富集有核細胞法制備肺癌胸腔積液細胞塊中EGFR基因突變的檢測*

劉萌萌，孔天東，魏 麗，劉 鵬，劉興華，喬森焱

(鄭州市第三人民醫(yī)院病理科，鄭州 450000)

原發(fā)性肺癌是導(dǎo)致人類死亡最主要的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率較高，嚴重危害人類的身體健康。非小細胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)占原發(fā)性肺癌的80%～85%，且5 a生存率小于15%[1]，30%～40%的患者就診時已屬于局部晚期或已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[2]。近年來隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，腫瘤發(fā)病機制在細胞及分子水平上有了進一步認識，NSCLC患者存在表皮生長因子受體(EGFR)突變，應(yīng)用表皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKI)治療NSCLC取得了一定療效，為失去手術(shù)機會或不能耐受手術(shù)的患者提供了新的有效治療手段[2]。但是，由于晚期肺癌患者往往已經(jīng)失去手術(shù)機會，獲取病理診斷及指導(dǎo)治療的腫瘤組織標本難度較大，因此尋求對患者無損傷且能獲取有效腫瘤標本的途徑，對明確病理診斷、指導(dǎo)后續(xù)治療及判斷預(yù)后十分重要。在實際工作中，約15%的初診患者及10%～50%晚期肺癌患者常并發(fā)胸腔積液，尤其是外周型腺癌患者[3-4]，人們可以利用胸腔積液細胞離心沉渣來獲取腫瘤細胞，用于腫瘤的診斷和治療，但是傳統(tǒng)的沉渣包埋由于大量的紅細胞及炎癥細胞致使有效的腫瘤細胞量較少，不能滿足腫瘤的診斷和治療，更無法滿足基因檢測的需要。本研究應(yīng)用富集有核細胞層沉淀法制備胸腔積液細胞沉渣，探討其應(yīng)用在腫瘤診斷、分子生物學檢測中的意義。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2015年1月—2019年12月于鄭州市第三人民醫(yī)院診治的NSCLS伴惡性胸腔積液患者116例,其中男45例,女71例,年齡38～81歲,中位年齡61歲；吸煙45例，不吸煙71例；病理類型：腺癌83例，非腺癌33例。

1.2 儀器與試劑 Nano Drop 2000分光光度計(美國Thermo Scientific公司)；ABI 7500熒光PCR儀，萊卡自動免疫組化機。通用型萊卡二抗檢測試劑盒(萊卡公司)；一抗Syn、CD56、P40、CK7、Napsin-A、TTF-1、E-Cadherin、CR及WT-1均由福州邁新生物制劑有限公司提供(即用型抗體)；FFPE DNA提取試劑盒及人類EGFR基因突變檢測試劑盒由廈門艾德公司提供。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法 (1)富集有核細胞層沉淀法胸腔積液細胞沉渣制備：按參考文獻[5-6]進行，取60 mL胸腔積液標本，倒入尖底離心管中，以14 000 r·min-1離心15 min；用移液器將上清液和紅細胞層之間的白細胞層移至新的尖底離心管內(nèi)后，加入體積分數(shù)為4%的甲醛水溶液6 mL，吹打均勻，若細胞量少，可以按以上方法再次制備有核細胞層，靜置30 min，以2 000 r·min-1離心5 min，去上清，質(zhì)量分數(shù)0.45%的低滲生理鹽水加至50 mL，加入0.5 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的冰醋酸，靜置5 min，以3 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入體積分數(shù)95%乙醇靜置20 min，棄上清，取沉渣用濾紙包裹，常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片(厚3～4 μm)。沉淀法制備的細胞片及石蠟切片進行常規(guī)HE染色，顯微鏡觀察是否有癌細胞存在。(2)胸腔積液細胞沉渣的免疫組化檢測方法：采用全自動免疫組化機進行，主要步驟：切片脫蠟至水，在室溫下3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶30 min；一抗室溫孵育24 min；標記二抗室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封固。PBS代替一抗為空白對照，用已知陽性的組織作為陽性對照。(3)ARMS 法檢測 EGFR 基因突變：①標本采集與DNA提取、濃度及質(zhì)量的檢測：細胞塊標本切片厚5 μm，數(shù)量≥10張。病理切片直接用干凈的鑷子轉(zhuǎn)移至潔凈的1.5 mL 離心管中。應(yīng)用石蠟包埋組織(forma1in fixed and paraffin embedded tissues，F(xiàn)FPE)樣品 DNA 提取試劑盒(離心柱型)按照說明書進行DNA提取，DNA樣本經(jīng)Nano Drop 2000分光光度計定量，DNA濃度≥2 ng·μL-1，DNA和蛋白質(zhì)含量的比值(OD260/OD280)在1.6～2.0，否則視為不合格DNA 樣本。②采用突變特異性ARMS法，ABI7500熒光PCR儀，應(yīng)用廈門艾德生物公司的人類EGFR 基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)，檢測EGFR基因18～21外顯子的7種熱點突變，分別為18外顯子(G719x)、19外顯子缺失、21外顯子(L858R及L861Q)及20外顯子(T790M、S768I及插入)。實驗操作按照試劑盒說明書進行：向42.3 μL待測樣品DNA中加入2.7 μLTaq酶，混勻后取5 μL加入8聯(lián)管，并進行程序擴增，60 ℃時收集熒光信號。

1.3.2 結(jié)果判定 免疫組織化學結(jié)果的判定為在高倍鏡下觀察靶細胞是否陽性。為避免誤差，分別由兩名高年資病理診斷醫(yī)師雙盲判定結(jié)果。陽性著色部位：NapsinA、CK7、CR及Syn為細胞膜/胞質(zhì)；WT-1、TTF-1及P40為細胞核；E-Cadherin為胞膜/胞質(zhì)；CD56為胞膜。明確肺腫瘤的組織類型。EGFR的突變結(jié)果判斷:實驗步驟按說明書進行,每次實驗均設(shè)定對照及陽性對照，以陽性對照及內(nèi)控結(jié)果作為參照,確定各個樣品反應(yīng)管的突變Ct值及外控Ct值。ΔCt值=突變Ct值-外控Ct值。根據(jù)突變Ct值,把樣品檢測結(jié)果分為陰性、弱陽性及強陽性。陰性：Ct≥28；陽性：Ct<26；可疑陽性：26≤Ct<28。另外需計算ΔCt值,當ΔCt<10,為突變陽性,反之則為陰性。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測 應(yīng)用免疫組化檢測富集有核細胞層沉淀法制備的肺癌患者胸腔積液細胞沉渣塊，明確腫瘤組織類型：CK7、NapsinA及TTF-1陽性明確診斷為肺腺癌83例，P40陽性診斷為肺鱗狀細胞癌27例，其他類型6例。

2.2 EGFR 基因在肺癌組織類型中的突變情況 在116 例NSCLC標本中應(yīng)用ARMS法檢測EGFR基因突變，共檢測出59 例EGFR基因突變,陽性率為50.86% (59/116)。其中83例肺腺癌患者中48例存在EGFR基因突變，突變率為57.83%，33例非腺癌患者中11例存在突變，突變率為33.33%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。59例EGFR基因突變中，19外顯子缺失27例(45.76%)，21外顯子(L858R 及L861Q)突變25例(42.37%)，19外顯子缺失和21外顯子L858R 雙突變5例(8.47%),18外顯子(G719x)突變2例(3.40%)，未檢測到20外顯子(T790M、S768I及插入)突變。

表1 NSCLC組織類型與EGFR基因突變間的關(guān)系

2.3 EGFR基因突變與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 116例NSCLC患者中，59例存在EGFR基因突變，其中女性陽性率高于男性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；59例基因突變患者中，不吸煙患者陽性率高于吸煙患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；≤66歲患者與>66歲患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 NSCLS患者一般資料與EGFR基因突變間的關(guān)系

3 討論

原發(fā)性肺癌的發(fā)病率占我國十大惡性腫瘤之首,且病死率多年來居高不下[1]。NSCLC中30%～40%患者就診時已屬于局部晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機會。由于多數(shù)老年患者就診時已無法手術(shù)或無法耐受手術(shù)，患者的支氣管鏡取材標本量少或因某些腫瘤解剖位置及身體的基礎(chǔ)疾病而不適合手術(shù)或穿刺、細針及粗針穿刺活檢風險大、反復(fù)取材患者耐受程度低等原因，獲取診斷及指導(dǎo)治療的腫瘤組織難度較大，影響了腫瘤的明確診斷和后續(xù)治療。但由于15%的初診患者及10%～50%晚期患者常并發(fā)胸腔積液，尤其是外周型腺癌患者[3]，為肺癌的診斷和治療提供了新的標本獲得途徑。

胸腔積液沉渣包埋可為基因檢測提供有效的標本來源[7-8]。孟加榕等[9]研究證實，胸腔積液離心的沉淀細胞塊和腫瘤組織的EGFR基因突變具有較高一致性；趙士偉等[10]研究表明，對失去手術(shù)機會而難以獲得組織標本的晚期NSCLC患者，可應(yīng)用ARMS方法選擇胸腔積液細胞塊標本篩查EGFR基因突變；丌崇東等[11]研究也顯示，細胞塊的NSCLC患者EGFR基因突變率略高于組織塊，提示具有轉(zhuǎn)移性的NSCLC患者有更高的EGFR基因突變率。但是和組織標本相比，胸腔積液中的腫瘤細胞數(shù)量相對偏低，導(dǎo)致獲取的DNA濃度少，推測可能在制備細胞塊的過程中，標本經(jīng)中性福爾馬林溶液的固定造成核酸與蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，增加了DNA提取的難度；在浸蠟和包埋過程中又造成DNA片段化，同時又增多了核酸的甲基化修飾，這些原因降低了DNA的提取率。另外，胸腔積液中含有大量的紅細胞，在離心沉淀后，使腫瘤細胞密度相對偏小，這也導(dǎo)致DNA提取的濃度偏低。因此，尋求新的細胞沉渣包埋的方式，得到有效的標本是首要解決的問題。2017年禹樂等[5]采用富集有核細胞層沉淀法制備細胞沉渣，在本實驗中采用并優(yōu)化了該方法，利用高速離心對不同密度的細胞進行分離，同時使用冰醋酸溶解部分紅細胞，制備細胞沉渣塊，殘存的紅細胞位于離心管的最底層，有核細胞的密度次之，介于紅細胞層與上清液之間，這樣制備的細胞沉渣塊中因紅細胞較少而背景清楚，腫瘤細胞分布均勻，成團脫落的腫瘤細胞組織結(jié)構(gòu)保存較完整，腫瘤細胞核漿對比清晰，染色清晰，滿足了病理診斷及分子病理的相關(guān)檢測所需要的標本量，并獲得了較滿意的結(jié)果。

該技術(shù)對腫瘤后續(xù)進行基因突變檢測或測序工作提供了強有力的支持。EGFR基因突變是EGFR-TIK治療的理想靶點及療效預(yù)測指標[12]，尤其對晚期NSCLC患者，EGFR-TIK已經(jīng)成為此類疾病的一線治療方案[4]。在肺癌中，EGFR總突變率為20%～45%，其中19外顯子、21外顯子突變率為85%～90%。亞洲非吸煙女性患者幾乎都有EGFR基因19外顯子的突變[13]，EGFR基因20外顯子的突變率為1.6%(占EGFR所有突變類型的9%)；約50%的NSCLC患者可產(chǎn)生耐藥性，由第20外顯子上的T790M位點發(fā)生突變引起；第21外顯子的位點突變率為25%～33%，主要為L858R，這與厄洛替尼、阿法替尼的用藥敏感性相關(guān)[14]，但較19外顯子突變的患者敏感性偏低。本實驗中116例NSCLC細胞沉渣包埋組織塊標本中應(yīng)用ARMS法檢測的EGFR基因突變陽性率為50.86%，略高于以往的研究，可能與有核細胞層沉淀法制備細胞沉渣塊有效消除了背景中的紅細胞及纖維性蛋白成分，從而提高了腫瘤細胞的密度，同時和胸腔積液中癌細胞的EGFR突變率高于原發(fā)腫瘤有關(guān)[15]，也可能與本組病例中腺癌患者所占比率較大有關(guān)。EGFR突變中，存在19外顯子缺失、21外顯子(L858R及L861Q)突變和18外顯子(G719x)突變，未檢測到20外顯子(T790M、S768I及插入)突變。在NSCLC組織學類型中，肺腺癌的EGFR突變率高于非腺癌的突變率，和楊新等[15]報道的肺腺癌EGFR基因的突變率基本一致。在臨床特征方面，女性較男性EGFR基因突變率高；不吸煙患者較吸煙患者基因突變率高；年齡差異不明顯。

綜上所述，胸腔積液離心細胞塊沉淀法解決了脫落細胞無法進行連續(xù)切片和免疫組化檢測的問題，具有重要的臨床價值。同時，應(yīng)用細胞沉渣塊檢測EGFR基因突變，避免了穿刺活檢給患者帶來的痛苦，也為無法手術(shù)及不能耐受手術(shù)的患者提供了有效的基因檢測途徑，對晚期NSCLC患者進行靶向藥物治療具有重要指導(dǎo)意義。本研究應(yīng)用富集有核細胞層沉淀法制備胸腔積液細胞沉渣組織塊較傳統(tǒng)的離心細胞沉渣，有效提高了腫瘤細胞的獲得率及DNA提取率，為肺癌患者的診斷、治療及分子生物學檢測提供了新的有效方法和手段。