云南木瓜紫米酒活性成分含量的測定分析

（墨江地道酒業(yè)有限公司，云南普洱 654800）

地道云南木瓜紫米酒是以墨江縣優(yōu)質(zhì)紫米釀制而成的優(yōu)質(zhì)白酒為基礎酒，加以切片后木瓜浸泡、貯存、過濾、調(diào)配等一系列工藝配制而成。按產(chǎn)品分類屬于配制酒[1]。墨江紫米營養(yǎng)豐富，有補血、健脾、理氣等藥用價值[2]，木瓜具有滋補健胃、舒筋活絡等功效[3]。配制酒的保健功能和獨特風味越來越受消費者的喜愛，因此，本研究旨在綜合開發(fā)利用墨江紫米和木瓜，并按蒸餾酒及其配制酒生產(chǎn)衛(wèi)生規(guī)范[4]進行了3 批次的木瓜紫米酒預生產(chǎn)調(diào)試試驗，并擬對其產(chǎn)品進行質(zhì)量控制研究。目前針對配制酒的活性成分研究主要以揮發(fā)性成分研究報道較多[5]，浸泡物成分的研究仍有研究空間。本研究以木瓜中的蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸為指標成分[6-7]，參考惠小娜等[8]的研究方法，建立了以UPLC-MS/MS 法測定了新產(chǎn)品地道云南木瓜紫米酒中蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸的含量，以期為該產(chǎn)品的標準制定和質(zhì)量控制提供參考、為該產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

酒樣：3批地道云南木瓜紫米酒（均為開發(fā)研究試制產(chǎn)品，廠家：墨江地道酒業(yè)有限公司，批號：20181110A、20190315A、20190412A）。

1.1.2 試劑

試劑及耗材：水楊酸對照品（批號：110742-201220，純度：99.1 %）、綠原酸對照品（批號：110753-201716，純度：99.3%）、蘆丁對照品（批號：100080-201610，純度：91.9 %）、沒食子酸對照品（批號：110831-201605，純度：90.8 %）均購自中國食品藥品檢定研究院，槲皮素對照品（批號：100081-200907，純度：96.5 %）購自中國食品藥品檢定所；甲醇（色譜純，美國Fisher 公司），甲酸（色譜純，美國Tedia 公司），實驗室用水為Mili-Q 超純水（德國Merck 公司）。

1.1.3 儀器設備

1290 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），G6430 三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司），XS205DU 十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler 公司），3-18KS 高速臺式冷凍離心機（德國SIGMA 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品溶液制備

精密稱取蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸對照品適量，加50%甲醇分別制成0.937 mg/mL、1.095mg/mL、0.975mg/mL、1.082mg/mL、1.105mg/mL、1.079 mg/mL、0.822 mg/mL、1.002 mg/mL、1.061 mg/mL貯備液。分別取各對照品溶液適量，置于同一100 mL容量瓶中，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸的混合對照品溶液，質(zhì)量濃度分別為1.950 μg/mL、31.11 μg/mL、0.2120 μg/mL、2.190 μg/mL、1.914 μg/mL。

1.2.2 供試品溶液制備

取地道云南木瓜紫米酒適量于PE 管中，置離心機中，10000 r/min 離心10 min 后，取上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3 空白樣品溶液

取紫米酒基酒，按“1.2.2”方法制備空白樣品溶液。

1.2.4 儀器測試條件

色譜條件：Agilent SC-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm,1.8 μm）；流動相：水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，10 %B；3～4 min，10%→30%B；4～5 min；30%→50%B；5～7 min，50 %→70 % B；7～10 min，90 % B；10～11 min，90%→10%B），流速為0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧負離子電離源模式（Electronic spray ion,ESI-），掃描方式為多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring,MRM），霧化氣壓力：30 psi，干燥氣溫度：300 ℃，干燥氣流速：9 L/min，毛細管電壓為3500 V，MRM 模式定量。5 種活性成分的電離方式、分子量、母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

本試驗考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、0.1 % 甲酸乙腈-水等流動相條件，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸乙腈-水條件下各組分均可以得到較好的分離和峰形；質(zhì)譜條件進行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，ESI 負離子掃描模式下5 種活性成分響應值均優(yōu)于ESI 正離子模式，因此本試驗選擇在ESI 負離子掃描模式下確定各成分母離子及其解簇電壓（DP），然后找出特定子離子，優(yōu)化得到最佳碰撞能（CE），最后在MRM 模式下優(yōu)化各成分的質(zhì)譜參數(shù)，優(yōu)化所得質(zhì)譜條件使各成分均顯示出較高的檢測靈敏度。優(yōu)化所得5 種活性成分UPLC-MS/MS 色譜圖分離度良好、峰形均較好、空白樣品無干擾。結(jié)果見圖1。

表1 5種待測活性成分質(zhì)譜條件

2.2 線性關系、定量限和檢測限

精密量取“1.2.1”項下混合對照品溶液適量，采用倍數(shù)稀釋法，用50%甲醇分別稀釋2 倍、5 倍、10倍、20 倍、100 倍、200 倍，制得6 個不同濃度梯度的系列溶液，按“1.2.4”項條件下分別進樣測定3 次，記錄峰面積。以對照品待測液濃度（x）為橫坐標，峰面積平均值（y）為縱坐標，進行回歸，再將混合對照品溶液逐步稀釋，分別以信噪比S/N=10、S/N=3 時的質(zhì)量濃度作為定量限和檢測限，結(jié)果見表2，各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。由檢出限和定量限結(jié)果可以看出，本方法靈敏度較高。

2.3 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（批號20181110A），于室溫下放置0、2 h、6 h、12 h、24 h 后在“1.2.4”項條件下進樣測定，根據(jù)蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸色譜峰面積計算RSD，分別為2.37%、0.66%、2.78 %、2.23 %、1.16 %。結(jié)果表明，該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 重復性試驗

圖1 多反應監(jiān)測模式下5種活性成分UPLC-MS/MS色譜圖

表2 5種成分的回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)、LOQ 和LOD

取同一批樣品（20181110A），按“1.1.2”方法制備供試品溶液6 份，在“1.2.4”項條件下進樣測定，測得地道云南木瓜紫米酒中蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸含有量計算RSD，分別為1.31%、1.18%、3.46%、2.26%、1.33%。結(jié)果表明，該方法重復性良好。

2.5 加樣回收率和精密度試驗

分別精密取0.1 mL 混合對照品溶液各6 份，于40 ℃氮氣吹干，分別精密加入同批次含有量已知的地道云南木瓜紫米酒（20181110A）10 mL，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，在“1.2.4”項條件下進樣測定，計算回收率和精密度。5 種活性成分的平均回收率分別為蘆丁99.8 %、綠原酸95.6 %、槲皮素102.4 %、沒食子酸101.2 %、水楊酸104.3 %，結(jié)果均在95.6 %～104.3 %。結(jié)果表明，該方法回收率良好，可用于準確測量；RSD 分別為2.31 %、2.87 %、4.69 %、3.12 %、2.96 %，均在2.31 %～4.69%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.6 樣品含有量測定

取不同批號地道云南木瓜紫米酒3 批，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，在“1.2.4”項條件下進樣測定，計算含有量，結(jié)果見表3。所測3 批地道云南木瓜紫米酒試制產(chǎn)品中，綠原酸含量最高，各批次間5 個成分的RSD 在0.94%～8.92%，各批次各成分含量較穩(wěn)定。

3 結(jié)論

地道云南木瓜紫米酒豐富了墨江紫米和木瓜的精深加工產(chǎn)品，對推動墨江紫米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有促進作用，并可給當?shù)貛硪欢ǖ慕?jīng)濟效益。本試驗經(jīng)方法學考察驗證，建立了UPLC-MS/MS 法同時測定地道云南木瓜紫米酒中蘆丁、綠原酸、槲皮素、沒食子酸、水楊酸的含有量，該方法簡便快速、專屬性強、靈敏度高，為地道云南木瓜紫米酒質(zhì)量控制及產(chǎn)品質(zhì)量標準的制定奠定基礎，為進一步開發(fā)利用該產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

表3 樣品測定結(jié)果(μ g/L，n=3)