熟地黃粗提物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用

劉瑩，劉垚杰，李麗維，周王誼，徐閻，王玥，徐詠全，王浩*

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457；2.天士力研究院，天津300410）

長時(shí)間暴露在強(qiáng)光下會(huì)加速視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激，導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷[1]。視網(wǎng)膜內(nèi)過量自由基的產(chǎn)生，是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生的重要因素[2]。王曉英等研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)光會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織中產(chǎn)生過量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）[3]，導(dǎo)致體內(nèi)氧化平衡體系失衡，從而導(dǎo)致視疲勞、白內(nèi)障和年齡相關(guān)性黃斑變性等眼部疾病的發(fā)生[4-5]。此外，WANG 等研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜氧化受損會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的過度表達(dá)，這也是導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷的重要因素[5]。

熟地黃，屬玄參科，是加工炮制而成的一種中藥材[6-7]。目前，已從熟地黃中分離出約70 種單體化合物，主要包括多糖、單糖、梓醇、水蘇糖和5-羥甲基糠醛等活性成分[6，8]。研究表明，水溶性多糖為熟地黃的主要活性成分，具有提高機(jī)體抗氧化力[9]、增強(qiáng)免疫力[10]、降血糖[11]、抗突變[12]和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖[13]等作用；熟地黃中水蘇糖含量約為30%，具有較強(qiáng)的抗氧化能力[14]。梓醇是熟地黃中的一種功能活性成分，屬于環(huán)烯醚萜單糖苷類，并且具有緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用[15]。除此以外，熟地黃中還包括甘露醇、維生素A 等其它抗氧化活性成分[16]。本研究以光損傷小鼠為模型，通過視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）和光學(xué)相干斷層成像（optical coherence tomography，OCT）以及抗氧化和炎癥相關(guān)視網(wǎng)膜生理指標(biāo)的檢測，探究熟地黃對視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用，以期為熟地黃開發(fā)緩解視疲勞保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

實(shí)驗(yàn)小鼠、基礎(chǔ)飼料：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；復(fù)方托吡卡胺滴眼液：參天制藥（中國）有限公司；氧氟沙星眼膏：沈陽興齊眼藥股份有限公司；SYBRGreen 試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司；Trizol：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

JS703C 分析天平：瑞士METTLER TOLEDO 公司；RETI-Port/Scan 21 型ERG 儀器：德國羅蘭公司；micronIV 型OCT 儀器：美國phoenix 公司；LSI20d-Ⅱ型LED 燈：深圳市愛圖仕影像器材有限公司；TES1330A數(shù)字照度計(jì)：臺(tái)灣泰仕電子工業(yè)公司；MyCycler 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、MyiQ2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀：美國Bio-Rad 公司；U-3900Hitachi 紫外分光光度計(jì)：日立科學(xué)儀器有限公司。

1.2 熟地黃粗提物

稱取熟地黃（符合2015 版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)），加入6 倍體積的蒸餾水提取，提取3 次，合并提取液，提取液經(jīng)濃縮得到水提物浸膏，再加入95%乙醇進(jìn)行醇沉，收集沉淀物并進(jìn)行干燥，制得熟地黃提取物棕色粉末（每克熟地黃提取物含熟地黃3.14 g）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性C57BL/6J 小鼠，6 周齡，體重（18±1）g，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0002，飼養(yǎng)于天津科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[（23±2）℃，相對濕度55%，明暗循環(huán)為12 h/12 h]。實(shí)驗(yàn)期間小鼠攝食和飲水自由。本研究的所有實(shí)驗(yàn)程序均按照天津科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)前對小鼠眼球進(jìn)行檢查，排除眼部疾病。經(jīng)過一周的適應(yīng)期后，小鼠被隨機(jī)分成4 組：正常（CON）組、模型（MOD）組、熟地黃低劑量（SDL）組、熟地黃高劑量（SDH）組，每組各12 只。其中，正常組和模型組給予0.2 mL 無菌生理鹽水灌胃，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，熟地黃低、高劑量組分別給予360、450 mg/kg bw 的劑量灌胃，每日一次，連續(xù)8 周。除正常對照組外，各組小鼠均在第9 周放入光照箱中進(jìn)行光照造模。

1.4 光損傷模型制備

采用自制光照箱造模，每只小鼠被單獨(dú)放置在由亞克力透明板制成的10 cm×10 cm×8 cm 小方格中，將光照器懸掛于小鼠頂部50 cm 處，垂直照射，并在與小鼠同一高度處懸掛一溫度計(jì)，實(shí)時(shí)監(jiān)測溫度，確保溫度維持在（23±2）℃范圍內(nèi)，排除溫度升高引起小鼠眼球光熱損傷的可能。為避免長時(shí)間光照而引起眼球表面脫水，光照前30 min 對小鼠眼球進(jìn)行涂抹眼藥處理。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用照度計(jì)將光照強(qiáng)度調(diào)整為（9 000±500）Lux，持續(xù)照射4 h，連續(xù)照射7 d，光照期間正常進(jìn)食與飲水。光照造模結(jié)束后，進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖和光學(xué)相干斷層成像等視網(wǎng)膜生理指標(biāo)檢測。

1.5 視網(wǎng)膜電圖檢測

小鼠暗適應(yīng)12 h 后，用5%的水合氯醛溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉，注射劑量為0.01 mL/g bw，待小鼠四肢無反應(yīng)并脊背無弓起現(xiàn)象后用0.1 mg/mL 硫酸阿托品滴眼液擴(kuò)張瞳孔。小鼠固定在平臺(tái)上，以與角膜表面接觸的鍍金絲環(huán)電極為活性電極，將電極插入眼睛附近的皮膚和尾部作為參考和接地導(dǎo)線，記錄3.0 b 波振幅。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程在紅光下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即對小鼠眼球表面涂抹氧氟沙星眼膏，防止眼球長時(shí)間干燥而引起小鼠眼球脫水。

1.6 光學(xué)相干斷層成像

小鼠腹腔注射5%水合氯醛溶液麻醉。待小鼠四肢無反應(yīng)且脊背無弓形后，將其放置在固定架上并滴加散瞳藥，然后將小鼠右眼球與鏡面緊貼，正確定位眼球位置后進(jìn)行觀察，獲得OCT 偽彩圖。比較各實(shí)驗(yàn)組小鼠右眼相應(yīng)的視網(wǎng)膜外核層（outer nuclear layer，ONL）厚度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速涂抹眼膏，防止眼球長時(shí)間暴露于空氣中引起眼球脫水。

1.7 視網(wǎng)膜組織氧化指標(biāo)檢測

參照陳春艷等的研究方法[17]，取各組小鼠眼球，在冰盤上分離視網(wǎng)膜組織并置于-80 ℃保存，供待檢測指標(biāo)SOD、GSH-Px、CAT 和MDA 使用。稱取視網(wǎng)膜組織，按料液比1∶9（g/mL）加入0.9%無菌生理鹽水，在冰水浴下用研磨器研磨成組織勻漿。4 ℃、2 500 r/min 離心15 min，取上清液備用。測定其余各步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）檢測視網(wǎng)膜中與炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平

使用Trizol 提取視網(wǎng)膜組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，并于-80 ℃保存。SYBRGreen 試劑盒檢測基因表達(dá)水平，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因，引物設(shè)計(jì)如表1 所示。反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 程序參照試劑盒具體說明。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x±s）表示，采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）評(píng)估各組間差異，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果分析

2.1 熟地黃粗提物對小鼠視網(wǎng)膜ERG 結(jié)果分析

應(yīng)用ERG 分析探討熟地黃粗提物對光誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜功能的影響。ERG 的振幅越高，說明小鼠眼球?qū)獾姆磻?yīng)敏感性越強(qiáng)。視網(wǎng)膜電生理3.0 b 波振幅見圖1。

圖1 視網(wǎng)膜電生理3.0 b 波振幅Fig.1 Retinal electrophysiology 3.0 b amplitude

如圖1 所示，與正常組相比，光損傷模型組小鼠的3.0 b 波振幅顯著降低（P＜0.01），用熟地黃粗提物干預(yù)后，能顯著抑制光誘導(dǎo)的b 波振幅的降低；與模型組相比，熟地黃低、高劑量組振幅分別升高了56.95%和73.18%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

表1 視網(wǎng)膜組織中相關(guān)基因引物序列Table 1 Related gene primer sequences in retinal tissue

2.2 熟地黃粗提物對小鼠視網(wǎng)膜OCT 結(jié)果分析

光學(xué)相干斷層掃描用于通過利用眼睛中不同組織的不同反射率來分析不同組織的結(jié)構(gòu)和厚度。視網(wǎng)膜ONL 層厚度比較見表2。

表2 視網(wǎng)膜ONL 層厚度比較Table 2 Comparison of retinal ONL thickness

從表2 可以看出，與正常組相比，模型小鼠視網(wǎng)膜的厚度明顯低于正常組（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，熟地黃干預(yù)的小鼠視網(wǎng)膜ONL 層厚度高于模型小鼠，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.3 熟地黃粗提物對小鼠視網(wǎng)膜中抗氧化酶活力的影響

強(qiáng)光損傷導(dǎo)致過量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，并破環(huán)內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)，加速氧化應(yīng)激的發(fā)生。熟地黃粗提物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織SOD、GSH-Px、CAT 活力及MDA 含量的影響見圖2。

圖2 熟地黃粗提物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織SOD、GSH-Px、CAT 活力及MDA 含量的影響Fig.2 Effects of crude extracts from Rehmannia glutinosa on activity of SOD，GSH-Px，CAT and content of MDA in retinal tissues of light-damaged mice

如圖2 所示，強(qiáng)光應(yīng)激后，小鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)SOD、GSH-Px 和CAT 活力均極顯著降低（P＜0.01），MDA 含量明顯升高（P＜0.01）。熟地黃粗提物干預(yù)可以明顯提高視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH-Px 和CAT 的活力，顯著降低MDA 水平。

2.4 熟地黃粗提物對小鼠視網(wǎng)膜中促炎基因表達(dá)水平的影響

促炎細(xì)胞因子的表達(dá)與視網(wǎng)膜光氧化損傷有關(guān)[5]，因此，試驗(yàn)研究了MCP-1、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達(dá)水平。熟地黃粗提物對小鼠視網(wǎng)膜中MCP-1、TNFα 和IL-1β mRNA 表達(dá)的影響見圖3。

圖3 熟地黃粗提物對小鼠視網(wǎng)膜中基因MCP-1、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of crude extract of Rehmannia glutinosa on mRNA expression of genes MCP-1，TNF-α and IL-1β mRNA in retina of mice

由圖3 可知，模型組MCP-1、TNF-α 和IL-1β mRNA 相對表達(dá)量均顯著高于正常組；與模型組相比，低、高劑量熟地黃提取物在不同水平上抑制了TNFα、MCP-1 和IL-1β 的表達(dá)（P＜0.05），且熟地黃粗提物高劑量組的抑制作用優(yōu)于低劑量組。

3 結(jié)論與討論

熟地黃已經(jīng)有數(shù)千年的食用歷史。劉培建等研究表明，熟地黃具有抗衰老和抗氧化等多種藥理特性[18]。REN 等研究表明，熟地黃水提物可通過激活Nrf2 信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)百草枯誘導(dǎo)的小鼠糖代謝紊亂[19]。大量研究表明，熟地黃與枸杞、菟絲子等中藥復(fù)配具有緩解視疲勞[20]和保護(hù)視網(wǎng)膜[21]的功效。此外，熟地黃水提物可抑制小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α 和IL-1β 的產(chǎn)生[16]。熟地黃具有良好的抗氧化和抗炎能力。視功能受損與感光細(xì)胞丟失有關(guān)，在光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷模型中，強(qiáng)光照射降低了ERG 3.0 b 波振幅，以及ONL 層的厚度，這與以前的報(bào)道一致[22]。

內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)可在光損傷后被激活。過量的ROS 產(chǎn)生破環(huán)了這種防御機(jī)制，并加速氧化應(yīng)激的發(fā)生。SOD、GSH-Px 和CAT 是抗氧化防御系統(tǒng)的重要酶系，它們能清除體內(nèi)的活性氧自由基[23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熟地黃粗提物可以提高視網(wǎng)膜組織中SOD、GSHPx 和CAT 的活力，并且熟地黃低、高劑量組中MDA含量均顯著低于模型組。由此可以說明，熟地黃粗提物能夠提高機(jī)體的抗氧化能力。

內(nèi)源性抗氧化酶的減少導(dǎo)致視網(wǎng)膜的光氧化應(yīng)激，從而增加促炎癥細(xì)胞因子的水平[24]。ROS 是促炎性細(xì)胞因子（如MCP-1、TNF-α 和IL-1β）釋放的強(qiáng)烈刺激物，它們損傷視網(wǎng)膜細(xì)胞，在視網(wǎng)膜變性的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[24]。通過對視網(wǎng)膜組織中與促炎相關(guān)基因表達(dá)水平的分析，可以看出光損傷導(dǎo)致MCP-1、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達(dá)水平顯著升高，給予熟地黃粗提物干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)這種情況。

綜上所述，熟地黃粗提物可以提高視網(wǎng)膜組織的抗氧化能力并調(diào)控促炎相關(guān)基因的表達(dá)，從而對氧化應(yīng)激引起的視網(wǎng)膜損傷和視疲勞具有緩解作用。為進(jìn)一步探究熟地黃對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用，可在后面的研究對熟地黃成分進(jìn)行進(jìn)一步分離，以期為視力保護(hù)和緩解視疲勞產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。