利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析青紫藍(lán)獺兔的保種效果

申金鈺，陳 實(shí)，趙 斌，李佳麗，盧婷婷，翁巧琴，鮑國連，陳 陽，吳信生*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；2.浙江省余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司，浙江寧波 315400；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021）

獺兔，又名力克斯兔，意為“兔中之王”，是皮肉兼用型兔，因其皮毛酷似珍貴的毛皮獸水獺而得名。獺兔具有外貌勻稱，耳朵長，須眉卷曲，毛絨短、平、密、細(xì)、美、牢等特征[1-2]，其毛色天然純正，手感柔軟滑爽，在國際、國內(nèi)市場上銷售前景廣闊，特別是青紫藍(lán)獺兔，被毛為藍(lán)灰色，吹開被毛呈現(xiàn)彩色輪狀漩渦，十分美觀，頗受消費(fèi)者青睞[3-4]。我國現(xiàn)存的青紫藍(lán)獺兔數(shù)量甚少，本團(tuán)隊(duì)經(jīng)過長期進(jìn)行遺傳資源的搜集與選育工作，已經(jīng)建立了青紫藍(lán)獺兔的資源群體，為本研究的開展提供了研究素材[5-6]。

分子標(biāo)記技術(shù)誕生于20 世紀(jì)80 年代，實(shí)現(xiàn)了從表型選擇到基因型選擇的飛躍。其中由liit 和luty 命名的微衛(wèi)星標(biāo)記具有分布均勻、保守性高、多態(tài)性豐富、突變率較低、簡易性、呈共顯性遺傳特點(diǎn)，目前在家兔的遺傳多樣性評估上已有一些應(yīng)用。朱玉峰等[7]利用微衛(wèi)星標(biāo)記等分析Vc 獺兔的群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性。申幸嬌等[8]采用18 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（Sat2、Sat5、Sat8、Sat12、Sol33、Sol44、6L1F10 等）檢測國內(nèi)日本大耳白兔、青紫藍(lán)兔等的遺傳背景及遺傳結(jié)構(gòu)，研究表明這18 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性較高，種群間分化明顯。微衛(wèi)星標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于家兔遺傳育種，但其在家兔分子研究中應(yīng)用較少，尚無實(shí)質(zhì)性突破。相對于國外的家兔領(lǐng)域研究，微衛(wèi)星標(biāo)記的推廣起步晚，研究也較淺。目前我國彩色獺兔數(shù)量少，品種質(zhì)量差，毛色遺傳不穩(wěn)定等，很難形成高規(guī)格批量供貨，成為我國彩色獺兔發(fā)展的主要限制因素。本研究基于已有的青紫藍(lán)獺兔資源群體，研究多個(gè)世代保種后的群體遺傳多樣性的變化，篩選出23 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，分別統(tǒng)計(jì)1、4、5 世代的遺傳多樣性參數(shù)，建立起青紫藍(lán)獺兔保種選育的數(shù)據(jù)庫。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本實(shí)驗(yàn)取用青紫藍(lán)獺兔3 個(gè)世代的耳組織樣，分別選取1、4、5 世代獺兔群體，每代各取60 只，共計(jì)180 只，所采耳組織樣均來源于余姚欣農(nóng)兔業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 總RNA 提取試劑盒（DP419），購于天根生化科技（北京）有限公司；Tris 飽和酚、異丙醇均購于北京鼎國生物技術(shù)公司；瓊脂糖購于SIGMA 有限責(zé)任公司；脫氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA 聚合酶均購于Invitrogen 有限責(zé)任公司；Tris base、DL2000、SDS、EDTA、去離子甲酰胺、硝酸銀、亞甲基雙丙烯酰胺等均購于上海生物工程有限責(zé)任公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 ND-1000 濃度測定儀、BD-255LTB型低溫冷凍柜、制冰機(jī)、Eppendorf 移液槍、DYCZ-21 型電泳槽、AB1-3730XL DNA Analyzer 測序儀、小型Eppendorf AG-22331Mini 式高速離心機(jī)、電泳槽DYCZ-24A、Image Quant Capture3000 成像系統(tǒng)、DK-600 型電熱恒溫水槽、高壓滅菌鍋、Eppendorff Centr5ge5415R 冷凍離心機(jī)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 青紫藍(lán)獺兔耳樣采集 用剪刀取1 cm3兔耳組織，放入1.5 mL 離心管中，置于-20℃下冷凍保存、備用。

1.3.2 青紫藍(lán)獺兔基因組DNA 提取 根據(jù)試劑盒操作說明來提取青紫藍(lán)獺兔基因組總DNA。DNA 提取后，用NanodropND-1000 全波長的分光光度計(jì)測定溶解后原液的DNA 濃度，根據(jù)測定結(jié)果取部分原液統(tǒng)一稀釋至100 ng/ L，4℃保存?zhèn)溆?，剩余原液?20℃保存。

1.3.3 篩選微衛(wèi)星引物及PCR 擴(kuò)增 查閱相關(guān)參考文獻(xiàn)[9-12]發(fā)現(xiàn)SSR 標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)較少，本實(shí)驗(yàn)從中篩選23 個(gè)具有代表性的SSR 標(biāo)記位點(diǎn)，分別分布在19 個(gè)不同染色體上，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司合成引物。PCR 反應(yīng)程序?yàn)樵诒≈校瑢CR 所需成分依次加入無菌0.5 mL 離心管。調(diào)整PCR 儀反應(yīng)程序，將上述混合液稍加離心，立即置于PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，50～64℃退火40 s（因位點(diǎn)而異），72℃延伸40 s，共34 個(gè)循環(huán)，72℃延伸l0 min 至4℃保存。PCR 反應(yīng)總體系為20 μL：l0×PCR（Mg2+free）Buffer 2 μL，25 mmol/L MgC120.8～1.2 μL，2.5 mmol/L dNTPs l.0 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，Taq DNA 聚合酶1.0 U，100 ng/μL DNA 模板1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)至20 μL。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，從而篩選出符合條件的引物。

1.3.4 熒光標(biāo)記引物PCR 擴(kuò)增 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）得到青紫藍(lán)獺兔基因型圖，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫公布的微衛(wèi)星位點(diǎn)目的片段長度，以等位基因大小為參數(shù)，當(dāng)產(chǎn)物相差20 bp 以上，在測序時(shí)等位基因片段長度區(qū)別比較大，信號容易區(qū)分，因此把相差20 bp 以上的SSR 位點(diǎn)進(jìn)行組合，每3 個(gè)位點(diǎn)一組；用FAM（藍(lán)色）、TAMRA（黃色）、HEX（綠色）3 種熒光染料分別對上游引物5’端進(jìn)行熒光標(biāo)記，共計(jì)15個(gè)標(biāo)記組合，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司進(jìn)行合成（表1）。對23 個(gè)熒光SSR 標(biāo)記引物進(jìn)行單一PCR 擴(kuò)增處理后，再對不同的PCR 產(chǎn)物混合樣進(jìn)行STR 分型檢測，獲得STR 電泳圖譜。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用微衛(wèi)星序列分析軟件Genemapper 4.0，選擇Microsatellite 為分析方法，建立Genemapper分析項(xiàng)目，導(dǎo)入獺兔混合樣的電泳結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分析完成后導(dǎo)出每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的峰圖，根據(jù)每個(gè)樣本的測序圖譜結(jié)果自動連續(xù)地讀出對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度、片段大小等數(shù)據(jù)，通過峰圖判斷同一位點(diǎn)上的2 個(gè)等位基因是否相同，單峰表示相同，代表純合子，雙峰表示雜合子，用Excel 表記錄每個(gè)位點(diǎn)的不同樣本峰圖，青紫藍(lán)獺兔第1 世代的23 個(gè)SSR 位點(diǎn)在個(gè)體中的分布位置；利用PopGene 軟件對青紫藍(lán)獺兔各遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行不同世代青紫藍(lán)獺兔各遺傳多樣性參數(shù)分析，具體包括等位基因數(shù)（A）、有效等位基因數(shù)（Ae）、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Obs He）和多態(tài)信息含量（PIC），以P＜0.05 作為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取及PCR 產(chǎn)物結(jié)果檢測 提取青紫藍(lán)獺兔全基因組DNA，使用Nanodrop ND-1000 濃度測定儀測定所提取DNA 的純度和濃度，并記錄數(shù)據(jù)。此外，檢驗(yàn)所得的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期結(jié)果一致，約為250 bp。

2.2 SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測 檢測結(jié)果表明等位基因的片段長度在88～456 bp，均小于500 bp（圖1）。圖1 是INRACCDDV0313（HEX）、6L2H3（FAM）和INRACCDDV0309（TAMRA）3 個(gè)SSR 位點(diǎn)的毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)果。

2.3 3 個(gè)世代的遺傳多樣性分析 由表2 可知，青紫藍(lán)獺兔3 個(gè)世代的A 分別為3.173 9、3.087 0 和3.173 9，Ae 分別為2.104 3、1.984 7 和1.877 1，遺傳多樣性較為豐富。1 世代Obs He 為0.517 4（Obs He＞0.5），遺傳變異程度較高，表明兔群對環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)；3 個(gè)世代的PIC 在0.357 4～0.387 8，呈中度多態(tài)，說明兔

群遺傳變異程度較高，其中多態(tài)性最高的是1 世代，多態(tài)性最低的是5 世代。各世代保種群Obs He 較高，均在0.493 5～0.542 0。其中4 世代保種群Obs He 最高，5 世代保種群最低，但3 個(gè)世代之間無顯著差異。

表1 熒光標(biāo)記SSR 引物23 個(gè)位點(diǎn)組合及反應(yīng)條件

圖1 SSR 位點(diǎn)毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)果

青紫藍(lán)獺兔3 個(gè)世代的各遺傳參數(shù)差異不顯著，浙江余姚保種場的保種效果良好。

表2 23 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)下青紫藍(lán)獺兔3 個(gè)世代各遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計(jì)

3 討 論

家兔保種是指保存一切與特定生態(tài)條件相聯(lián)系的基因及基因組合體系，使家兔品種基因庫中的每一優(yōu)良基因都不丟失。家兔品種保存方法包括凍精、凍胚和活畜相結(jié)合等，目前以活畜保種為主。通過基因庫活體保存技術(shù)對優(yōu)良家兔種質(zhì)資源集中保存?zhèn)浞?，以便利用基因庫開展相關(guān)研究。

本研究利用篩選出的23 個(gè)SSR 位點(diǎn)組合對青紫藍(lán)獺兔基因庫保種群體的遺傳變異情況進(jìn)行相關(guān)檢測，可為日后在家兔保種領(lǐng)域的研究提供一定依據(jù)。遺傳多樣性一般指種內(nèi)個(gè)體間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和。Ae 反映某等位基因分布的均勻程度，其數(shù)值越接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻[13]。雜合度即基因的多樣性。群體雜合度（Heterozygosity）指隨機(jī)抽取的2 個(gè)樣本的等位基因不相同的概率，可作為檢測品種遺傳變異的指標(biāo)[14-15]。PIC 表示一個(gè)后代所獲得某個(gè)等位標(biāo)記來自于父親（或母親）的同一個(gè)等位標(biāo)記的可能性，是表示DNA 變異程度高低的一個(gè)指標(biāo)。高度多態(tài)位點(diǎn)PIC 在0.5 以上，中度多態(tài)位點(diǎn)PIC 在0.25～0.5，低度多態(tài)位點(diǎn)PIC 低于0.5。

很多學(xué)者基于相關(guān)原理對群體間的遺傳變異情況進(jìn)行判斷。陳民利等[16]對大耳白黑眼兔封閉群與日本大耳白兔、新西蘭兔的微衛(wèi)星多態(tài)性進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)了區(qū)分大耳白黑眼兔與其他品系的特有等位基因。俞春英等[17]檢測了25 只福建黃兔在15 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的遺傳變異情況，比較Ae、He 和PIC 等遺傳參數(shù)，對福建黃兔遺傳多態(tài)性進(jìn)行了分析。謝喜平等[18]選擇了16個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)了Ae、PIC、He 等遺傳參數(shù)，從DNA 分子水平揭示了福建黃兔群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。目前國內(nèi)對青紫藍(lán)獺兔保種效果相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記研究較少，本研究選擇了23 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)研究青紫藍(lán)獺兔的遺傳多樣性，表明了青紫藍(lán)獺兔群體的遺傳多樣性較為豐富，3 個(gè)世代之間無顯著差異。此外，實(shí)驗(yàn)還需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步提高樣本的代表性及各遺傳多樣性參數(shù)穩(wěn)定性。

4 結(jié) 論

本研究使用的23 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（So144、12L4A1、6L1F10、6L3F8、D3Utr2、7L1B10、19L1C5、So133、So103、12LIE11、L8B5、D7Utr5、So162、Sat2、INRA CCDDV0007、INRACCDDV0087、INRACCDDV0185、INRACCDDV0190、INRACCDDV0192、INRACCDDV 0256、INRACCDDV0346、INRACCDDV0160、INRACCDDV0157）具有中度多態(tài)性，可用作遺傳多樣性分析有效遺傳標(biāo)記，兔群3 個(gè)世代的Obs He 都高于He，均在0.5 左右，表明青紫藍(lán)獺兔群體有較豐富的遺傳多樣性，同時(shí)，浙江余姚欣農(nóng)兔業(yè)有限公司的保種模式和方案得當(dāng)，保種效果良好。