基于InDel標(biāo)記的黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

盧霞　劉夢(mèng)華　鄧志軍　孫秋月　夏迎春　李文虎　司龍亭　阿門

摘要：為明確黃瓜（CucumissativusL.）自交系間的親緣關(guān)系，篩選適宜作為雜交親本的種質(zhì)資源，利用InDel標(biāo)記對(duì)48份黃瓜自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，68對(duì)InDel標(biāo)記中39對(duì)標(biāo)記具有強(qiáng)多態(tài)性，在48份材料中共檢測(cè)出79個(gè)等位基因，平均每對(duì)標(biāo)記檢測(cè)到2.0256個(gè)等位基因，遺傳距離在0～0.9551范圍之間，相似性系數(shù)在0.44～1.00之間，平均相似性系數(shù)為0.72，說(shuō)明48份材料總體親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性不夠豐富。NTSYS2.1軟件聚類結(jié)果表明，在相似性系數(shù)為0.44時(shí)，48份材料被劃分為兩大類群，主要為密刺黃瓜和水果黃瓜，用PowerMarker3.25軟件進(jìn)行樹(shù)狀圖分析，分析結(jié)果與NTYSYS聚類結(jié)果一致。研究結(jié)果可為了解黃瓜種質(zhì)資源遺傳背景及親本組合的選配奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃瓜種質(zhì)資源;InDel標(biāo)記;遺傳多樣性分析;多態(tài)性分析;聚類分析

中圖分類號(hào)：S642.202文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）01-0049-05

作者簡(jiǎn)介：盧霞（1991—），女，甘肅天水人，碩士，助理研究員，主要從事分子標(biāo)記輔助育種與種子純度鑒定。E-mail：1344963751@qq.com。

通信作者：阿門，博士，副研究員，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：2582259972@qq.com。

黃瓜（CucumissativusL.，2n=14）是葫蘆科甜瓜屬一年生蔓生植物，是一種世界性栽培蔬菜。黃瓜在我國(guó)已有2000多年的栽培歷史，已成為我國(guó)主要栽培蔬菜之一[1]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的自然和人工選擇，黃瓜材料間的遺傳背景極其相似，栽培黃瓜品種的遺傳變異顯著減少，品種間的遺傳多樣性遠(yuǎn)低于同屬的甜瓜[2-5]，使黃瓜的形態(tài)鑒定容易受到環(huán)境因素的影響。因此，明確育種材料的遺傳多樣性和親緣關(guān)系已成為黃瓜育種的重要工作之一。

傳統(tǒng)育種方法很難滿足黃瓜遺傳改良發(fā)展的需求，目前，分子標(biāo)記是進(jìn)行黃瓜種質(zhì)遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析的有效工具。近年來(lái)，為了更好地鑒別黃瓜，各種基于DNA的分子標(biāo)記被開(kāi)發(fā)出來(lái)。限制性內(nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）、表達(dá)序列標(biāo)簽-簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（EST-SSR）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）等現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)已在黃瓜遺傳育種中得到應(yīng)用。Dijkhuizen等利用RFLP分子標(biāo)記方法對(duì)16個(gè)黃瓜品種進(jìn)行遺傳多樣性分析并將聚類結(jié)果與同工酶標(biāo)記聚類結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明RFLP分子標(biāo)記聚類結(jié)果與同工酶標(biāo)記聚類結(jié)果一致[6]。李錫香等通過(guò)AFLP分子標(biāo)記對(duì)70多份黃瓜材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，將70份材料聚類為西雙版納黃瓜、野生黃瓜和栽培黃瓜三大類群[7]。穆生奇等利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)59份黃瓜材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明59份黃瓜材料被劃分到7個(gè)類群當(dāng)中[8]。劉俊青等用EST-SSR標(biāo)記評(píng)價(jià)了21份不同生態(tài)類型黃瓜種質(zhì)的遺傳多樣性，21份黃瓜種質(zhì)可分為兩大類群[9]。姚丹青等利用42個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行黃瓜遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，42個(gè)SNP位點(diǎn)中有30個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息量為0.027～0.528，71個(gè)黃瓜品種兩兩間的遺傳相似系數(shù)分布在0.4032～0.9809之間[10]。

基于全基因組重測(cè)序開(kāi)發(fā)的插入/缺失[Insertion/Deletion（InDel）]標(biāo)記是指2個(gè)親本間在全基因組序列中的差異。InDel標(biāo)記因其具有在基因組內(nèi)分布廣、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)、檢測(cè)容易等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，受到越來(lái)越多的關(guān)注，在生物遺傳多樣性、品種純度鑒定、親緣關(guān)系鑒定以及分子育種上都有重要的應(yīng)用價(jià)值[12-16]。本研究利用江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司（江蘇綠港）育種研究所提供的48份黃瓜自交系，采用基于綠美1號(hào)父母本全基因組重測(cè)序開(kāi)發(fā)的InDel標(biāo)記，鑒定了黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系，旨在為黃瓜種質(zhì)資源收集和保存提供參考，指導(dǎo)在育種中合理選擇選配親本，從而減少育種的盲目性加快育種進(jìn)程。

1材料與方法

1.1材料

供試材料選自江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司（江蘇綠港）育種研究所提供的48份黃瓜自交系（表1），代號(hào)為D1～D23、X1～X18、B1～B7。

1.2方法

1.2.1黃瓜基因組DNA的提取

2020年3月6日將供試材料播種于江蘇綠港育苗棚中，待長(zhǎng)至2～3張真葉時(shí)取樣，用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取黃瓜基因組DNA。具體提取步驟如下：（1）取新鮮葉片30mg放入2mL的離心管中，加入1個(gè)直徑4mm的鋼珠，蓋緊蓋子，將其放入液氮中60s，然后利用組織研磨儀磨樣80s;（2）磨好樣后，加入600μLCTAB提取液，55℃水浴15min，每隔5min上下翻轉(zhuǎn)混勻1次;（3）12000r/min離心5min，吸取400μL上清于干凈的1.5mL離心管中，加入250μL三氯甲烷和異戊醇混合物（24三氯甲烷∶[KG-*3]1異戊醇），充分混勻;（4）13000r/min離心90s，取300μL上清于另一個(gè)新的1.5mL離心管中，加入在-20℃條件下提前預(yù)冷的無(wú)水乙醇600μL，混勻，-20℃冰箱放置1h;（5）12000r/min離心5min，倒掉上清液，室溫放置;（6）待離心管中無(wú)乙醇味時(shí)，加入100μLddH2O溶解DNA。分別用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（DeNovixDS-11）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提DNA的濃度和質(zhì)量，放-20℃冰箱存放備用。

1.2.2PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為25μL，其中12.5μL2×TaqMasterMix（康為世紀(jì)），10μmol/L正反引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min;94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸2min，16℃結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.3數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)電泳結(jié)果，利用PowerMarker3.25軟件分析每個(gè)標(biāo)記所產(chǎn)生的等位基因數(shù)、有效等位基因頻率、雜合度、基因多樣性和多態(tài)性信息含量（PIC）等;用NTSYS2.1軟件進(jìn)行遺傳相似系數(shù)計(jì)算，同時(shí)用2種軟件中的UPGMA方法進(jìn)行樹(shù)狀圖分析及聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1InDel標(biāo)記多態(tài)性分析

從筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)發(fā)出的10470個(gè)InDel標(biāo)記中初步選擇68對(duì)InDel標(biāo)記對(duì)48份黃瓜自交系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，39對(duì)InDel標(biāo)記具有強(qiáng)多態(tài)性，共擴(kuò)增出79條多態(tài)性條帶，平均每對(duì)標(biāo)記產(chǎn)生2.0256個(gè)多態(tài)性條帶。標(biāo)記InDel250對(duì)48份黃瓜種質(zhì)材料擴(kuò)增出2個(gè)等位基因的電泳（圖1）。48份黃瓜自交系中平均等位基因位點(diǎn)為2.0256，觀察的48份黃瓜自交系的雜合度為0～0.2083，標(biāo)記InDel161的雜合度最高，為0.2083，標(biāo)記InDel269的基因多樣性最高，擴(kuò)增出3條帶，為擴(kuò)增帶型數(shù)量最多的標(biāo)記，且該標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果的多態(tài)性含量PIC值最高，為0.5246（表2）。

2.2基于InDel標(biāo)記的黃瓜種質(zhì)遺傳多樣性分析

在48份黃瓜種質(zhì)資源中，遺傳距離的范圍在0～0.9551之間，其中D2與D3，D5與D18，D9與D11，D4與D15、D16的遺傳距離為0，說(shuō)明這些材料可能為同一種質(zhì)資源，而X1與X2遺傳距離最大，達(dá)到0.9551，為比較理想的親本組合。利用NTSYS2.1軟件分析發(fā)現(xiàn)，48份黃瓜材料相似性系數(shù)變幅為0.44～1.00，平均相似性系數(shù)為0.72，說(shuō)明其親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性不夠豐富，遺傳背景相對(duì)狹窄。

采用NTSYS2.1軟件中的UPGMA對(duì)48份黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析作圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。在相似性系數(shù)為0.44時(shí)，將黃瓜種質(zhì)劃分為2個(gè)類群，第1類群包括D1、D2、D3、D12、D5等31份材料，且大部分密刺黃瓜被聚為此類;第2類群包括X1、X3、X7、X4、X11等17份材料，且該類群76.5%為水果黃瓜;白綠黑刺黃瓜、白綠稀刺黃瓜全部在第一大類群，2份白綠無(wú)刺黃瓜在第二大類群。為了驗(yàn)證NTYSYS軟件的分析結(jié)果，用PowerMarker3.25軟件進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)48份黃瓜自交系也是被聚為兩大類群（圖3），且聚類結(jié)果與上述NTSYS軟件分析結(jié)果完全一致。

3討論

近年來(lái)，分子標(biāo)記因其不受環(huán)境條件影響而作為作物遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析的有效工具。在黃瓜遺傳多樣性研究中，用RFLP、AFLP、SSR、EST-SSR、SNP等標(biāo)記對(duì)黃瓜種質(zhì)的研究較多，雖然InDel標(biāo)記具有在基因組內(nèi)分布廣、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)、容易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但其在黃瓜種質(zhì)研究中的報(bào)道較少。本研究選用68對(duì)InDel標(biāo)記對(duì)48份黃瓜自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，研究黃瓜種質(zhì)的親緣關(guān)系，為育種者提供相關(guān)有效信息。研究發(fā)現(xiàn)39對(duì)InDel標(biāo)記具有強(qiáng)多態(tài)性且擴(kuò)增帶型清晰，占所選標(biāo)記的57.4%;39對(duì)標(biāo)記在48份材料共檢測(cè)出79個(gè)等位基因，平均每對(duì)標(biāo)記檢測(cè)到2.0256個(gè)等位基因，遺傳相似性系數(shù)在0.44～1.00之間，平均相似性系數(shù)為0.72，說(shuō)明48份材料總體親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性不夠豐富，該結(jié)果與相關(guān)報(bào)道的黃瓜遺傳背景狹窄研究結(jié)果[2，4，9]一致。

本研究利用UPGMA聚類分析，在相似性系數(shù)為0.44時(shí)，將48份供試黃瓜材料分為兩大類群，第一大類群包括大部分的刺密黃瓜，而第二大類群主要為水果黃瓜。在第一類群中刺密黃瓜D2與D3，D5與D18，D9與D11，D4與D15、D16的相似性系數(shù)高達(dá)1，遺傳距離為0，說(shuō)明這些黃瓜材料遺傳背景更為相似，可歸為同一品系，表型上的差異可能為環(huán)境條件影響所致，也可能是因?yàn)楸狙芯克x用的InDel標(biāo)記與表型無(wú)直接關(guān)系。除去遺傳距離為0的材料外，其他種質(zhì)資源的遺傳距離在0.0064～0.9551范圍內(nèi)。此外，本研究中白綠黑刺黃瓜、白綠稀刺黃瓜，白綠無(wú)刺黃瓜分布在兩大類型中，表明它們的基因組可能是由密刺黃瓜和水果黃瓜變異而來(lái)，從該研究結(jié)果中可以很清晰地了解所選黃瓜材料的遺傳背景，指導(dǎo)育種人員進(jìn)行雜交組配。水果黃瓜綠美1號(hào)的父母本X1、X2被劃分到不同類群中，且X1與X2的遺傳距離最大，二者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且生產(chǎn)上綠美1號(hào)的品質(zhì)和產(chǎn)量均優(yōu)于親本，說(shuō)明綠美1號(hào)雙親間存在雜種優(yōu)勢(shì)，類似的研究在水稻、胡蘿卜、玉米等作物上也有報(bào)道[17-19]，本研究首次從分子水平上揭示了親本材料的遺傳差異與黃瓜雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系，為黃瓜育種和改良奠定了理論基礎(chǔ)。

本研究對(duì)48份黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，聚類分析揭示了黃瓜種質(zhì)間的親緣關(guān)系，將指導(dǎo)育種中合理選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)進(jìn)行雜交組合的配置，提高優(yōu)良組合選育，從而減少育種的盲目性，加快育種進(jìn)程。

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