Fisetin對缺血再灌注肝臟氧化應激性損傷的保護作用*

李澤信，王 霄，王 迎，張 妤，李 榮，王建國

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科，河南 衛(wèi)輝 453100； 2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.安陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 安陽 455000； 4.新鄉(xiāng)醫(yī)學院護理學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

肝臟缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是肝臟手術、肝移植術和出血性休克的常見并發(fā)癥[1]。既往研究[2]證明，氧化應激性損傷在I/R損傷病理過程中發(fā)揮著至關重要的作用。I/R肝臟于再灌注后肝組織中產(chǎn)生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS),可直接導致肝臟組織氧化應激性損傷和肝衰竭[3]。因此，為防治肝臟I/R損傷，降低肝臟手術風險，尋找一種安全、高效的藥物或治療靶點具有十分重要的意義。3，3′4′7-四羥基黃酮(Fisetin)為廣泛存在于多種水果、蔬菜和植物中的一種黃酮類化合物，在多種慢性疾病和腫瘤治療中效果顯著[4-5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)isetin作為抗氧化劑在細胞體外培養(yǎng)狀態(tài)下，能夠有效降低肝細胞氧化應激性損傷，但Fisetin對I/R肝臟氧化應激性損傷是否同樣具有保護作用尚未見文獻報道。本研究通過小鼠肝臟I/R損傷模型探討Fisetin對肝臟氧化應激指標的影響，并初步探討了Fisetin對I/R肝臟氧化應激性損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取6～8周齡雄性C57BL/6小鼠18只，體質(zhì)量為20～25 g，由河南省實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(豫)2010-0002]。給予適應性喂養(yǎng)，晝夜各光照12 h，溫度為(25±1)℃，相對濕度為45%～55%，所有大鼠自由飲水和進食。動物處置符合動物倫理學標準。18只小鼠隨機分為Sham組、I/R組及I/R+Fisetin組，各6只。

1.2 方法

1.2.1 構建小鼠肝臟I/R損傷模型 缺血前1 h，I/R+Fisetin組小鼠經(jīng)腹腔注射Fisetin 50 mg·kg-1(Sigma公司)，Sham組和I/R組則注射等體積的二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。給藥1 h后：I/R組、I/R+Fisetin組麻醉后仰臥固定于37 ℃恒溫的小動物加熱墊上，參照文獻[7]介紹的方法制作小鼠肝臟I/R損傷模型：常規(guī)消毒后上腹部正中切口，逐層打開腹壁入腹腔，充分暴露肝臟區(qū)，分離肝左葉和中葉的門靜脈及肝動脈，并用血管夾夾閉以阻斷血流，使70%肝臟缺血，當被夾閉的肝臟組織部分顏色變淺時即肝血管阻斷成功，血管夾夾閉腹腔后，小鼠置于37 ℃孵育箱內(nèi)，血流阻斷1 h后，打開腹腔并松開血管夾，使肝臟進行再灌注，逐層縫合關閉腹腔。Sham組：單純開腹并游離肝門，不進行I/R處理和腹腔注射Fisetin。再灌注6 h后再次麻醉小鼠，獲取下腔靜脈血液樣本及肝臟，離心分離出血清置于-80 ℃冰箱中保存，用于生化檢測；取部分肝臟組織，體積分數(shù)10%甲醛溶液固定制備石蠟切片；另取部分肝臟組織用于檢測氧化應激相關指標。

1.2.2 觀察指標 ①小鼠肝臟功能的檢測：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)試劑盒和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。嚴格按照試劑盒說明檢測Sham組、I/R組和I/R+Fisetin組大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量。②蘇木精—伊紅(HE)染色觀察肝臟組織病理學變化：3組肝臟組織取材，質(zhì)量濃度10%甲醛溶液固定，采用乙醇梯度(體積分數(shù)80%、90%、95%、100%)脫水，二甲苯透明，制作組織石蠟切片；然后依次脫蠟、水化，首先蘇木精染色15 min，鹽酸乙醇溶液分化5 s后氨水溶液返藍，再用伊紅染色5 min，最后脫水、透明、封片，在顯微鏡下拍照保存圖像，采用Image J圖像分析軟件計算組織壞死面積所占的百分比。③小鼠肝臟細胞ROS水平檢測：各組肝臟組織放入預冷的組織培養(yǎng)液中，清洗血跡及污染物。去除組織塊中的壞死成分、纖維、脂肪及血管；用眼科剪將組織塊剪成1 mm3左右小塊，放在預冷的組織培養(yǎng)液中進行漂洗，洗去剪碎的細胞碎片；將300目尼龍網(wǎng)扎在燒杯上，將剪碎的組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷或刮刀輕搓組織塊，邊搓邊以PBS沖洗，直至將組織搓完；收集細胞懸液，500 g離心10 min去上清，并用PBS洗2次，并重懸制備單細胞懸液，細胞計數(shù)總數(shù)不少于106個。ROS測定嚴格按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明進行，加入10 μm 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2,7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)于細胞懸液，37 ℃孵育30 min；收集單細胞懸液，1 000 g離心10 min，棄上清，并用PBS重懸。熒光酶標儀檢測，激發(fā)光為490 nm，發(fā)射光為530 nm。測定結(jié)果以熒光強度/mgprot表示。④小鼠肝臟組織丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測：MDA試劑盒、GSH-Px試劑盒和SOD測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。稱取肝組織約0.5 g，按體質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍的生理鹽水，冰浴條件下機械勻漿，制備成10%的勻漿上清液后按照相應試劑盒說明進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 Fisetin對肝臟ALT、AST水平的影響 小鼠肝臟再灌注6 h后，I/R組與Sham組比較，血清中直接反映肝細胞膜功能的ALT水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.69,P<0.001)，血清中直接反映線粒體膜功能的AST水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.67,P<0.001)；I/R+Fisetin組小鼠于再灌注6 h后血清ALT、AST水平高于Sham組，但與 I/R組比較，血清ALT、AST水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.59、5.11,P<0.001)。見表1。

表1 3組小鼠肝臟功能指標比較

2.2 Fisetin對肝臟病理學的影響 小鼠肝臟HE結(jié)果顯示，Sham組小鼠肝臟組織學形態(tài)正常，無明顯病理學改變(圖1A)；I/R組小鼠肝組織出現(xiàn)靜脈充血、肝細胞水腫和灶狀壞死，大量中性粒細胞浸潤，部分細胞核固縮染色加深(圖1B)；I/R+Fisetin組小鼠肝細胞水腫和靜脈充血明顯減輕，中性粒細胞浸潤明顯減少，肝組織壞死面積明顯縮小(圖1C)。

圖1 3組小鼠肝臟再灌注6 h后肝組織染色(HE×200)

2.3 Fisetin對肝臟ROS水平和MDA含量的影響

小鼠I/R組肝臟再灌注6 h后肝臟組織ROS相對水平是Sham組的4.05倍，差異有統(tǒng)計學意義(t=-7.76,P<0.001)；I/R+Fisetin組小鼠再灌注6 h后肝組織中ROS相對水平是Sham對照組的1.96倍，雖然ROS水平仍高于Sham組，但I/R+Fisetin組小鼠肝臟ROS相對水平較單純I/R組下降，差異有統(tǒng)計學意義(t=-4.93,P<0.001)。與小鼠I/R組比較，I/R+Fisetin組小鼠肝臟再灌注6 h后MDA含量下降，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.67,P<0.001)。見圖2、表2。

注：a與Sham組比較，P<0.001；b與I/R組比較，P<0.001。

表2 3組小鼠肝組織氧化應激指標比較

2.4 Fisetin對肝臟SOD和GSH-Px活性的影響 I/R組小鼠肝臟再灌注6 h后肝臟組織中SOD和GSH-Px活性低于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.86,P<0.001)；腹腔注射Fisetin 50 mg·kg-1的小鼠肝臟中SOD和GSH-Px活性雖然沒有恢復至Sham組水平，但與小鼠I/R組比較，I/R+Fisetin組小鼠肝臟再灌注6 h后肝臟組織中SOD和GSH-Px活性顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.80、-5.84,P<0.001)。見表3。

表3 3組小鼠肝組織中抗氧化指標比較

3 討論

Fisetin是一種純天然的膳食類黃酮化合物，又名漆黃素、非瑟酮等，主要從漆木科植物中提取。有研究[8]認為，F(xiàn)isetin具有強大的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降糖、神經(jīng)保護以及心血管等多臟器保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟再灌注6 h后I/R組與Sham組比較，反映肝細胞膜和線粒體膜損傷的ALT和AST水平均有升高；與 I/R組比較，I/R+Fisetin組小鼠于再灌注6 h后血清ALT、AST水平明顯下降。這說明了小鼠應用Fisetin后I/R肝臟細胞功能得到了有效保護。既往研究[9]發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞在器官再灌注組織中大量浸潤釋放氧自由基和炎癥介質(zhì)是導致I/R損傷的重要途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R組小鼠肝組織出現(xiàn)靜脈充血、肝細胞水腫和灶狀壞死，大量中性粒細胞浸潤，部分細胞核固縮染色加深；然而，I/R+Fisetin組小鼠肝細胞水腫和靜脈充血明顯減輕，中性粒細胞浸潤明顯減少，肝組織壞死面積明顯縮小，提示Fisetin對小鼠I/R肝臟結(jié)構與功能的保護作用可能與中性粒細胞浸潤減少、ROS水平降低有關。

ROS主要來自細胞膜、線粒體電子傳遞鏈和胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶復合物，是含氧化學反應分子, 包括單線態(tài)氧、超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫等；ROS是氧化應激的直接導火索，其水平急劇增加可導致細胞膜性結(jié)構脂質(zhì)過氧化、膜蛋白氧化，造成氧化應激損傷[10]。器官組織中ROS水平高低是肝臟細胞氧化應激程度的標志物，近年來對組織器官氧化應激性損傷與保護的研究成為熱點[11]。張妍薇等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)isetin能抑制H2O2環(huán)境下細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而在抗氧化應激性損傷過程中發(fā)揮細胞保護作用，這與本研究對Fisetin進行的體內(nèi)研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠I/R組肝臟再灌注6 h后肝組織ROS相對水平是Sham組的4.05倍，即肝臟I/R誘發(fā)氧自由基大量釋放；但腹腔注射Fisetin(50 mg·kg-1)的I/R小鼠肝臟ROS相對水平下降至單純I/R組的0.48倍，說明I/R+Fisetin組小鼠再灌注6 h后肝組織中ROS相對水平被顯著抑制。本研究通過小鼠肝臟I/R損傷模型發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)isetin在體內(nèi)通過抑制ROS的產(chǎn)生對I/R肝臟氧化應激性損傷同樣具有保護作用。MDA是ROS氧化應激過程中脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物，MDA含量高低是反映肝細胞膜和線粒體膜等細胞膜性結(jié)構損傷程度的標志。為進一步驗證肝細胞膜、細胞器膜結(jié)構和功能損傷的一致性，本研究在檢測反映肝臟功能的ALT、AST水平高低的同時，也對小鼠肝組織中MDA含量進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sham組、I/R組和I/R+Fisetin組肝臟再灌注6 h后肝組織MDA含量分別為(3.040±0.693)、(12.781±3.086)和(6.287±1.444)nmol·mgprot-1；與小鼠I/R組比較，腹腔注射Fisetin(50 mg·kg-1)的I/R肝臟組織MDA含量于小鼠肝臟再灌注6 h后顯著下降，說明Fisetin可能是通過降低I/R肝臟內(nèi)ROS水平和MDA含量來減輕肝臟I/R損傷的。

機體生理狀態(tài)下體內(nèi)的SOD、GSH-Px等抗氧化酶系統(tǒng)與ROS、MDA氧化應激系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)[13]。有研究[14]證明，SOD活性增加在心肌缺血再灌注損傷保護中起著至關重要的作用。SOD作為抗氧化酶，能催化氧自由基歧化反應或通過SOD催化產(chǎn)生過氧化氫，部分過氧化氫可還原為羥自由基或者全部還原為水，最終清除自由基，保護細胞免受損傷；GSH-Px是肝臟中合成硫醇和三肽分子的催化酶，主要解毒脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，維持膜蛋白質(zhì)巰基狀態(tài)，修復細胞膜性結(jié)構[15]。在I/R肝臟中，為了明確Fisetin抑制ROS水平升高和MDA含量增加是否也與SOD和GSH-Px有關。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，3組肝臟再灌注6 h后小鼠肝組織SOD活性Sham組最高，其活性反映機體清除氧自由基的能力；GSH-Px活性是生物體內(nèi)一種很重要的抗氧化劑和自由基清除劑，對維持細胞膜的結(jié)構和功能具有重要意義；小鼠I/R組肝臟再灌注6 h后小鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px活性低于Sham組，說明肝細胞損傷狀態(tài)下SOD和GSH-Px活性均被抑制；腹腔注射Fisetin(50 mg·kg-1)的I/R小鼠肝臟中SOD和GSH-Px活性雖然沒有恢復到Sham組水平，但與小鼠I/R組比較，I/R+Fisetin組小鼠肝臟再灌注6 h后肝組織中SOD和GSH-Px活性顯著升高，這說明Fisetin能夠通過誘導I/R肝臟組織中SOD和GSH-Px活性增加來減輕肝臟的氧化應激反應，進而減輕I/R肝臟氧化應激性損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果證明，F(xiàn)isetin能夠有效改善肝臟I/R損傷的發(fā)生，其機制可能與Fisetin誘導SOD和GSH-Px活性升高有關，分別通過抑制ROS水平緩解氧化應激程度和降低MDA含量修復細胞膜性結(jié)構，從而對I/R肝臟氧化應激性損傷起到有效的保護作用。