轉(zhuǎn)錄組及代謝組聯(lián)合解析鄭單309響應(yīng)花粒期高溫脅迫的機(jī)制

李 川，黃 璐，喬江方，張美微，張盼盼，牛 軍，劉京寶，王淑鳳

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002； 2.禹州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 禹州 452570)

溫度是影響作物生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量品質(zhì)的關(guān)鍵因素。近年來(lái)隨著全球氣候變暖，短期異常高溫頻發(fā)[1-3]。玉米是我國(guó)重要的糧食、飼料、工業(yè)三元作物。溫度對(duì)玉米抽雄吐絲及授粉過(guò)程的影響較大[4]，進(jìn)而嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量。因此，研究玉米對(duì)花粒期高溫的響應(yīng)機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。玉米吐絲授粉的最佳日平均溫度為25～28 ℃，空氣相對(duì)濕度70%[5]。日最高溫度超過(guò)35 ℃，田間玉米授粉過(guò)程將受到阻礙，花粉在高于39 ℃時(shí)會(huì)失活，授粉過(guò)程不能順利完成從而造成減產(chǎn)甚至絕收[6]。高溫脅迫除了影響花粉活性和授粉過(guò)程外，還可以影響雌穗的發(fā)育，例如雌穗分化異常、延緩?fù)陆z，最終導(dǎo)致雌雄穗發(fā)育時(shí)期不協(xié)調(diào)，玉米授粉結(jié)實(shí)率下降[7-8]?；Ｆ谌掌骄鶞囟冗^(guò)高可以導(dǎo)致玉米葉片氣孔關(guān)閉[9]、破壞玉米葉片葉綠體結(jié)構(gòu)[10]、降低玉米植株中蛋白酶活性，這些最終導(dǎo)致玉米植株光合作用被大大削弱[11-12]?；Ｆ谌臻g高溫會(huì)提高玉米植株生育過(guò)程中多種生理生化反應(yīng)速率[13-14]，縮短生育期，減少籽粒干物質(zhì)積累量[15]，減少籽粒庫(kù)容，導(dǎo)致玉米籽粒敗育率增加[16]，最終導(dǎo)致玉米產(chǎn)量下降[17]。另外，玉米花粒期高溫脅迫還能夠改變內(nèi)源激素的含量及種類[18]，而玉米果穗的灌漿由多種內(nèi)源激素共同調(diào)控。其中，脫落酸(ABA )在植株受到高溫脅迫時(shí)表達(dá)水平提高，調(diào)控下游高溫誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)水平，減少高溫對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞，提高植株的耐熱性。玉米灌漿速率受多種內(nèi)源激素的共同調(diào)控，其中，赤霉素(GA)可以提高植物結(jié)實(shí)率；生長(zhǎng)素(IAA)可以促進(jìn)細(xì)胞分裂、植株生長(zhǎng)。玉米花粒期高溫脅迫還可以改變植株內(nèi)多種酶活性，降低玉米品質(zhì)[19]。光合作用的中間產(chǎn)物蔗糖運(yùn)輸至玉米籽粒后，由束縛態(tài)淀粉酶、可溶性淀粉合成酶、蔗糖合成酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶等不同種類的酶蛋白催化形成淀粉?；Ｆ诟邷孛{迫降低淀粉合成酶的活性，最終造成籽粒中合成的淀粉減少[20]。

目前，關(guān)于花粒期高溫脅迫對(duì)玉米的危害研究主要集中于玉米植株生理生化過(guò)程、產(chǎn)量、品質(zhì)等方面[20-22]，而在分子水平上的研究報(bào)道較少，主要是從抗逆基因[23]、激素所調(diào)控的高溫脅迫相關(guān)下游基因[24]等單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因表達(dá)水平上分析高溫脅迫對(duì)玉米的影響。為此，利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段和廣泛靶向代謝組測(cè)序手段全面闡述玉米新品種鄭單309花粒期響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制，明確高溫脅迫下的差異表達(dá)基因、差異表達(dá)代謝物，并對(duì)差異表達(dá)基因和差異表達(dá)代謝物代謝通路進(jìn)行分析，從而闡明鄭單309響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為玉米新品種鄭單309，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育，于2018年通過(guò)河南省作物品種審定委員會(huì)審定(豫審玉20180038)。該品種耐高溫?zé)岷?，抗青枯病和穗腐病，穩(wěn)產(chǎn)性好，適應(yīng)范圍廣。

1.2 高溫處理

試驗(yàn)于2018年6月12日在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地進(jìn)行。在玉米第9片葉展開(kāi)時(shí)(大喇叭口期)采用生長(zhǎng)箱進(jìn)行田間增溫處理，生長(zhǎng)箱長(zhǎng)20 m、寬15 m、高4 m。生長(zhǎng)箱四周用透光率較好(95%)的樹(shù)脂薄膜覆蓋，頂部密封90%，留出10%的空隙便于田間氣體交換。生長(zhǎng)箱下部樹(shù)脂薄膜可以拆移，以便生長(zhǎng)箱內(nèi)溫度過(guò)高時(shí)可以快速降溫。在生長(zhǎng)箱四周和中間懸掛溫度計(jì)，每天早、中、晚觀察記錄生長(zhǎng)箱內(nèi)溫度變化，控制生長(zhǎng)箱內(nèi)氣溫平均高于外界田間氣溫4～5 ℃。17:00—8:00揭開(kāi)樹(shù)脂膜。生長(zhǎng)箱內(nèi)光照強(qiáng)度和相對(duì)濕度等生長(zhǎng)條件基本與外界生長(zhǎng)條件一致。玉米植株抽雄散粉后即高溫脅迫處理7 d進(jìn)行第一次取樣，高溫處理14 d進(jìn)行第二次取樣，之后拆除生長(zhǎng)箱不再進(jìn)行高溫處理。

1.3 取樣

高溫處理7 d 進(jìn)行第一次取樣：選5株長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米植株，取穗位葉混合在一起，重復(fù)3次，分別命名為HT鄭單309-1、HT鄭單309-2、HT鄭單309-3；不進(jìn)行高溫處理的對(duì)照材料分別命名為CK鄭單309-1、CK鄭單309-2、CK鄭單309-3。高溫處理14 d 進(jìn)行第二次取樣：另選取5株長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米植株，取穗位葉混合在一起，分別命名為HT鄭單309-4、HT鄭單309-5、HT鄭單309-6；對(duì)照材料分別命名為CK鄭單309-4、CK鄭單309-5、CK鄭單309-6。葉片樣品立即放于液氮中冷凍，然后于-70 ℃超低溫冰箱保存。

1.4 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

玉米葉片總RNA用試劑盒RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen，Germany)提取。用瓊脂糖凝膠電泳及生物芯片分析檢測(cè)儀Agilent Bioanalyzer 2100 system(Aglilent Technologies, USA)檢測(cè)提取RNA 的完整性。RNA濃度用Nanodrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer(Nanodrop Technologie, USA)測(cè)定。由北京百邁客生物科技有限公司構(gòu)建cDNA文庫(kù), 轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序用Illumina HiSeqTM2500測(cè)序儀完成。

1.5 高通量測(cè)序結(jié)果分析及基因功能注釋

高通量測(cè)序后的原始序列通過(guò)去除接頭序列、低質(zhì)量序列、多N序列及長(zhǎng)度過(guò)短序列等一系列分析后獲得干凈序列。最終計(jì)算出測(cè)序序列的堿基錯(cuò)誤率及GC堿基含量。利用Hisat2 序列比對(duì)軟件采用BWT算法將所得干凈序列與已經(jīng)公布的玉米自交系B73序列(https://www.maizegdb.org/)進(jìn)行比對(duì)，查找基因信息。利用RSeQC-2.6.3軟件對(duì)與上述自交系B73序列比對(duì)所得基因進(jìn)行測(cè)序飽和度、基因覆蓋度及冗余序列分析，參照Nr 蛋白質(zhì)序列、 Nt 核酸序列、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KO、GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序結(jié)果基因的功能注釋。

1.6 基因表達(dá)量統(tǒng)計(jì)及篩選差異表達(dá)基因

基因表達(dá)具有時(shí)間和空間特異性，本試驗(yàn)中高溫脅迫處理不同時(shí)間段材料中檢測(cè)到的基因表達(dá)水平存在顯著差異的基因命名為差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes，DEGs)。差異表達(dá)基因是鄭單309響應(yīng)高溫脅迫的重要基因。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得所有轉(zhuǎn)錄本用FPKM(Fragment per kilobase of transcript per million fragment mapped)值表示。依據(jù)基因表達(dá)量及edgeR軟件計(jì)算獲得差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)P<0.05。顯著差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR<0.05 ，基因表達(dá)量變化倍數(shù)取2為底數(shù)對(duì)數(shù)值的絕對(duì)值|log2FC|≥2。參照GO數(shù)據(jù)庫(kù)，將差異表達(dá)基因按照參與的生物學(xué)過(guò)程(Biological process,BP)、細(xì)胞組分(Cellular component, CC)、分子功能(Molecular function, MF)進(jìn)行基因功能注釋分類。參照KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)基因參與的代謝途經(jīng)。

1.7 代謝組學(xué)測(cè)序分析

代謝組學(xué)測(cè)序分析材料同轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料，采用廣泛靶向技術(shù)進(jìn)行分析，由北京百邁客生物科技有限公司完成。鄭單309葉片樣本粉碎后用微孔濾膜過(guò)濾。葉片中代謝物用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析儀檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)所獲得的二級(jí)譜信息定性分析代謝物種類。之后對(duì)鄭單309葉片樣本代謝物進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis，PCA)，獲知樣本之間總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度。利用正交偏最小二乘法-判別分析統(tǒng)計(jì)方法(Orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)過(guò)濾掉代謝組測(cè)序結(jié)果中與分類變量不相關(guān)的正交變量，并對(duì)非正交變量和正交變量進(jìn)行分析，從而獲得更加可靠的代謝物組間差異。差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)為代謝物表達(dá)量變化倍數(shù)取2為底數(shù)對(duì)數(shù)值的絕對(duì)值|log2FC|≥2以及OPLS-DA模型的變異度值VIP>1。利用R軟件(www.r-project.org)對(duì)所檢測(cè)到的同一代謝物在不同鄭單309葉片樣本間的積累模式進(jìn)行聚類分析(Hierarchical cluster analysis, HCA)。通過(guò)查找KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)檢測(cè)到的差異代謝物進(jìn)行功能注釋、代謝通路等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫與正常生長(zhǎng)條件下鄭單309轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列分析

經(jīng)分析(表1)發(fā)現(xiàn)，CK鄭單309-1獲得了71 543 704條干凈序列，GC含量為59.84%，沒(méi)有AT/GC分離現(xiàn)象，堿基識(shí)別精度99.9% 以上序列即Q30堿基質(zhì)量值達(dá)92.68%。與參照B73基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，84.33%的序列配對(duì)成功，獲得60 332 708條配對(duì)序列。HT鄭單309-1獲得了56 355 684條干凈序列，GC含量為60.42%，沒(méi)有AT/GC分離現(xiàn)象，Q30堿基質(zhì)量值達(dá)92.68%。與參照B73基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，82.76% 的序列配對(duì)成功，獲得46 641 566條配對(duì)序列。 CK鄭單309-2獲得了58 280 642 條干凈序列，與參照B73基因組比對(duì)81.81%的序列配對(duì)成功。HT鄭單309-2獲得了62 827 976條干凈序列，與參照B73基因組比對(duì)84.96%的序列配對(duì)成功。CK鄭單309-3獲得了69 146 446 條干凈序列，與參照B73基因組比對(duì)82.60%的序列配對(duì)成功。HT鄭單309-3獲得了58 844 390條干凈序列，與參照B73基因組比對(duì)84.53% 的序列配對(duì)成功。

表1 高溫脅迫與正常生長(zhǎng)條件下鄭單309轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

CK鄭單309-4獲得了57 394 260 條干凈序列，與參照B73基因組比對(duì)74.62%的序列配對(duì)成功。HT鄭單309-4獲得了51 080 622條干凈序列，與參照B73基因組比對(duì)77.34% 的序列配對(duì)成功。CK鄭單309-5獲得了56 849 972 條干凈序列，與參照B73基因組比對(duì)79.38%的序列配對(duì)成功。HT鄭單309-5獲得了71 288 420條干凈序列，與參照B73基因組比對(duì)79.77% 的序列配對(duì)成功。CK鄭單309-6獲得了71 324 428 條干凈序列，與參照B73基因組比對(duì)76.37%的序列配對(duì)成功。HT鄭單309-6獲得了68 719 302條干凈序列，與參照B73基因組比對(duì)84.51% 的序列配對(duì)成功。

2.2 鄭單309高溫脅迫條件下的差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

差異表達(dá)基因根據(jù)表達(dá)水平分為上調(diào)表達(dá)基因(Up-regulated gene)和下調(diào)表達(dá)基因(Down-regulated gene)。圖1所示，鄭單309高溫脅迫7 d與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組(G0)共檢測(cè)到515個(gè)差異表達(dá)基因，其中75個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，440個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因。鄭單309高溫脅迫14 d與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組(G1)共檢測(cè)到506個(gè)差異表達(dá)基因，其中114個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，392個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因。鄭單309高溫脅迫7 d 與高溫脅迫14 d材料對(duì)比組(G2)共檢測(cè)到2 050個(gè)差異表達(dá)基因，其中790個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，1 260個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因。G0與G1中有7個(gè)基因在高溫脅迫7、14 d葉片中均較正常材料差異表達(dá)。這7個(gè)共同差異表達(dá)基因分別為Zea_mays_newGene_28308，在高溫脅迫7 d葉片中上調(diào)表達(dá)，在高溫脅迫14 d葉片中下調(diào)表達(dá)，屬于新基因，功能未知； Zm00001d019114，在高溫脅迫7、14 d葉片中均上調(diào)表達(dá)，編碼叉狀蛋白抑制因子，在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中分類屬于RNA 加工及修飾蛋白； Zm00001d021497，在高溫脅迫7、14 d葉片中均下調(diào)表達(dá)，編碼絲切蛋白/原肌球蛋白類肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中分類屬于細(xì)胞骨架； Zm00001d025043，在高溫脅迫7 d葉片中上調(diào)表達(dá)，在高溫脅迫14 d葉片中下調(diào)表達(dá)，編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中分類屬于次級(jí)代謝物生物合成；Zm00001d022453，在高溫脅迫7、14 d葉片中均上調(diào)表達(dá)，編碼陽(yáng)離子過(guò)氧化酶1，在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)分類中屬于過(guò)氧化物；Zm00001d025319，在高溫脅迫7、14 d葉片中均上調(diào)表達(dá)，編碼泛素-蛋白連接酶1，在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中分類屬于翻譯后修飾；Zm00001d038806，在高溫脅迫7、14 d葉片中均下調(diào)表達(dá)，編碼熱激蛋白101，在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中分類屬于翻譯后修飾。G0與G2中檢測(cè)到58個(gè)共同差異表達(dá)基因。G1與G2中檢測(cè)到115個(gè)共同差異表達(dá)基因。上述差異表達(dá)基因中的Zm00001d022453、Zm00001d025319、Zm00001d038806是G0、G1、G2中的共同差異表達(dá)基因。

G0:鄭單309高溫脅迫7 d與正常生長(zhǎng)條件材料的差異表達(dá)基因數(shù)目;G1:鄭單309高溫脅迫14 d與正常生長(zhǎng)條件材料的差異表達(dá)基因數(shù)目;G2：鄭單309高溫脅迫7 d與高溫脅迫14 d材料的差異表達(dá)基因數(shù)目

2.3 鄭單309高溫脅迫下差異表達(dá)基因的功能分析及分類

參照GO數(shù)據(jù)庫(kù)，鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要富集于中和作用、生長(zhǎng)發(fā)育、多有機(jī)體過(guò)程、生殖過(guò)程、繁育、細(xì)胞組分、生物調(diào)控、細(xì)胞進(jìn)程，細(xì)胞連接、共質(zhì)體、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外區(qū)成分，催化活性、分子功能活性、抗氧化活性等。鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要富集于節(jié)奏過(guò)程、中和作用、多有機(jī)體過(guò)程、定位、刺激反應(yīng)、單有機(jī)體過(guò)程、代謝過(guò)程，細(xì)胞膜、細(xì)胞膜成分、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外區(qū)成分，結(jié)合作用、催化活性、電子載體活性、抗氧化活性、養(yǎng)分儲(chǔ)備活性等。鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要富集于單有機(jī)體過(guò)程、刺激反應(yīng)、定位、多有機(jī)體過(guò)程、信號(hào)傳導(dǎo)、中和作用、節(jié)奏過(guò)程，細(xì)胞膜、細(xì)胞膜成分、細(xì)胞外區(qū)、核酸細(xì)胞成分，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、電子載體活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，分子轉(zhuǎn)換活性、抗氧化活性等。

依據(jù)KOG/COG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行同源分類。鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要分布于碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/被膜生物合成、脂質(zhì)運(yùn)輸及代謝、通用功能預(yù)測(cè)系統(tǒng)5個(gè)主要(富集到的差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)≥10個(gè))分類，以及能量產(chǎn)生及轉(zhuǎn)換、細(xì)胞循環(huán)控制/細(xì)胞分裂/染色體分區(qū)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制/重組/修復(fù)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、翻譯后修飾/蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)/分子伴侶、無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸及代謝、次級(jí)代謝物生物合成/運(yùn)輸/分解代謝、防衛(wèi)機(jī)制、細(xì)胞骨架、未知功能13個(gè)次要(富集到的差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)<10個(gè))分類。鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要分布于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/被膜生物合成、次級(jí)代謝物生物合成/運(yùn)輸/分解代謝、通用功能預(yù)測(cè)系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、防衛(wèi)系統(tǒng)7個(gè)主要(富集到的差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)≥10)分類，以及能量產(chǎn)生及轉(zhuǎn)換、細(xì)胞循環(huán)控制/細(xì)胞分裂/染色體分區(qū)、核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、脂質(zhì)運(yùn)輸及代謝、翻譯/核糖體結(jié)構(gòu)及生物合成、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制/重組/修復(fù)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、翻譯后修飾/蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)/分子伴侶、無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸及代謝、胞內(nèi)運(yùn)輸/分泌/膜泡運(yùn)輸、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、未知功能14個(gè)次要(富集到的差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)<10)分類。鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對(duì)比組中差異表達(dá)基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組及鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組，差異表達(dá)基因主要分布于能量產(chǎn)生及轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、脂質(zhì)運(yùn)輸及代謝、翻譯/核糖體結(jié)構(gòu)及生物合成、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/被膜生物合成、翻譯后修飾/蛋白質(zhì)中轉(zhuǎn)/分子伴侶蛋白、無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸及代謝、次級(jí)代謝物生物合成/運(yùn)輸/分解代謝、通用功能預(yù)測(cè)系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、防衛(wèi)系統(tǒng)15個(gè)主要分類，以及RNA加工及修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)、細(xì)胞循環(huán)控制/細(xì)胞分裂/染色體分區(qū)、復(fù)制/重組/修復(fù)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、未知功能8個(gè)次要分類。

對(duì)差異表達(dá)基因注釋參與的代謝途徑(Pathway)進(jìn)行分析能進(jìn)一步了解基因功能。鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要注釋到植物-病原體相互作用、戊糖及葡萄糖醛酸酯相互轉(zhuǎn)換、淀粉和蔗糖代謝、木質(zhì)素生物合成、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、氧化磷酸化6個(gè)代謝途經(jīng)中。鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要注釋到淀粉和蔗糖代謝、木質(zhì)素生物合成、苯基丙氨酸代謝、植物-病原體相互作用、碳代謝、氨基糖及核苷酸糖代謝、氨酰tRNA生物合成7個(gè)代謝途經(jīng)中。鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對(duì)比組中差異表達(dá)基因較多，主要注釋到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)加工、氨基酸生物合成、碳代謝、淀粉及蔗糖代謝、胞吞作用、過(guò)氧化酶體、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、剪接體、DNA復(fù)制、核糖體、錯(cuò)配修補(bǔ)、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解作用、RNA降解、RNA運(yùn)輸、真核細(xì)胞核糖體生物合成、氮代謝、硫代謝、半胱氨酸及蛋氨酸代謝、木質(zhì)素生物合成、谷胱甘肽代謝、脂肪酸降解、磷酸戊糖途徑、脂肪酸生物合成、果糖及甘露糖代謝、脂肪酸延長(zhǎng)、醚酯代謝、丁酸甲酯代謝、嘌呤代謝、氰基氨基酸代謝、嘧啶代謝、丙酮酸代謝、光合作用、苯基丙氨酸代謝、2-氧化磷酸代謝、甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝、類胡蘿卜素生物合成、半乳糖代謝、萜類化合物主鏈生物合成、乙醛酸及脫酸產(chǎn)物代謝、光合器官中碳固定、糖酵解/糖異生作用、抗壞血酸代謝、纈氨酸亮氨酸及異亮氨酸降解、氨基糖及核苷酸糖代謝、丙氨酸天冬氨酸及谷氨酸代謝、甘氨酸絲氨酸及蘇氨酸代謝、植物晝夜節(jié)奏、植物-病原體互作20個(gè)代謝途經(jīng)中。

2.4 鄭單309高溫脅迫下的差異代謝物統(tǒng)計(jì)

對(duì)不同高溫脅迫處理鄭單309代謝組學(xué)進(jìn)行分析，共檢測(cè)到654個(gè)代謝物(圖2)。鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組G0中檢測(cè)到40個(gè)差異表達(dá)代謝物，其中8個(gè)上調(diào)表達(dá)，32個(gè)下調(diào)表達(dá)。鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組G1中檢測(cè)到40個(gè)差異表達(dá)代謝物，其中4個(gè)上調(diào)表達(dá)，36個(gè)下調(diào)表達(dá)。鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對(duì)比組G2中檢測(cè)到46個(gè)差異表達(dá)代謝物，其中17個(gè)為上調(diào)表達(dá)，29個(gè)下調(diào)表達(dá)。G0與G1對(duì)比組中檢測(cè)到17個(gè)共同差異表達(dá)代謝物均在高溫脅迫7 d葉片、高溫脅迫14 d葉片中顯著表達(dá)。G0與G2對(duì)比組中檢測(cè)到4個(gè)共同差異表達(dá)代謝物顯著表達(dá)，分別為喜樹(shù)堿，上調(diào)表達(dá)；乙?；嚢彼酧-己糖苷，上調(diào)表達(dá)；反式己二烯二酸，上調(diào)表達(dá)；對(duì)苯二甲醛，上調(diào)表達(dá)。G1與G2對(duì)比組中檢測(cè)到7個(gè)共同差異表達(dá)代謝物顯著表達(dá)，分別為髓鞘相關(guān)糖蛋白異構(gòu)體1，下調(diào)表達(dá)；膽甾醇，下調(diào)表達(dá)；山奈酚，下調(diào)表達(dá)；綠原酸甲酯，下調(diào)表達(dá)；乙酰氧乙酸，下調(diào)表達(dá)；N，N-二甲基甲酰胺，下調(diào)表達(dá)M；對(duì)苯二甲酸，下調(diào)表達(dá)。尤其值得注意的是，代謝物對(duì)苯二甲酸在GO、G1、G2對(duì)比組中表達(dá)量均達(dá)到差異水平，只是表達(dá)模式不同。

G0:鄭單309高溫脅迫7 d與正常生長(zhǎng)條件材料的差異表達(dá)代謝物數(shù)目;G1:鄭單309高溫脅迫14 d與正常生長(zhǎng)條件材料的差異表達(dá)代謝物數(shù)目;G2：鄭單309高溫脅迫7 d與高溫脅迫14 d材料的差異表達(dá)代謝物數(shù)目

2.5 鄭單309高溫脅迫下差異代謝物的功能分類

由表2可知，鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中的40個(gè)差異表達(dá)代謝物主要富集于精氨酸及脯氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸代謝，次生代謝產(chǎn)物生物合成，組氨酸代謝，類黃酮生物合成，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，嘧啶代謝，氨酰tRNA生物合成，碳青霉烯生物合成，氨基酸生物合成，黃酮和黃酮醇生物合成等KEGG通路。

由表3可知，鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中的40個(gè)差異表達(dá)代謝物主要富集于精氨酸及脯氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，次生代謝產(chǎn)物生物合成，類黃酮生物合成，黃酮和黃酮醇生物合成，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，煙酸及煙酰胺代謝，半乳糖代謝，色氨酸代謝，類固醇生物合成，嘌呤代謝，賴氨酸降解，萜類化合物、哌啶及吡啶生物堿生物合成等KEGG通路。

表2 高溫脅迫處理7 d與正常條件下鄭單309差異表達(dá)代謝物KEGG注釋結(jié)果

續(xù)表2 高溫脅迫處理7 d與正常條件下鄭單309差異表達(dá)代謝物KEGG注釋結(jié)果

表3 高溫脅迫處理14 d與正常條件下鄭單309差異表達(dá)代謝物KEGG注釋結(jié)果

續(xù)表3 高溫脅迫處理14 d與正常條件下鄭單309差異表達(dá)代謝物KEGG注釋結(jié)果

由表4可知，鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對(duì)比組中的46個(gè)差異表達(dá)代謝物主要富集于次生代謝產(chǎn)物生物合成，葡萄糖甙生物合成，氰氨基酸代謝，對(duì)苯二甲酸、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，氨基酸生物合成，纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸降解，纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸生物合成，2-氧羧酸代謝，氨酰tRNA生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，嘧啶代謝，氮代謝，精氨酸生物合成，嘌呤代謝，乙醛和二羧酸代謝，色氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，鞘脂代謝，甘油磷酸代謝，類黃酮生物合成，苯并惡嗪類生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙醇生物合成，泛酸鹽和輔酶A生物合成，氨基酸生物合成，碳代謝，C5支鏈二元酸代謝，賴氨酸生物合成，丁酸代謝，?；撬岽x，抗壞血酸和醛酸代謝，2-氧羧酸代謝，檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化，組氨酸代謝，黃酮和黃酮醇生物合成等KEGG通路。

表4 高溫脅迫處理7 d與14 d鄭單309差異表達(dá)代謝物KEGG注釋結(jié)果

續(xù)表4 高溫脅迫處理7 d與14 d鄭單309差異表達(dá)代謝物KEGG注釋結(jié)果

3 結(jié)論與討論

鄭單309是適合河南省夏播的高產(chǎn)玉米品種，在2017年河南省玉米區(qū)域試驗(yàn)中，比對(duì)照鄭單958增產(chǎn)2.2%。本研究對(duì)花粒期鄭單309高溫脅迫處理7 、14 d及正常生長(zhǎng)條件下穗位葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，解析鄭單309響應(yīng)花粒期高溫脅迫的分子機(jī)制。鄭單309高溫脅迫7 d與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中共檢測(cè)到515個(gè)差異表達(dá)基因，其中75個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因；高溫脅迫14 d與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中共檢測(cè)到506個(gè)差異表達(dá)基因，其中114個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因。高溫脅迫7 d 材料與高溫脅迫14 d材料相比，發(fā)現(xiàn)2 050個(gè)差異表達(dá)基因，其中790個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，1 260個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因。說(shuō)明隨著高溫脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，鄭單309在轉(zhuǎn)錄水平上有更多的基因表達(dá)模式發(fā)生變化。高溫脅迫7 d與正常生長(zhǎng)條件對(duì)比組、高溫脅迫14 d與正常生長(zhǎng)條件對(duì)比組、高溫脅迫7 d與高溫脅迫14 d對(duì)比組中只檢查到了3個(gè)共同差異表達(dá)基因Zm00001d022453、Zm00001d025319、Zm00001d038806。Zm00001d022453編碼陽(yáng)離子過(guò)氧化酶1，在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中分類屬于過(guò)氧化物。這與前人[25]研究結(jié)果一致，即高溫脅迫破壞玉米植株生長(zhǎng)發(fā)育中活性氧產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡。活性氧的大量積累可以損傷膜系統(tǒng)，導(dǎo)致電解質(zhì)流出及細(xì)胞生理生化特性發(fā)生紊亂。高溫逆境下高表達(dá)水平的過(guò)氧化物可以清除積累的活性氧，從而維持細(xì)胞活性。Zm00001d025319編碼泛素-蛋白連接酶1，在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中分類屬于翻譯后修飾。而泛素化修飾在高溫逆境中起到重要作用，尤其泛素對(duì)植物激素的改變，從而改變激素下游重要蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)而影響生長(zhǎng)發(fā)育。Zm00001d038806編碼熱激蛋白101。研究發(fā)現(xiàn)，植物響應(yīng)高溫脅迫的網(wǎng)絡(luò)主要包括熱激蛋白和熱激轉(zhuǎn)錄因子組成的植物高溫脅迫響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、氧化脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子抗逆響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)、激素參與的高溫脅迫應(yīng)答機(jī)制、高溫脅迫下的磷脂信號(hào)通路[26]。從而推斷Zm00001d038806基因在鄭單309應(yīng)答花粒期高溫脅迫網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用。

不同對(duì)比組中差異表達(dá)基因富集的具體GO分類不同，鄭單309高溫脅迫7 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要富于中和作用、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外區(qū)成分、分子功能調(diào)控、抗氧化活性5個(gè)GO分類。鄭單309高溫脅迫14 d 與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要富集于電子載體活性、抗氧化活性、節(jié)奏過(guò)程、細(xì)胞外區(qū)、中和作用5個(gè)GO分類。由此推測(cè),轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)到的高溫脅迫相關(guān)差異表達(dá)基因主要屬于中和作用、細(xì)胞外區(qū)、抗氧化活性3類GO分類功能。隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，鄭單309高溫脅迫7 d 與14 d對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要富集于電子載體活性、核苷酸、細(xì)胞外區(qū)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、核苷酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性5個(gè)GO分類功能中。不同對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要富集于碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/被膜生物合成、通用功能預(yù)測(cè)系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)4個(gè)主要KOG/COG分類。研究發(fā)現(xiàn)，花粒期高溫脅迫改變籽粒淀粉合成酶的活性，減少淀粉合成減少產(chǎn)量[27]。鄭單309植株檢測(cè)到差異表達(dá)基因?qū)儆谔妓衔镞\(yùn)輸和代謝功能，調(diào)節(jié)籽粒內(nèi)淀粉的合成，最低程度減少高溫對(duì)產(chǎn)量的損失。不同對(duì)比組中差異表達(dá)基因主要富集于植物-病原體相互作用、淀粉和蔗糖代謝、木質(zhì)素生物合成3個(gè)KEGG代謝途經(jīng)中。

代謝組學(xué)分析共檢測(cè)到654個(gè)代謝物，鄭單309高溫脅迫7 d與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中檢測(cè)到40個(gè)差異表達(dá)代謝物，其中8個(gè)上調(diào)表達(dá)；鄭單309高溫脅迫14 d與正常生長(zhǎng)條件材料對(duì)比組中檢測(cè)到40個(gè)差異表達(dá)代謝物，其中4個(gè)上調(diào)表達(dá)；隨著高溫脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，上調(diào)表達(dá)代謝物減少，下調(diào)表達(dá)代謝物增加。對(duì)苯二甲酸在不同對(duì)比組中均差異表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈中存在大量的對(duì)苯二甲酸[28]，然而對(duì)苯二甲酸具體如何在玉米響應(yīng)高溫脅迫中起作用尚需要探索研究。不同對(duì)比組中檢測(cè)到的差異表達(dá)代謝物主要富集于精氨酸及脯氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸代謝，次生代謝產(chǎn)物生物合成，類黃酮生物合成，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，嘧啶代謝，黃酮和黃酮醇生物合成7個(gè)主要KEGG代謝通路中。