研磨對(duì)豌豆分離蛋白應(yīng)用特性的影響

劉巧珍，代養(yǎng)勇*，侯漢學(xué)，王文濤，丁秀臻，張慧，董海洲

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018；2.山東省糧食加工技術(shù)工程技術(shù)研究中心，山東泰安271018）

目前很多研究表明：過多攝入動(dòng)物蛋白會(huì)增加冠心病等的患病概率，導(dǎo)致低脂、低熱量的植物源蛋白的需求增大[1-2]。目前我國(guó)豌豆加工的重點(diǎn)是制備豌豆淀粉，豌豆蛋白為其副產(chǎn)品[3]。由于豌豆蛋白在加工過程中易變性，持水性差，起泡性和乳化性也不太理想，導(dǎo)致豌豆蛋白研究與開發(fā)不足，隨之絕大部分豌豆蛋白作為飼料，造成了蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)[4-5]。因此，需要改善豌豆蛋白的應(yīng)用特性，擴(kuò)大其在食品工業(yè)的應(yīng)用。

目前，蛋白性質(zhì)主要是通過物理法、化學(xué)法和酶法等方法來改善[6]。其中，物理法簡(jiǎn)單、環(huán)保，且安全性高。研磨作為一種有效的物理改性手段，可以制備一些新材料。研磨通過機(jī)械力（摩擦、撞擊等）克服顆粒的內(nèi)聚力，使物料破碎；同時(shí)，研磨過程中產(chǎn)生的反復(fù)高能量沖擊造成機(jī)械力化學(xué)效應(yīng)，會(huì)引起物料性質(zhì)的變化[7-8]。在食品加工領(lǐng)域，學(xué)者多數(shù)采用濕法來改善蛋白性質(zhì)。吳迪等[9]采用高壓均質(zhì)改善櫛孔扇貝蛋白乳化特性。孫靖辰等[10]則利用超聲提高米糠蛋白的溶解度、凝膠性等功能特性。關(guān)于干法改善蛋白性質(zhì)的報(bào)道很少，干法處理后無需干燥、能耗低，比濕法處理更易在工業(yè)中推廣。

本文采用研磨技術(shù)干法處理豌豆分離蛋白，研究研磨后豌豆分離蛋白顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)、親水基團(tuán)、疏水基團(tuán)、持水性、持油性、泡沫特性、乳化性能、凝膠性能等結(jié)構(gòu)與應(yīng)用特性的變化，并通過分析親水（油）性與應(yīng)用特性的相關(guān)性，探討研磨對(duì)豌豆分離蛋白顆粒的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

豌豆分離蛋白：雙塔食品有限公司；尼羅紅：阿拉丁工業(yè)公司；一級(jí)大豆油：市售；溴化鉀（KBr）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：西格瑪化學(xué)公司；所用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

ST-Q200 行星式球磨機(jī)：北京旭鑫儀器設(shè)備有限公司；JSM-6510LV10800 鎢燈絲掃描電子顯微鏡：日本JEOL 公司；JC2000C1 型接觸角測(cè)量?jī)x：上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司；TG1650-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-8000A 紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；TA.XTC 質(zhì)構(gòu)儀：上海保圣實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；T18 digital Ultra-T高速分散器：德國(guó)IKA 公司。

1.3 豌豆蛋白研磨處理

用研磨機(jī)研磨豌豆分離蛋白。其中球與樣品質(zhì)量比為5∶1。機(jī)器在室溫25 ℃下，以200 r/min 的轉(zhuǎn)速運(yùn)行。其中每隔2.5 min 停止儀器運(yùn)行1 h，并將研磨罐水浴冷卻，以減少研磨過程中熱量的產(chǎn)生。研磨結(jié)束后樣品放入自封袋中，4 ℃保存。

1.4 掃描電鏡

使用離子噴射器在樣品表面鍍一層15 nm 左右的金箔后（豌豆蛋白樣品經(jīng)過離子濺射儀噴金后），在工作距離5.1 mm，加速電壓6 kV，放大倍數(shù)1 000 條件下通過掃描電鏡進(jìn)行觀察并拍攝[11]。

1.5 接觸角的測(cè)定

取適量豌豆蛋白樣品用壓片機(jī)壓成光滑的薄片，選用去離子水、大豆油作為潤(rùn)濕性試驗(yàn)液體，通過接觸角測(cè)定儀采用懸滴法依次測(cè)定液滴與樣品表面的接觸角。

1.6 應(yīng)用特性的測(cè)定

1.6.1 持水性的測(cè)定

持水性根據(jù)耿軍鳳等的方法[12]，略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取0.1 g 豌豆蛋白樣品置于離心管內(nèi)后加入20 mL 蒸餾水，用玻璃棒將其攪均，隨后在80 ℃水浴中保溫60 min，取出冷卻。將冷卻至室溫（25℃）的樣品于3 000 r/min 下離心30 min，倒去上清液。測(cè)定此刻離心管加沉淀物的質(zhì)量。持水性計(jì)算公式如下。

式中：W0為豌豆蛋白質(zhì)量，g；W1為豌豆分離蛋白加離心管質(zhì)量，g；W2為離心后離心管加沉淀物質(zhì)量，g。

1.6.2 持油性的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2.0 g 豌豆蛋白樣品置于離心管內(nèi)加入10 mL 大豆油，用玻璃棒將其攪均，靜置30 min 后于3 000 r/min 離心30 min，倒去上清液。測(cè)定離心管與沉淀物的質(zhì)量。持油性計(jì)算公式如下[13]。

式中：W0為豌豆蛋白質(zhì)量，g；W1為豌豆分離蛋白加離心管質(zhì)量，g；W2為離心后離心管加沉淀物質(zhì)量，g。

1.6.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

配制3%的豌豆蛋白質(zhì)溶液，用氫氧化鈉或者鹽酸調(diào)節(jié)樣品pH 值至7.0，在30 ℃水浴下保溫10 min，然后用高速分散器在5 000 r/min 下均質(zhì)3 min 后迅速倒入量筒中。記錄均質(zhì)前溶液的體積，均質(zhì)結(jié)束時(shí)泡沫的體積，均質(zhì)結(jié)束10 min 的泡沫體積。起泡性（foaming characteristic，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S）[14]計(jì)算公式如下。

式中：V 為均質(zhì)前溶液的體積，mL；V0為均質(zhì)結(jié)束時(shí)泡沫的體積，mL；V1為均質(zhì)結(jié)束10 min 的泡沫體積，mL。

1.6.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

采用比濁法測(cè)定乳化特性。配制1 mg/mL 的待測(cè)樣品以9∶1 的質(zhì)量比加入大豆油，經(jīng)高速分散器于10 000r/min 下均質(zhì)2min，分別在攪拌后0min 和10min時(shí)從測(cè)試管底部取樣100 μL，用質(zhì)量濃度為0.1 g/L 的SDS 稀釋50 倍后，測(cè)定樣品在500 nm 處的吸光度值，以SDS 溶液做空白[15]。乳化性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）的計(jì)算公式如下。

式中：DF 為稀釋倍數(shù)；C 為樣品濃度，g/mL；φ 為光程，φ=1 cm；θ 為乳液中油相所占比例；A0為0 min時(shí)測(cè)定的吸光度；A10為10 min 時(shí)測(cè)定的吸光度；t 為時(shí)間，t=10 min。

1.6.5 凝膠性的測(cè)定

將配制17%豌豆蛋白溶液放入磁力攪拌器中以1 500 r/min 攪拌60 min，隨后在90 ℃下水浴保溫30 min。取出冷卻在4 ℃冷藏過夜，制得豌豆蛋白凝膠[16]。在質(zhì)構(gòu)儀上測(cè)定其質(zhì)構(gòu)特性[17]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用Origin 軟件進(jìn)行圖表繪制。采用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 差異顯著性分析，以P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 研磨處理時(shí)間對(duì)豌豆分離蛋白質(zhì)顯微結(jié)構(gòu)的影響

豌豆蛋白的掃描電鏡圖見圖1。

圖1 豌豆蛋白的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrograph of pea protein

由圖1 中可見，研磨處理后的豌豆分離蛋白形貌特征發(fā)生了明顯變化。豌豆分離蛋白原樣完整，表面平滑，粒徑較大，且分布比較集中，與XIONG 等[18]研究一致。當(dāng)研磨2.5 min～7.5 min 時(shí)，部分豌豆分離蛋白破碎，顆粒粒徑開始變小，表面開始變得不平滑，部分顆粒表面黏附有碎片形成了聚集體（圖1 D）。隨著研磨時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，顆粒粒徑明顯變小，顆粒碎片呈現(xiàn)出不規(guī)則、無序的形態(tài)，顆粒表面顯著粗糙、質(zhì)地也明顯疏松。對(duì)蛋白的破壞越嚴(yán)重，碎片呈現(xiàn)出各種不規(guī)則、無序的形態(tài)，顆粒表面變粗糙，質(zhì)地變得疏松。

2.2 研磨處理時(shí)間對(duì)豌豆分離蛋白質(zhì)接觸角的影響

豌豆蛋白片表面的水接觸角光學(xué)照片見圖2，豌豆蛋白片表面的油接觸角光學(xué)照片見圖3。

蛋白質(zhì)的親水性是指蛋白對(duì)水的親和能力，表面被水所潤(rùn)濕的能力[19]。蛋白質(zhì)的親/疏水性、潤(rùn)濕性，對(duì)蛋白質(zhì)的應(yīng)用特性有重要的指導(dǎo)意義。本文通過去離子水、大豆油在豌豆蛋白表面形成的接觸角來表征親/疏水性、潤(rùn)濕性。

圖2 豌豆蛋白片表面的水接觸角光學(xué)照片F(xiàn)ig.2 Optical photo of water contact angle on the surface of pea protein sheet

圖3 豌豆蛋白片表面的油接觸角光學(xué)照片F(xiàn)ig.3 Optical photo of oil contact angle on the surface of pea protein sheet

結(jié)合圖2、圖3 可看出，研磨后蛋白質(zhì)的親水性增強(qiáng)，親油性降低。隨著研磨時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的親水性呈現(xiàn)出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在研磨時(shí)間為7.5 min 時(shí)，蛋白質(zhì)的親水性達(dá)到最大。這主要是由于短時(shí)間地研磨下，蛋白發(fā)生了團(tuán)聚、折疊現(xiàn)象（圖1 D），減少了蛋白顆粒表面和間隙中的空氣含量，同時(shí)蛋白質(zhì)內(nèi)部的部分極性基團(tuán)暴露出來，導(dǎo)致親水性得到了提高[20]。而當(dāng)研磨時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，顆粒結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞（圖1G），蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中大量疏水基團(tuán)暴露，同時(shí)蛋白粒徑的降低使得空氣容易在蛋白質(zhì)的表面形成氣膜，這導(dǎo)致了水對(duì)蛋白質(zhì)的潤(rùn)濕性減弱，所以這時(shí)蛋白親水性減弱[21]。

2.3 研磨處理時(shí)間對(duì)豌豆分離蛋白質(zhì)持水性的影響

研磨時(shí)間對(duì)豌豆蛋白持水性的影響見圖4。

圖4 研磨時(shí)間對(duì)豌豆蛋白持水性的影響Fig.4 The effect of grinding time on the water retention of pea protein

持水性是將水截留在組織內(nèi)的能力[22]。由圖4 可知，研磨處理時(shí)間在2.5 min～7.5 min 時(shí)，蛋白質(zhì)的持水性隨著研磨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。研磨處理7.5 min時(shí)，豌豆分離蛋白的持水性達(dá)到最大為4.095 g/g，比原樣升高了37.4%。這可能是因?yàn)?，短時(shí)間的研磨處理使蛋白分子伸展，極性基團(tuán)暴露于表面，親水性增加，水分子能夠穩(wěn)定的存在于蛋白結(jié)構(gòu)中[23]。但是研磨超過7.5 min 時(shí)持水性降低，這是由于長(zhǎng)時(shí)間研磨導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，降低了蛋白質(zhì)與水結(jié)合的有效性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的持水性下降。

2.4 研磨處理時(shí)間對(duì)豌豆分離蛋白質(zhì)持油性的影響

研磨時(shí)間對(duì)豌豆蛋白持油性的影響見圖5。

圖5 研磨時(shí)間對(duì)豌豆蛋白持油性的影響Fig.5 The effect of grinding time on the oil retention of pea protein

持油性是指對(duì)油吸附并將油截留在組織內(nèi)部的能力[24]。由圖5 可知，隨著研磨時(shí)間的延長(zhǎng)，豌豆分離蛋白的持油性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在研磨時(shí)間為7.5 min 時(shí)，蛋白質(zhì)的持油性達(dá)到最大。這可能是因?yàn)槎虝r(shí)間研磨，蛋白質(zhì)極性基團(tuán)暴露導(dǎo)致部分疏水基團(tuán)內(nèi)埋，雖然親油性下降，但油滴可以穩(wěn)定的存在于疏水基團(tuán)的空隙中[25]。隨后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，與油結(jié)合的緊密性下降，持油性降低[26]。

2.5 研磨處理時(shí)間對(duì)豌豆分離蛋白質(zhì)起泡特性的影響

良好的起泡特性可滿足食品加工的特殊需要，如蛋糕、啤酒等的加工。起泡性指在攪打的過程中，形成氣泡的能力[27]。起泡穩(wěn)定性則指泡沫不被破損的能力[28]。研磨時(shí)間對(duì)豌豆蛋白溶液起泡性（FC）及起泡穩(wěn)定性（FS）的變化影響如圖6 所示。

圖6 研磨時(shí)間對(duì)豌豆蛋白起泡特性的影響Fig.6 The effect of grinding time on the foaming characteristics of pea protein

由圖6 可知，隨著研磨時(shí)間的增大，豌豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，其中研磨時(shí)間為7.5 min 時(shí)，豌豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均達(dá)到最大。原因是此時(shí)間內(nèi)蛋白分子發(fā)生適度伸展，蛋白分子間能形成比較穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和界面膜，同時(shí)蛋白質(zhì)與水相互作用增強(qiáng)，使得蛋白的起泡性不斷增加[29]。當(dāng)研磨時(shí)間大于7.5 min 時(shí)，豌豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性開始下降，這是由于豌豆蛋白變性嚴(yán)重，蛋白質(zhì)分子間相互作用減弱；同時(shí)大量疏水基團(tuán)的暴露使蛋白質(zhì)親水、持水性下降，產(chǎn)生的泡沫界面膜缺乏韌性容易破裂，導(dǎo)致豌豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性開始下降[30]。

2.6 研磨處理時(shí)間對(duì)豌豆分離蛋白乳化性能的影響

研磨時(shí)間對(duì)豌豆蛋白乳化性能的影響見圖7。

圖7 研磨時(shí)間對(duì)豌豆蛋白乳化性能的影響Fig.7 The effect of grinding time on the emulsification of pea protein

乳化性能是蛋白質(zhì)重要的功能特性之一。乳化性（EAI）表示蛋白乳液的形成能力，乳化穩(wěn)定性（ESI）是蛋白乳液保持穩(wěn)定的能力[31-32]。由圖7 可見，研磨處理能顯著提高豌豆分離蛋白的乳化性能，其中研磨時(shí)間為7.5 min 時(shí)具有最好的乳化性能，EAI 和ESI 達(dá)到17.14 m2/g 和122.33 min，分別比原樣提高了79.10%和49.42%。結(jié)果表明：適當(dāng)?shù)难心ヌ幚頃?huì)使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)適當(dāng)分散，蛋白質(zhì)分子適度伸展，部分內(nèi)埋的極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)在油水界面更易吸附，蛋白質(zhì)吸附到油-水分界處的速率得到提高，因此提高了豌豆分離蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性[33]。但長(zhǎng)時(shí)間研磨后，蛋白質(zhì)維持穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)的鍵遭到破壞，蛋白質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重變性，降低了蛋白質(zhì)膜與油水界面的吸附力，使豌豆分離蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性下降[34]。在食品加工過程中，常常會(huì)出現(xiàn)乳化性不理想的問題，因此經(jīng)過研磨處理的豌豆分離蛋白在食品行業(yè)中有較大的優(yōu)勢(shì)。

2.7 研磨處理時(shí)間對(duì)豌豆分離蛋白質(zhì)凝膠性能的影響

研磨時(shí)間對(duì)豌豆蛋白凝膠性能的影響見表1。

表1 研磨時(shí)間對(duì)豌豆蛋白凝膠性能的影響Table 1 Effect of grinding time on pea protein gel properties

受到外力作用變形除去作用力時(shí)，能恢復(fù)原來形狀的性質(zhì)為彈性，在一定時(shí)間內(nèi)的回復(fù)能力為回復(fù)性[35]。

由表1 可知，豌豆分離蛋白凝膠的彈性、回復(fù)性表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。隨著研磨時(shí)間延長(zhǎng)，凝膠的彈性、回復(fù)性先增大后減小。研磨時(shí)間為7.5 min 時(shí)，凝膠的彈性、回復(fù)性達(dá)到最大。出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因是研磨時(shí)間的增大，使得蛋白質(zhì)分子伸展，內(nèi)埋基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用增加，促進(jìn)形成凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，彈性增大，回復(fù)性增大[36]。當(dāng)研磨時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，隨之維持穩(wěn)定凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的鍵被破壞，因此彈性、回復(fù)性降低。

2.8 相關(guān)性分析

親水性、親油性與蛋白應(yīng)用特性相關(guān)性分析見表2。

表2 親水性、親油性與蛋白應(yīng)用特性相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of hydrophilicity，lipophilicity and protein application characteristics

相關(guān)性分析表明，親水性對(duì)豌豆分離蛋白的應(yīng)用特性影響趨勢(shì)一致，呈正相關(guān)，其中持水性、持油性、乳化特性、凝膠彈性表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)。親水性對(duì)豌豆分離蛋白應(yīng)用特性的影響表現(xiàn)為親水性越高，應(yīng)用特性越好。親油性對(duì)豌豆分離蛋白的應(yīng)用特性影響趨勢(shì)一致，呈負(fù)相關(guān)，其中乳化性表現(xiàn)出極顯著負(fù)相關(guān)，持油性表現(xiàn)出了顯著負(fù)相關(guān)。表明親油性對(duì)豌豆分離蛋白應(yīng)用特性的影響表現(xiàn)為親油性越好，應(yīng)用特性越差。

3 結(jié)論

研磨顯著提高了豌豆分離蛋白的親水性、持水性、持油性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性等應(yīng)用特性；且乳化性能、凝膠性能也得到不同程度的提高。其中研磨7.5 min 時(shí)豌豆分離蛋白應(yīng)用特性最佳。這些發(fā)現(xiàn)將有助于豌豆蛋白穩(wěn)定乳液產(chǎn)品的研發(fā)。

在研磨作用下，豌豆蛋白的顆粒出現(xiàn)了聚集、團(tuán)聚等類似機(jī)械力化學(xué)效應(yīng)的現(xiàn)象。今后可將研磨與低劑量變性劑結(jié)合共同改性蛋白，提高其應(yīng)用特性，開發(fā)更多的高性能豌豆分離蛋白產(chǎn)品。