天然植物人參中糖醛酸含量測定方法的建立

朱明月，仝文科，杜紅娜#， 苑軍輝，張延華，楊 景，孔素葉，陸 安

（ 1.中農(nóng)翎翔河北生物科技有限公司 050699；2.行唐縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所 050699；3.行唐縣畜牧工作總站 050699；4.行唐縣畜牧局動物疫病預(yù)防控制中心 050699；5.石家莊燕科生物科技有限公司 050200）

作為“東北三寶”之一的人參，在中國藥用歷史悠久。 人參中含有多種有效成分，但對人參的研究，多集中于人參皂苷。 近年來，關(guān)于人參多糖的報道越來越多，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖具有增強機體免疫力[1-6]和通過提高免疫力輔助抗腫瘤的作用[4-10]，顯示多糖對人參藥用價值的發(fā)揮亦起著重要作用。研究表明，人參多糖中的酸性多糖， 即含有糖醛酸結(jié)構(gòu)單元的多糖生物活性較高[11]。 目前，藥典“人參”飲片項下只有人參皂苷含量的測定方法，但未見人參中糖醛酸含量測定方法研究的報道。 因此，本試驗擬建立一種準確可靠的人參中糖醛酸含量測定方法， 為人參飲片中人參多糖的質(zhì)量控制提供可借鑒的分析方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV2550 型紫外-可見分光光度計( 日本島津)

AUW120D 型電子天平（日本SHIMADZU 公司）

1.2 藥物與試劑

D-半乳糖醛酸對照品 （中國食品藥品檢定研究院， 批號：111646-200301，供含量測定用），四硼酸鈉（美國Sigma 公司），間羥聯(lián)苯（美國Sigma 公司），咔唑（北京化學(xué)試劑公司）， 其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

人參藥材購于安國藥材市場， 經(jīng)本公司質(zhì)控部鑒別符合《中華人民共和國藥典》2015 版（Ⅰ部）有關(guān)項下規(guī)定[12]。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取人參細粉0.25g，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150mL，加熱回流1h，趁熱濾過，殘渣用80%熱乙醇洗滌3 次，每次10mL，洗滌液棄去。將殘渣及濾紙置燒瓶中，加水100mL，加熱回流1h，濾過。殘渣再加水100mL，加熱回流1h，趁熱濾過。殘渣及燒瓶用熱水洗滌4 次，每次10mL，合并濾液及洗滌液，放冷，轉(zhuǎn)移至250mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾紙過濾，取續(xù)濾液，即可。

2.2 對照品溶液的制備

稱取D-半乳糖醛酸對照品10.08mg， 置100mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 顯色劑的配制

2.3.1 四硼酸鈉-硫酸溶液的制備

稱取四硼酸鈉4.78g，置1000mL 量瓶中，加硫酸超聲（功率250W，頻率40kHz）使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得（0.0125 mol/L 四硼酸鈉-硫酸溶液）。

2.3.2 間羥聯(lián)苯溶液的制備

稱取間羥聯(lián)苯0.15g，置100mL 量瓶中，加0.5%的氫氧化鈉溶液超聲（功率250W，頻率40kHz）使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得（0.15% 間羥聯(lián)苯溶液）。

2.4 顯色條件考察

2.4.1 最大吸收波長的選擇

精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6mL，置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4mL 純化水，搖勻，于冰水浴中，加入D-半乳糖醛酸對照品溶液0.6mL，搖勻，置沸水浴中加熱12min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，加入間羥聯(lián)苯溶液80μL，搖勻，室溫放置40 min，以1mL 純化水同上操作制得空白溶液調(diào)零，以紫外可見分光光度計，在400～700 nm 進行光譜掃描，結(jié)果顯示，525nm 波長處吸光度值最大，因此，確定檢測波長為525nm。

2.4.2 四硼酸鈉-硫酸溶液用量考察

精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL，分別置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4mL 純化水，搖勻，各加入D-半乳糖醛酸對照品溶液0.6mL，搖勻，其余操作同2.4.1 項，測定吸光度。結(jié)果顯示：隨著四硼酸鈉-硫酸溶液用量的增加，D-半乳糖醛酸對照品溶液吸光度值先升高然后降低，其中以四硼酸鈉-硫酸溶液用量為6mL 的吸光度值最大。 因此，確定四硼酸鈉-硫酸溶液最佳用量為6mL。

2.4.3 沸水浴時間考察

精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6mL，平行七份，分別置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4mL 純化水，搖勻，各加入D-半乳糖醛酸對照品溶液0.6mL，搖勻，置沸水浴中分別加熱4min、6min、8min、10min、12min、14min、16min，其余操作同2.4.1 項，測定吸光度。 結(jié)果顯示：沸水浴時間不同時，對照品溶液吸光度基本沒有差異，說明沸水浴時間為4min 時，已反應(yīng)完全。

2.4.4 間羥聯(lián)苯用量考察

精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6mL，平行十份，分別置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4mL 純化水，搖勻，各加入D-半乳糖醛酸對照品溶液0.6mL，搖勻，置沸水浴中加熱4min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，再分別加入間羥聯(lián)苯溶液30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL，搖勻，其余操作同2.4.1項，測定吸光度。 結(jié)果顯示：隨著間羥聯(lián)苯用量的增加，對照品溶液吸光度值先增大后減小，其中以間羥聯(lián)苯用量為80μL 的吸光度值最大，因此，確定間羥聯(lián)苯最佳用量為80μL。

2.4.5 顯色時間（室溫放置時間）考察

精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6mL，置具塞試管中，于冰水浴中加入0.5mL 純化水，搖勻，加入D-半乳糖醛酸對照品溶液0.5mL，搖勻，置沸水浴中加熱4min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，加入間羥聯(lián)苯溶液80μL，搖勻，同法制備相應(yīng)空白溶液，以紫外可見分光光度計，每隔5min 測定一次525nm 波長處的吸光度，連續(xù)測定60min。 結(jié)果顯示：顯色時間不同時，對照品溶液吸光度的RSD 值為0.30%，吸光度基本沒有差異，說明顯色5min即可。

2.5 供試品溶液制備方法考察

2.5.1 供試品溶液制備方法比較

為了考察人參皂苷對糖醛酸含量測定是否存在干擾，對80%乙醇醇提皂苷后再水提糖醛酸和直接水提糖醛酸的方法進行比較，光譜掃描圖見圖1。

圖1 不同提取方法光譜掃描圖

顯色后顏色比較：醇提皂苷后再水提糖醛酸，供試品溶液顯色后為磚紅色；直接水提糖醛酸，供試品溶液顏色為咖啡色，兩種供試品溶液制備方法顯色后顏色不一致。 最大吸收波長比較：醇提皂苷后再水提糖醛酸，最大吸收波長為525nm，與對照品最大吸收波長一致，直接水提糖醛酸，最大吸收波長為508nm，與對照品最大吸收波長525nm 不一致。綜上所述，若直接水提進行顯色，則藥材中人參皂苷對糖醛酸含量測定存在干擾。 因此，需醇提皂苷排除干擾后再水提糖醛酸進行檢測。

2.5.2 醇提次數(shù)比較

對80%乙醇醇提皂苷的次數(shù)（1 次、2 次、3 次）進行了比較，結(jié)果顯示：醇提次數(shù)不同時，供試品溶液顯色后顏色一致，均為磚紅色，且最大吸收波長均在525nm 附近，且糖醛酸含量差異較小，說明提取1 次，人參皂苷已提取完全，因此確定80%乙醇醇提次數(shù)為1 次。

2.5.3 溶劑用量考察

對糖醛酸提取溶劑 （水） 用量—50mL、100mL、150mL、200mL 進行了考察，結(jié)果顯示：隨著溶劑用量的增加，糖醛酸含量增高，但溶劑用量為100mL、150mL 和200mL 時，糖醛酸含量差異較小，因此，確定溶劑用量為100mL。

2.5.4 水提次數(shù)考察

對糖醛酸水提次數(shù)進行了考察，結(jié)果顯示：隨著水提次數(shù)的增加，糖醛酸含量增高，但水提2 次和3 次，糖醛酸含量差異較小，說明提取2 次，糖醛酸已提取完完全。 因此，確定水提次數(shù)為2 次。

2.6 標準曲線的制備

精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6mL，置具塞試管中，平行六份， 于冰水浴中分別加入D-半乳糖醛酸對照品溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL，以純化水補足1.0mL，搖勻，置沸水浴中加熱4min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，再分別加入間羥聯(lián)苯溶液80μL，搖勻，室溫放置5min，同法制備空白溶液，以紫外可見分光光度計，分別測定525nm 處的吸光度，并制備標準曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 標準曲線

上述結(jié)果顯示：以D-半乳糖醛酸濃度為橫坐標(x)，吸光度為縱坐標(y) 作標準曲線，方程為y=0.0132x-0.0168(r=0.9997)，說明D-半乳糖醛酸溶液對照品溶液在10.08μg/mL～60.48μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 重復(fù)性考察

按取樣量0.8∶1.0∶1.2 的比例分別稱取樣品，各平行三份，精密稱定，按已確定的方法制備供試品溶液，并吸光度，計算糖醛酸含量。 九份樣品測定結(jié)果RSD 值為2.26%， 該方法重復(fù)性良好。

表1 回收率考察結(jié)果

2.7.2 精密度考察

取對照品溶液及重復(fù)性考察項下的供試品溶液， 以間羥聯(lián)苯法顯色， 對對照品溶液和供試品溶液連續(xù)測定6 次525nm 處吸光度， 計算RSD 值。 對照品和供試品溶液RSD 值分別為0.08%和0.00%，該方法精密度良好。

2.7.3 穩(wěn)定性考察

取對照品溶液及重復(fù)性考察項下的供試品溶液， 以間羥聯(lián)苯法顯色， 每隔30min 測定一次525nm 處的吸光度， 連續(xù)測定3h，計算RSD 值。 對照品和供試品溶液RSD 值分別為0.77%和2.15%，表明供試品溶液在3h 內(nèi)顯色穩(wěn)定。

2.7.4 回收率考察

按取樣量0.25g 的1/2 即0.125g 稱取本品，精密稱定，平行9 份，取已知濃度的的D-半乳糖醛酸對照品溶液，按照0.8∶1.0∶1.2 的比例分別加入樣品溶液中，各平行三份，按確定的樣品處理方法制備供試品溶液，以間羥聯(lián)苯法測定糖醛酸含量，計算回收率及回收率的RSD 值。 結(jié)果見表1。

上述結(jié)果顯示： 九份供試品溶液中，D-半乳糖醛酸回收率介于95%～105%之間， 回收率均值為100.49%，RSD 值為2.63%，該方法回收率良好。

2.8 人參多糖中糖醛酸的含量測定

精密稱取人參細粉0.25 g，按照“2.1”項下供試品溶液制備方法和“2.4”項下顯色條件顯色，測定吸光度，計算供試品溶液中糖醛酸含量。結(jié)果人參中糖醛酸含量為3.99%，RSD 為1.23%（n=3）。

3 討論

文獻顯示，糖醛酸含量測定方法分為“咔唑法”和“間羥聯(lián)苯法”兩種，咔唑法收載于《國家中成藥匯編》中“人參多糖注射液”項下；間羥聯(lián)苯法見于文獻[13]，該文獻報道咔唑法在測定人參酸性多糖中糖醛酸含量時， 因中性糖與硫酸咔唑絡(luò)合形成棕色衍生物，從而對糖醛酸含量測定存在干擾。 筆者對咔唑法和間羥聯(lián)苯法進行了比較，試驗結(jié)果顯示：采用間羥聯(lián)苯法測定時，對照品溶液和供試品溶液最大吸收波長均為525nm， 且供試品溶液和對照品溶液均為紫紅色；采用咔唑法測定時，對照品溶液最大吸收波長在525nm，而供試品溶液最大吸收波長在539nm，兩者最大吸收波長不一致，對照品溶液為紫紅色，而供試品溶液為咖啡色；且咔唑法和間羥聯(lián)苯法相比，供試品溶液的吸光度咔唑法比間羥聯(lián)苯法高0.286，說明咔唑法測定糖醛酸含量時，確實對測定結(jié)果的影響，同時驗證間羥聯(lián)苯法的可行性。 因此，確定人參飲片中糖醛酸含量測定方法為間羥聯(lián)苯法。

供試品溶液制備方法考察過程中， 考慮到人參中含有皂苷和多糖兩類成分，因此，筆者對皂苷是否對糖醛酸含量測定存在干擾進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皂苷類成分存在時，間羥聯(lián)苯法顯色后，供試品溶液的顏色和最大吸收波長均存在差異，說明皂苷類成分的存在，對糖醛酸含量測定確實存在干擾。 因此，供試品溶液制備方法中確定先醇提除去人參皂苷，然后再水提多糖，以保證含量測定方法的準確度。

經(jīng)多次試驗驗證，間羥聯(lián)苯法測定人參飲片中糖醛酸含量，重復(fù)性好，準確度高，適用于人參飲片中糖醛酸含量的測定。 該方法可為藥典 “人參” 飲片項下人參酸性多糖質(zhì)量控制提供參考，以便更好地控制人參飲片質(zhì)量。