某國(guó)產(chǎn)人類免疫缺陷病毒1型核酸定量檢測(cè)試劑的臨床試驗(yàn)研究*

周全華,王 越,劉 華,廖 莉,陳 玲,張媛媛,張 敏

重慶市疾病預(yù)防控制中心微生物檢測(cè)所,重慶 400042

艾滋病是全球共同關(guān)注的疾病，我國(guó)自1985年發(fā)現(xiàn)首例人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者以來(lái)，截至2018年9月30日，報(bào)告現(xiàn)存活849 602例感染者[1]。早發(fā)現(xiàn)、早治療是控制艾滋病傳播的關(guān)鍵[2]。其病原HIV在人體體液中的含量與其傳播能力呈正相關(guān)。病毒載量是指每毫升體液中病毒顆粒的數(shù)量。根據(jù)人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒載量檢測(cè)結(jié)果，可以診斷HIV-1感染狀況，監(jiān)測(cè)疾病病程，判斷抗病毒治療的效果和指導(dǎo)治療方案的選擇[3-5]。但是，我國(guó)HIV-1病毒載量檢測(cè)主要還是依賴于進(jìn)口設(shè)備和試劑，其昂貴的價(jià)格，嚴(yán)重制約了接受抗病毒治療的感染者和患者的檢測(cè)頻率及病毒載量檢測(cè)覆蓋的范圍。為使有限的公共衛(wèi)生資源能更好地運(yùn)用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域，開發(fā)靈敏度、精確度和準(zhǔn)確度與進(jìn)口試劑相當(dāng)?shù)膰?guó)產(chǎn)檢測(cè)試劑已迫在眉睫。本研究對(duì)某國(guó)產(chǎn)HIV-1核酸定量試劑盒(PCR-熒光探針法)進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)，比較其和進(jìn)口同類試劑的相關(guān)性和一致性，為該國(guó)產(chǎn)HIV-1核酸檢測(cè)試劑的臨床性能評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支撐，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 所有標(biāo)本均來(lái)自重慶市疾病預(yù)防控制中心在2018-2019年接受抗病毒治療患者和新確認(rèn)的HIV感染者，共篩選了208例血漿標(biāo)本，因標(biāo)本信息不全剔除11例，實(shí)際納入197例標(biāo)本，其中，陽(yáng)性標(biāo)本188例，定量范圍涵蓋10～106IU/mL，陰性標(biāo)本9例(健康人群)，符合對(duì)比試劑和考核試劑定量限范圍的標(biāo)本178例。

1.2試劑 對(duì)比試劑為Roche Cobas TaqMan HIV-1 Test Version2.0檢測(cè)試劑盒(簡(jiǎn)稱Roche試劑)，購(gòu)于羅氏公司，上樣量1 mL，檢測(cè)限33.40～1.67×107IU/mL；考核試劑為HIV-1核酸測(cè)定試劑盒(RT-PCR熒光探針法,簡(jiǎn)稱麗珠試劑),由珠海麗珠試劑股份有限公司研制，上樣量500 μL，檢測(cè)限1.0×102～1.0×107IU/mL；復(fù)核試劑為HIV-1核酸定量試劑盒(PCR-熒光探針法,簡(jiǎn)稱達(dá)安試劑),由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供,上樣量200 μL，檢測(cè)限2.5×102～1.0×108IU/mL。

1.3方法 根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局2014年9月11日頒布的《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，選擇已批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品作為對(duì)比試劑(Roche試劑)，與考核試劑(麗珠試劑)對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究，結(jié)果不一致的標(biāo)本用復(fù)核試劑(達(dá)安試劑)進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)。操作過程均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)、率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用線性回歸方法分析不同試劑檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，采用Bland-Altman法分析2種試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性。通過GraphPad prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié) 果

2.1考核試劑與對(duì)比試劑的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果比較 188例HIV陽(yáng)性標(biāo)本中，186例標(biāo)本經(jīng)2種試劑檢測(cè)均為陽(yáng)性，陽(yáng)性符合率為98.94%(95%CI：96.20%～99.71%)，9例陰性標(biāo)本經(jīng)2種試劑檢測(cè)結(jié)果均為陰性，陰性符合率為100.00%(95%CI：70.09%～100.00%)，2種試劑檢測(cè)總符合率為98.98%(95%CI：96.37%～99.72%)，見表1。2例(編號(hào)為RZ-159、RZ-166)結(jié)果不一致的標(biāo)本用復(fù)核試劑進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，復(fù)核結(jié)果見表2。利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Kappa一致性分析，Kappa值為0.895(P<0.05)，說明考核試劑與對(duì)比試劑具有較好的一致性。

2.2各基因型標(biāo)本檢出情況 共有188例標(biāo)本進(jìn)行分型檢測(cè)，143例標(biāo)本分型檢測(cè)成功，其中，AE重組型(CRF01-AE重組型)19例、BC重組型116例(CRF07-BC重組型88例、CRF08-BC重組型28例)、B/B′型8例，加上購(gòu)買的O組商品化陽(yáng)轉(zhuǎn)血清盤1例，共計(jì)144例分型成功?？己嗽噭z出率為99.31%(143/144)，有1例(編號(hào)RZ-166)CRF08-BC的標(biāo)本未檢出；對(duì)比試劑檢出率為100.00%(144/144)。

表1 考核試劑與對(duì)比試劑定性檢測(cè)結(jié)果比較

表2 2例結(jié)果不一致標(biāo)本考核試劑、對(duì)比試劑及復(fù)核試劑檢測(cè)結(jié)果

2.3線性范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果 符合對(duì)比試劑(33.4～1.67×107IU/mL)和考核試劑(1.0×102～1.0×107IU/mL)檢測(cè)限范圍的標(biāo)本178例，剔除其中4例離群標(biāo)本，對(duì)剩余的174例標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果采用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換處理后再進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)分析，線性回歸方程為Y=0.98X-0.04，相關(guān)系數(shù)r=0.968(R2=0.937，P<0.05)，2種試劑檢測(cè)結(jié)果線性相關(guān)關(guān)系成立，說明2種試劑相關(guān)性較好，見圖1A。采用Bland-Altman一致性分析，174組數(shù)據(jù)的95%一致性界限為(-0.64，0.35)，有5/174(2.87%)例標(biāo)本在95%一致性界限以外，說明2種檢測(cè)試劑的一致性較好，見圖1B。

2.4治療患者標(biāo)本與未治療患者標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性 本次試驗(yàn)中共收集到97例接受抗病毒治療的患者標(biāo)本，檢測(cè)范圍涵蓋10～104IU/mL，考核試劑與對(duì)比試劑的線性回歸方程為Y=0.93X+0.07，相關(guān)系數(shù)為r=0.933(R2=0.871)，見圖2。92例(含1例HIV-1 O組商品化陽(yáng)轉(zhuǎn)血清盤)未接受治療的HIV-1感染者標(biāo)本，檢測(cè)范圍涵蓋102～106IU/mL，考核試劑與對(duì)比試劑的線性回歸方程為Y=X+0.12，相關(guān)系數(shù)為r=0.950(R2=0.903)，見圖3。

注：A為考核試劑與對(duì)比試劑檢測(cè)HIV-1標(biāo)本的相關(guān)性分析；B為考核試劑與對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果一致性分析。

圖2 考核試劑與對(duì)比試劑檢測(cè)抗病毒治療患者標(biāo)本結(jié)果的相關(guān)性

圖3 考核試劑與對(duì)比試劑檢測(cè)未抗病毒治療患者標(biāo)本結(jié)果的相關(guān)性

3 討 論

艾滋病作為全球十大死因之一的傳染性疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康，且目前無(wú)有效疫苗和徹底治愈的方法[6-7]，故防控HIV的流行成為世界各國(guó)面臨的一項(xiàng)十分重要的任務(wù)[8]。治療艾滋病及HIV攜帶者是我國(guó)現(xiàn)行的防控措施之一[9-10]，準(zhǔn)確、客觀、及時(shí)評(píng)價(jià)抗病毒治療效果就顯得十分重要。有文獻(xiàn)報(bào)道，早期診斷和有效治療能使HIV傳播的風(fēng)險(xiǎn)降低96%[9]，HIV-1病毒載量檢測(cè)是評(píng)價(jià)抗病毒治療效果和早期診斷最有效的方法，然而進(jìn)口試劑和設(shè)備價(jià)格昂貴，嚴(yán)重制約了我國(guó)HIV-1病毒載量檢測(cè)工作的開展，因此開發(fā)適合我國(guó)國(guó)情的優(yōu)質(zhì)試劑迫在眉睫。

在197例檢測(cè)標(biāo)本中，考核試劑和對(duì)比試劑在Kappa分析中，Kappa值為0.895(P<0.05)，說明2種檢測(cè)試劑在定性檢測(cè)方面完全一致。在2種試劑共同的線性范圍內(nèi)，回歸分析表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.968(R2=0.937)，這與鄒靜波[6]、MURPHY等[11]、李梅等[12]、孫國(guó)清等[13]、丁莉莎等[14]的報(bào)道的結(jié)果相一致。Bland-Altman一致性分析顯示出2種試劑一致性較好。在2種試劑共同的線性范圍中，考核試劑有4例標(biāo)本出現(xiàn)離群值，可能是2種試劑選擇的靶基因位點(diǎn)、引物、探針序列及反應(yīng)體系的不同造成檢測(cè)結(jié)果的差異，同時(shí)由于HIV為反轉(zhuǎn)錄病毒，基因組的突變率非常高，當(dāng)待測(cè)標(biāo)本的基因組的靶基因發(fā)生突變，即可能造成考核試劑和對(duì)比試劑的檢測(cè)結(jié)果的差異。在定性分析中，有2例檢測(cè)結(jié)果不一致，這可能與超出考核試劑的檢測(cè)限，并且處于對(duì)比試劑檢測(cè)下限，檢測(cè)結(jié)果本來(lái)就具有很大的不確定性有關(guān)。李繁等[15]的研究也指出，在病毒載量較低時(shí)，不同試劑盒加樣量的不同會(huì)直接導(dǎo)致檢測(cè)敏感性差異。本次研究發(fā)現(xiàn)的差異在臨床可接受的范圍內(nèi)，因此，可以認(rèn)為考核試劑與對(duì)比試劑具有良好的一致性。

對(duì)我國(guó)4種主要流行的HIV-1基因亞型(CRF07-BC、CRF01-AE、CRF08-BC、B/B′)[16-17]檢測(cè)中，考核試劑與對(duì)比試劑的檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.24,P>0.05)，說明該考核試劑能滿足我國(guó)HIV-1病毒載量的檢測(cè)要求。

本研究發(fā)現(xiàn)，考核試劑與對(duì)比試劑對(duì)于治療患者的標(biāo)本和未治療患者標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果具有高度的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.933和0.950。這表明該考核試劑能夠運(yùn)用于治療效果的監(jiān)測(cè)、疾病的進(jìn)程和感染狀況的判斷。

綜上所述，本研究參與評(píng)估的考核試劑在定性、定量、治療患者和未治療患者、不同基因亞型等方面的檢測(cè)能力都與對(duì)比試劑具有較好的相關(guān)性和一致性。隨著國(guó)產(chǎn)試劑研發(fā)的投入，市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了與進(jìn)口試劑質(zhì)量相當(dāng)?shù)膰?guó)產(chǎn)試劑[18-19]，甚至部分國(guó)產(chǎn)試劑已經(jīng)優(yōu)于部分進(jìn)口試劑[20]。國(guó)產(chǎn)試劑相對(duì)于進(jìn)口試劑而言，具有檢測(cè)設(shè)備開放、所需樣本量小、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，更容易被患者和臨床醫(yī)生所接受。但是國(guó)產(chǎn)試劑普遍面臨著儀器設(shè)備的自動(dòng)化程度較低、低值的重復(fù)性較差等缺點(diǎn)，這些都需要在下一步的研發(fā)中進(jìn)行完善。