腫瘤微環(huán)境中分泌的糖蛋白相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因在肝細胞癌發(fā)展中的作用研究

唐玉蓮,李根亮,倪安妮

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TM)是腫瘤賴以生存的環(huán)境，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系[1]。腫瘤微環(huán)境除了腫瘤基質(zhì)細胞外，還包括細胞外基質(zhì)、分泌蛋白、細胞因子和趨化因子等。細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，它主要是由成纖維細胞所分泌的蛋白質(zhì)和多糖所構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，包括一些膠原、彈性蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白等。正是由于這些成分賦予了細胞外基質(zhì)一定的強度、韌性以及抗壓能力[2]，形成了細胞賴以生存的環(huán)境。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶和生長因子等可異常激活，導(dǎo)致細胞發(fā)生惡性增殖現(xiàn)象以及形成異常微環(huán)境[3]。那么，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細胞外基質(zhì)發(fā)生了何種變化，哪些逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因參與構(gòu)建了異常細胞外基質(zhì)，細胞外基質(zhì)中的重要組分-糖蛋白又是如何構(gòu)建異常細胞外基質(zhì)參與肝細胞癌發(fā)展的？這些問題目前尚有待進一步研究。

目前，雖然有報道在腫瘤發(fā)生過程中，腫瘤可驅(qū)動細胞外基質(zhì)重塑，細胞外基質(zhì)中的各種組分都在發(fā)生各種變化[4]。但是，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，對細胞外基質(zhì)進行綜合分析，特別是對糖蛋白相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄基因在肝細胞癌中可能作用的分析研究未見報道。

因此，本研究以逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因(reverse transcription related genes, RTGs)為背景，通過建立小鼠肝癌模型，取成瘤小鼠瘤體組織作為TM，并以癌旁組織作為對照，通過RNA-seq及生物信息學(xué)手段，分析TM和對照組織間差異表達的糖蛋白相關(guān)RTGs以及它們在癌組織中的作用，探討其在構(gòu)建異常細胞外基質(zhì)參與肝癌發(fā)展的可能作用，并通過RT-qPCR驗證試驗結(jié)果，這將有助于進一步理解腫瘤發(fā)生、發(fā)展及遷移機制，為腫瘤的防治提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1H22肝癌小鼠模型建立及樣本獲取：H22肝癌細胞系購自南京凱基生物技術(shù)有限公司。選取鼠齡7周左右，體重22～25 g的健康昆明小鼠100只，體外培養(yǎng)H22肝癌細胞至指數(shù)增長期，3 000 r/min離心取細胞，無菌生理鹽水洗滌，生理鹽水稀釋至濃度105個細胞/ml，給予每只小鼠雙前肢腋下接種細胞懸液0.2 ml，正常飼養(yǎng)4周后，取TM和癌旁組織。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2RNA的提取和測序：兩種樣本組織各取50 μg，使用商品化RNA提取試劑盒提取總RNA。RNA質(zhì)量檢測、逆轉(zhuǎn)錄、文庫構(gòu)建及測序數(shù)據(jù)的處理按常規(guī)程序進行。

1.3逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)差異表達基因篩選:通過NCBI中的nucleotide數(shù)據(jù)庫檢索Reverse transcript，刪除重復(fù)項后的檢索結(jié)果作為比對背景，與測序數(shù)據(jù)中的差異表達基因比較，篩選出兩樣本中差異表達的RTGs。

1.4逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)差異表達基因的功能富集分析:采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進行功能富集，分析其功能并篩選出糖蛋白相關(guān)的RTGs。

1.5RT-qPCR驗證逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)差異表達基因的表達情況:隨機選取4個逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)差異表達基因進行RT-qPCR，驗證其表達量以及RNA-seq測序結(jié)果。引物使用Primer-Blast軟件進行設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.6糖蛋白相關(guān)RTGs的編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析:采用STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫對糖蛋白相關(guān)RTGs的編碼蛋白進行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析，分析其分布和功能相關(guān)性。

1.7糖蛋白相關(guān)RTGs的AS和SNV/INDEL與基因表達的相關(guān)性分析:利用Excel軟件對糖蛋白相關(guān)RTGs中出現(xiàn)的AS和SNV/INDEL進行χ2檢驗，以P<0.05且兩樣本間發(fā)生頻率數(shù)≥2的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1RNA-seq測序分析:提取實驗組和對照組樣本總RNA送公司測序，分別獲得了5.01G base(35.28M clean reads)和5.02G base (35.32M clean reads)的數(shù)據(jù)。兩樣本所得clean reads數(shù)據(jù)與基因組的匹配率分別為93.65%和89.20%，且兩樣本測序數(shù)據(jù)的Q20皆大于99%，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

2.2逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)差異表達基因篩選和功能富集分析:NCBI檢索逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，共檢索到28157條逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因條目，經(jīng)DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫注釋，共在小鼠物種中獲得99個RTGs。通過與測序數(shù)據(jù)比對，共獲得了24個差異表達RTGs。其中，上調(diào)表達12個，下調(diào)表達12個。在TM中，上調(diào)表達的12個基因分別為Sh3d21、Cdyl、Tmod3、Loxl2、Col11a1、Traf1、Ehd1、Lox、Fmnl3、G3bp1、Nfkbia、Actn1；下調(diào)表達的12個基因分別為Fam155a、Cped1、Abcd2、Prkce、Tmco4、Igsf23、Hand2、Naxd、Il1rn、Slc23a1、Tnfrsf1b、Fas。經(jīng)功能富集分析，共得到1個BP、1個CC、4個MF和4個UP_SEQ_FEATURE。見圖1。

注: BP: 生物學(xué)程序; CC: 細胞組分; MF: 分子功能; UP_SEQ_FEATURE: 蛋白位點序列特征圖1 差異表達的逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因(RTGs)的功能

進一步功能分析，發(fā)現(xiàn)Col11a1、Il1rn、Lox、Loxl2、Slc23a1、Abcd2、Fam155a等參與了異常細胞外基質(zhì)中糖蛋白構(gòu)建，其中Col11a1、Lox、Loxl2等廣泛參與了膠原纖維形成、糖蛋白亞基間二硫鍵連接、金屬離子結(jié)合以及細胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。這些基因與Naxd還一同參與了蛋白質(zhì)糖基化，特別是N-連接糖基化。

2.3逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)差異表達基因的RT-qPCR驗證:隨機選取4個逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)差異表達基因進行RT-qPCR分析，內(nèi)參基因為GAPDH，引物序列見表1。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，其結(jié)果與RNA-seq結(jié)果一致。見圖2。

2.4糖蛋白相關(guān)RTGs的編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析：對糖蛋白相關(guān)RTGs編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)Col11a1、Lox、Loxl2、Il1rn、Prkce、Naxd、Ehd1等編碼蛋白的相關(guān)性較強。見圖3。

表1 RT-qPCR 引物

注: 圖中數(shù)值為癌旁組織/TM取以5為底的對數(shù)值圖2 用 RT-qPCR與RNA-seq分析TM和癌旁組織中逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)差異表達基因的表達情況

圖3 TM中糖蛋白相關(guān)RTGs編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

2.5糖蛋白相關(guān)RTGs的AS和SNV/INDEL與基因表達的相關(guān)性分析：對糖蛋白相關(guān)的RTGs的可變剪切事件(AS)、單核苷酸變異(SNV)/插入缺失標記(INDEL)分析，結(jié)果顯示：均未發(fā)現(xiàn)AS，但9個基因發(fā)生了82個SNV和4個INDEL位點的改變。9個基因的AS和SNV/INDEL與基因表達的相關(guān)性中5個基因的SNV和1個基因的INDEL在兩樣本中存在統(tǒng)計學(xué)差異，且其發(fā)生頻率與基因表達呈正相關(guān)。見表2 。糖蛋白相關(guān)的幾個主要基因Col11a1、Lox、Loxl2、Prkce、Ehd1均存在SNV和INDEL位點改變。見表3。其中Col11a1發(fā)生了1個INDEL和31個SNV；Lox發(fā)生了1個INDEL和1個SNV；Loxl2和Prkce均發(fā)生了8個SNV；Ehd1發(fā)生了2個SNV，這些基因位點的改變主要發(fā)生在基因的3個部位，即外顯子區(qū)(exonic)、內(nèi)含子區(qū)(intronic)和基因間區(qū)(intergenic)。

3 討論

實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展常伴隨著細胞外基質(zhì)的過量沉積及其組織形式的異常[5]。細胞外基質(zhì)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能受糖基化、共價交聯(lián)等翻譯后修飾的調(diào)控，且細胞外基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與功能的紊亂將導(dǎo)致癌癥、組織纖維化、結(jié)締組織異常等多種疾病的發(fā)生[6]。通過研究，發(fā)現(xiàn)在TM中異常表達多個逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，它們的分子生物學(xué)過程主要集中在腫瘤異常微環(huán)境細胞外基質(zhì)的構(gòu)建方面(如膠原纖維組織、糖蛋白、細胞外基質(zhì)等)。尤其值得一提的是，存在大量糖蛋白參與這一生物學(xué)過程。糖蛋白是細胞外基質(zhì)的重要組成成分，包括不溶性大分子的結(jié)構(gòu)糖蛋白和各種非結(jié)構(gòu)性糖蛋白。腫瘤細胞外基質(zhì)與正常組織實質(zhì)相比，含有更多的膠原蛋白[7]，而糖蛋白的異常糖基化則與肝癌密切相關(guān)[8]。由此可見，糖蛋白參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

表2 SNV/INDEL發(fā)生頻率與基因表達的相關(guān)性

表3 TM中主要幾個糖蛋白相關(guān)RTGs的SNV/INDEL發(fā)生情況

筆者在TM中發(fā)現(xiàn)大量糖蛋白相關(guān)的RTGs差異表達，這說明糖蛋白對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能有很大影響。蛋白位點序列特征分析表明，有8個差異表達的糖蛋白相關(guān)RTGs，即Col11a1、Il1rn、Lox、Loxl2、Slc23a1、Abcd2、Fam155a和naxd，它們都含有糖蛋白N-連接型糖鏈(簡稱N-糖鏈)的糖基化位點，其中兩個還具有類賴氨酰氧化酶感興趣區(qū)域、賴氨酸酪氨酸醌交聯(lián)區(qū)及銅離子結(jié)合位點等活性連接區(qū)。結(jié)合此前的一些報道，糖基化位點與糖基化水平異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。這說明，TM中異常表達的糖蛋白可能主要通過N-粘連、N-乙酰葡糖胺的糖基化、賴氨酸酪氨酸醌的交叉粘連、金屬離子結(jié)合以及類賴氨酰氧化酶結(jié)合等形式構(gòu)建異常的胞外基質(zhì)。另差異表達基因的4個MF則表明，差異表達的糖蛋白還可能通過蛋白質(zhì)賴氨酸6-氧化酶活性、氧化還原酶活性、作用于供體的CH-NH2、氧作為受體、ATP結(jié)合、甲基化組蛋白結(jié)合等參與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展。賴氨酸6-氧化酶起胺氧化酶的作用，在細胞外基質(zhì)的調(diào)制過程中修飾賴氨酸殘基促進膠原和蛋白交聯(lián)[11]；氧化還原酶通過調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)和細胞外基質(zhì)微小而漸進的變化具有促進纖維化作用等[12]。

筆者的研究表明，在肝癌組織中Col11a1、Lox、Loxl2等上調(diào)表達，Slc23a1、Abcd2、Fam155a、Prkce、Il1rn以及naxd等下調(diào)表達。其中，上調(diào)表達的Col11a1，能夠通過控制Ⅱ型膠原纖維的橫向生長而在纖維發(fā)生中起重要作用，并通過編碼Ⅱ型膠原蛋白參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。此外，Col11a1還可活化間質(zhì)干細胞成為癌相關(guān)成纖維細胞，從而導(dǎo)致腫瘤生長和預(yù)后不良[13]。上調(diào)表達的細胞外銅依賴性胺氧化酶Lox (賴氨酰氧化酶)及Loxl2(賴氨酰氧化酶樣蛋白2)，在細胞外基質(zhì)中不僅可以將賴氨酸殘基氧化脫氨基從而介導(dǎo)纖維膠原和彈性蛋白交聯(lián)，維持細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)[14-15]，還可作為血管生成的調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)Ⅳ型膠原支架形成，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)血管生成、營養(yǎng)腫瘤細胞的作用。

另外，筆者通過AS和SNV/INDEL分析，發(fā)現(xiàn)這些糖蛋白相關(guān)RTGs在腫瘤組織中異常表達與它們的基因多態(tài)性相關(guān)，有9個基因發(fā)生了82個SNV和4個INDEL位點的改變，且具有統(tǒng)計學(xué)意義的SNV和INDEL的發(fā)生頻率與相應(yīng)基因的表達呈正相關(guān)。這些基因位點的改變主要發(fā)生在參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要區(qū)域，如外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)或基因間區(qū)。這表明，SNV和INDEL引進的基因多態(tài)性在肝癌中扮演著調(diào)控基因表達的重要角色。

綜上所述，本研究通過RNA-seq及生物信息學(xué)手段闡釋了腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中細胞外基質(zhì)的改變，并進一步闡述了細胞外基質(zhì)中的重要組分-糖蛋白相關(guān)差異表達基因在構(gòu)建異常細胞外基質(zhì)參與肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，對進一步理解腫瘤發(fā)生、發(fā)展及遷移機制具有重要的意義。

致謝

本研究由廣西自然科學(xué)基金(2016GXNSFAA380177和2015GXNSFAA139219)、廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目(NO:JGY2020164)共同資助。