均勻設計法優(yōu)化灰樹花多糖超聲波輔助提取工藝及其抗氧化活性分析

曹丹，孫于寒，彭浩，2*蘭阿峰，2

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中723000）

灰樹花（Grifola frondosa）別名貝葉多孔菌，俗稱“舞菇”，是一種十分有價值的食藥用真菌，其子實體和菌絲體中均含具有多種藥理作用及生物活性的物質——灰樹花多糖[1-3]?；覙浠ǘ嗵鞘腔覙浠ㄖ饕钚猿煞种?，是一種由葡聚糖、葡萄糖、木糖、巖藻糖、甘露糖及少量蛋白質組成的雜多糖。其結構多為β-1，3-葡聚糖，少量為α-1，4-葡聚糖、α-1，6-葡聚糖[4-5]。其中β-1，3-葡聚糖能極大地提高人體免疫力，且具有強大的自由基清除能力[6]。隨著生活水平的日益提高，人們越來越注重健康，也更加提倡天然健康食品。因此，具有調節(jié)身體機能、預防疾病的灰樹花多糖逐漸受到關注[7]。

灰樹花多糖以其獨特的食藥用價值迅速成為研究的熱點，而高效的提取方法成為其研究的關鍵。目前多糖的提取方法主要有超聲提取法、生物酶提取法、微波提取法等[8-9]。與現(xiàn)有方法相比較，超聲提取法具有操作簡單、提取率高，對設備要求較低，提取耗時短等特點，在真菌多糖的工業(yè)生產(chǎn)中有較大應用潛力[10-12]。近年來，有關灰樹花多糖提取優(yōu)化的研究主要以響應曲面法和正交試驗法為主，未見采用均勻設計法進行提取條件優(yōu)化。均勻設計法可自動將各試驗因素進行分類和排序，能減少試驗次數(shù)，提高優(yōu)化進程。程凱凱等[13]采用均勻設計法對泰山赤靈芝多糖的提取工藝進行優(yōu)化，結果表明優(yōu)化后的提取條件穩(wěn)定性更好，多糖提取率更高。為了更加高效地提取灰樹花β-葡聚糖，本試驗采用均勻設計法對灰樹花多糖超聲波輔助提取工藝進行優(yōu)化，旨在獲得高提取率的優(yōu)化設計方案，加快灰樹花多糖在醫(yī)療保健、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等方面的開發(fā)利用[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹花菌種（HZ-01）：陜西省食藥用菌工程技術研究中心提供；葡萄糖（分析純）、蛋白胨（分析純）、KH2PO4（分析純）、MgSO4（分析純）：天津市盛奧化學試劑有限公司；瓊脂（生物試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；VB1：華中藥業(yè)有限公司；土豆：市售。

RE-6000A 型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器設備有限公司；SW-CJ-1D 型單人超凈工作臺：上海蘇凈實業(yè)有限公司；YXQ-LS-50S 型高壓滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV2550 型紫外分光光度計：日本島津公司；XO-SM100 超聲波微波協(xié)同反應工作站：南京先歐儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

基礎培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，VB110.0 mg/L，瓊脂19.0 g/L，pH 自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，VB110.0 mg/L，瓊脂19.0 g/L，pH 自然。

1.2.2 菌種活化

在無菌操作臺中，用手術刀取0.5 cm2保藏菌種于25 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后取出，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 灰樹花多糖的超聲提取工藝

將灰樹花菌絲體置于烘箱中，60 ℃烘干至恒重，24 000 r/min 粉碎1 min，過40 目篩，稱取灰樹花菌絲體粉末10.0 g，按照水料比5∶1（mL/g），加入超純水，調節(jié)pH 值，在一定的超聲功率下提取一定時間，抽濾，按照此法提取若干次，合并濾液真空濃縮，加入3 倍體積的無水乙醇，冷藏過夜，收集沉淀物，去除乙醇得到灰樹花粗多糖[15]。

1.2.4 單因素試驗

在1.2.3 工藝條件下，分別比較不同浸提次數(shù)（1、2、3、4、5 次）、不同提取時間（15、35、55、75、95、115 min）、不同提取溫度（26、45、60、75、90、105 ℃）對灰樹花多糖和β-葡聚糖提取率的影響。

1.2.5 均勻設計試驗

根據(jù)均勻設計試驗原理，在預試驗的基礎上，結合單因素試驗結果，選取超聲波功率（X1）、提取時間（X2）、提取溫度（X3）和水料比（X4）為考察對象，以灰樹花多糖提取率（Y1）和β-葡聚糖提取率（Y2）為考察指標，采用四因素七水平均勻試驗分析法確定其最佳提取工藝條件，并對所獲得試驗結果進行驗證。試驗因素水平編碼見表1。

表1 試驗因素及水平Table 1 Factors and levels

1.2.6 灰樹花多糖含量及提取率測定

多糖含量采用苯酚-硫酸法[17]測定，以葡萄糖為標準品制作標準曲線[16]，以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y1=0.062 9x-0.045 7，R2=0.997，由回歸方程計算得出多糖含量。

多糖提取率/%=多糖含量/灰樹花菌絲體粉末質量×100。

1.2.7 灰樹花菌絲體β-葡聚糖含量及提取率測定

β-葡聚糖含量采用剛果紅法[19]測定，以β-葡聚糖為標準品制作標準曲線[18]，β-葡聚糖含量為橫坐標，β-葡聚糖溶液吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y2=0.282 8x-0.252 1，R2=0.998。由回歸方程計算得出β-葡聚糖含量。

β-葡聚糖提取率/（mg/g）=β-葡聚糖含量/灰樹花菌絲體粉末質量。

1.2.8 體外抗氧化活性的測定

取濃縮后的提取液分別進行還原能力、DPPH 自由基清除能力及羥自由基清除能力測定。

1.2.8.1 還原能力測定

參考鐵氰化鉀還原法[20]，將待測樣品用雙蒸水分別配制成不同濃度梯度，取1 mL 依次加入2.5 mL pH 6.6 磷酸緩沖液、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻后于50 ℃水浴鍋中反應20 min，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，于離心機中4 ℃，3 000 r/min 離心10 min。取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL 超純水、2.5 mL 0.1%的三氯乙酸溶液，以蒸餾水代替上述操作中的鐵氰化鉀溶液為空白組，靜置10 min 測定樣品在700 nm 處的吸光度值。以抗壞血酸VC作為陽性對照，重復3 次取平均值。

1.2.8.2 DPPH 自由基清除能力的測定

參考DPPH 清除法[21]，將待測樣品用雙蒸水分別配制成不同濃度梯度，取2 mL 加入2 mL 0.1 mmol/L、95%乙醇配制的DPPH 溶液，混合均勻，暗反應30 min后5 000 r/min 離心5 min，取上清液在519 nm 處測定吸光值，以雙蒸水代替上述操作中的樣品溶液為空白組。以抗壞血酸VC做陽性對照，重復3 次取平均值。并按下列公式計算DPPH 自由基清除率。

式中：AX為2 mL DPPH 溶液+2 mL 雙蒸水吸光值；AX0為2 mL DPPH 溶液+2 mL 樣品溶液吸光值；A0為2 mL 95%乙醇溶液+2 mL 樣品溶液吸光值。

1.2.8.3 羥自由基清除能力的測定

參考羥自由基清除法[22]，將待測樣品用雙蒸水分別配制成不同濃度梯度，取0.5 mL 樣品溶液分別加入0.5 mL 6 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、0.5 mL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液和0.5 mL 8.8 mmol/L 過氧化氫溶液，混合均勻，于37 ℃反應15 min，在波長510 nm 處測定吸光值，以雙蒸水作為空白，同時以蒸餾水替代H2O2作為損傷組，抗壞血酸VC作陽性對照，重復3 次取平均值。

式中：AX為0.5 mL 樣品溶液+0.5 mL 硫酸亞鐵溶液+0.5 mL 水楊酸－乙醇溶液+0.5 mL 過氧化氫溶液的吸光值；AX0為0.5 mL 樣品溶液+0.5 mL 硫酸亞鐵溶液+0.5 mL 水楊酸－乙醇溶液+0.5 mL 雙蒸水的吸光值；A0為0.5 mL 雙蒸水+0.5 mL 硫酸亞鐵溶液+0.5 mL水楊酸－乙醇溶液+0.5 mL 過氧化氫溶液的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2013、SPSS22.0 軟件和GraphPadPrism 7軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、處理分析和作圖，結果取3 次試驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

不同浸提次數(shù)對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 不同浸提次數(shù)對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of different extraction times on polysaccharide extraction rate

由圖1 可知，隨著浸提次數(shù)的增加，多糖和β-葡聚糖提取率增加。浸提2 次時的提取率與3、4、5 次時相差不大，且與第1 次相比提取率有所提升，但提取次數(shù)的增加也會帶來原料成本的增加，因此綜合考慮選擇浸提2 次。

不同提取時間對多糖提取率的影響見圖2。

圖2 不同提取時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction time on polysaccharide extraction rate

圖2 表明，提取時間對灰樹花多糖和β-葡聚糖提取率的影響呈先增加后降低的趨勢。多糖提取率和β-葡聚糖提取率均隨著時間的增加而增長，在提取時間達到70 min 時，多糖提取率和β-葡聚糖提取率均達到最高，分別為19.243%和2.531 mg/g，而長時間的超聲波易使多糖的降解大于多糖的浸出，導致多糖含量降低。因此均勻設計試驗選取60 min～90 min 進一步優(yōu)化工藝參數(shù)。

不同提取溫度對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 表明，隨著提取溫度的升高，多糖含量逐漸上升，但過高的溫度易導致大分子多糖斷裂，影響多糖提取的增加量，因此多糖提取率降低。結果顯示，當待測樣品在室溫（26 ℃）條件下時，提取率最低；當提取溫度達到60 ℃時，多糖和β-葡聚糖提取率最高，分別為20.287%和2.816 mg/g，其中多糖提取率是室溫時的1.8 倍，β-葡聚糖提取率為室溫時的3.2 倍。因此均勻設計試驗選取40 ℃～70 ℃進一步優(yōu)化工藝參數(shù)。

圖3 不同提取溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of different extraction temperatures on polysaccharide extraction rate

2.2 均勻設計試驗結果與分析

2.2.1 試驗結果

均勻設計試驗方案結果處理與分析見表2。

表2 均勻設計試驗結果Table 2 Uniform experimental design and results

根據(jù)表2 各參數(shù)的多糖提取率和β-葡聚糖提取率試驗結果，分別經(jīng)SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行均勻設計二次回歸多項式逐步回歸分析，得到相應回歸模型Y1和Y2：

方差分析見表3、表4。

表3 Y1 方差分析Table 3 Y1 analysis of variance

表4 Y2 方差分析Table 4 Y2 analysis of variance

2.2.2 工藝驗證

按1.2.3 方法進行驗證試驗，選取上述最佳工藝參數(shù)進行提取，考慮實際操作情況，將多糖最佳超聲波輔助提取功率修正為500 W；將β-葡聚糖最佳超聲波輔助提取功率修正為450 W。多糖提取率分別為23.832%、23.023%和22.311%，平均值為23.055%；β-葡聚糖提取率分別為3.092、2.976、3.023 mg/g，平均值為3.030 mg/g；均與預測參數(shù)值接近，相對誤差分別為0.58%和1.013%，可知結果優(yōu)化后試驗結果準確，且重復性好。

2.3 抗氧化活性分析

物質的還原力越高，表明其抗氧化性越好[23]。不同濃度的灰樹花多糖組分的還原能力效果如圖4 所示。

圖4 多糖還原能力Fig.4 Polysaccharide reduction ability

由圖4 可知，樣品的還原能力隨著樣品濃度的增加而逐漸增強，當濃度達到2.5 mg/mL 時，樣品的OD700nm值為0.561±0.005，表明其抗氧化性效果明顯?；覙浠ǘ嗵浅煞诌€原能力低于陽性對照VC的還原能力。

EC50是指清除率為50%時物質的質量濃度，物質EC50值低于10 mg/mL 時，表明其抗氧化性良好[24]。不同濃度的灰樹花多糖組分對DPPH 自由基的清除效果如圖5 所示。

圖5 DPPH 自由基清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging ability

由圖5 可知，灰樹花多糖對DPPH 自由基清除能力隨樣品濃度的升高而增大。當樣品清除率為50 %時，其質量濃度為0.796 mg/mL，即EC50為0.796mg/mL，因此灰樹花多糖具有較好的DPPH 自由基清除能力，具備較好的抗氧化能力。

羥基的化學性質極為活潑，是對機體危害最大的自由基[25]。不同濃度的灰樹花多糖組分對羥自由基的清除效果如圖6 所示。

圖6 羥自由基清除能力Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging ability

由圖6 可知，樣品對羥自由基具備一定的清除能力，且清除率明顯高于陽性對照VC對羥自由基的清除效果。多糖樣品的清除能力隨濃度的增大而增大，呈量效關系。

3 結論

試驗對灰樹花多糖的提取工藝進行優(yōu)化研究，通過單因素試驗結合均勻設計試驗優(yōu)化了提取工藝，獲得最佳超聲波輔助提取工藝：浸提2 次，提取時間64 min，超聲波功率500 W，提取溫度43 ℃，水料比31∶1（mL/g），在此條件下，灰樹花多糖的提取率為23.055%；β-葡聚糖的提取工藝為：浸提2 次，提取時間74 min，超聲波功率450 W，提取溫度68 ℃，水料比28∶1（mL/g），在此條件下的提取率為3.030 mg/g；此外，對提取的灰樹花多糖進行了抗氧化活性研究。結果表明，灰樹花多糖具備一定的抗氧化活性，灰樹花多糖的還原力OD700mn值為0.561±0.005，DPPH 自由基清除率為58.27%，羥自由基的清除率為89.58%，其總還原力和DPPH 自由基清除率略低于對照組，但存在線性量效關系。

本試驗采用均勻設計法對灰樹花多糖超聲波提取工藝進行優(yōu)化，工藝優(yōu)化結果經(jīng)驗證，方法穩(wěn)定可行，提取時間耗時短，對儀器設備的要求低，節(jié)約成本的同時也簡化了流程，可為灰樹花多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學的數(shù)據(jù)參考。