溶液10 mL，于波長(zhǎng)486 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度3次，計(jì)算ESI，結(jié)果見圖7。雪膽多糖對(duì)橄欖油的乳化穩(wěn)定性隨K2SO4溶液濃度增大先升高后降低，在濃度為0.025 mol/L時(shí)穩(wěn)定性最好。當(dāng)K2SO4溶液濃度低于0.025 mol/L時(shí)，濃度增高使多糖更易溶解，而溶液中離子濃度過高可破壞多糖與橄欖油形成的保護(hù)膜，導(dǎo)致乳化液穩(wěn)定性降低。

圖6 不同金屬離子溶液的雪膽多糖對(duì)橄欖油的乳化穩(wěn)定性

圖7 不同濃度K2SO4溶液的雪膽多糖對(duì)橄欖油的乳化穩(wěn)定性

3 討論

常用絮凝劑殼聚糖具有長(zhǎng)鏈架橋型和陽離子型2種除雜作用，在中藥提取加工過程中，能有效沉降不穩(wěn)定雜質(zhì)，保留有效成分。本研究選用絮凝時(shí)間、殼聚糖濃度和絮凝溫度3個(gè)因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案，得到雪膽多糖的絮凝純化工藝：絮凝時(shí)間60 min，殼聚糖濃度1.0 mg/mL，絮凝溫度35 ℃。在此條件下，雪膽多糖的保留率為82.98%±1.16%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，雪膽多糖保留率為82.60%±1.21%，二者差異較小，表明殼聚糖絮凝工藝穩(wěn)定可靠。

本研究結(jié)果表明，雪膽多糖對(duì)橄欖油的乳化性有顯著影響。隨雪膽多糖濃度增加，乳化穩(wěn)定性呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)多糖濃度為15%時(shí)穩(wěn)定性最佳。65 ℃為最佳乳化溫度，溫度過高或過低則乳化液穩(wěn)定性降低。當(dāng)體系中含有K+時(shí)，橄欖油乳化液的穩(wěn)定性最好。高濃度K+會(huì)降低穩(wěn)定性，K+濃度較低時(shí)有助于乳化，選用0.025 mol/L的K+溶液時(shí)乳化穩(wěn)定性最好。

本研究通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化了殼聚糖絮凝法純化雪膽多糖的工藝條件，在此條件下絮凝法純化用時(shí)短，除雜效果好；同時(shí)，雪膽多糖能作為乳化劑使用。本研究為雪膽的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了新方法，并為雪膽的精深加工及應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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Optimization of Flocculation and Purification Process of Polysaccharides fromand Effects on Emulsification Stability for Olive Oil

LIANG Xiaoru1, LU Yingchun1, DUAN Kezhao2, ZHANG Guanghui1, YANG Shengchao1, ZHAO Yan1,3

To optimize the technique of flocculation and purification of polysaccharides fromthrough orthogonal test; To explore emulsification stability of polysaccharides for olive oil.Based on the single factor test, the flocculation time, chitosan concentration and flocculation temperature were used as investigator factors, and the retention rate of polysaccharide fromwas evaluated as an index. The orthogonal test was used to optimize flocculation technique, and the effects of polysaccharides from, temperature, metal ions types and metal ions concentration on emulsification of olive oil were analyzed.The optimal flocculation conditions were as follow: flocculation time was 60 min, chitosan concentration was 1.0 mg/mL, and flocculation temperature was 35 ℃, the retention rate of polysaccharide was 82.60%±1.21%. Polysaccharide fromhad significant effect on the emulsification of olive oil. The emulsification stability was best while polysaccharide concentration was 15%, emulsification temperature was 65 ℃, and the concentration of K2SO4was 0.025 mol/L.The optimized flocculation and purification process of polysaccharide fromare stable and reliable by orthogonal test. Polysaccharide fromhas good emulsification stability for olive oil.

polysaccharide;; chitosan; flocculation process; olive oil; emulsification stability

R284.2

A

1005-5304(2021)02-0081-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005032

國(guó)家自然科學(xué)基金（81960691）；云南省重大科技專項(xiàng)（2018ZF011）

趙艷，E-mail：zhaoyankm@126.com

（收稿日期：2020-05-04）

（修回日期：2020-08-16；編輯：陳靜）