巨噬細胞移動抑制因子在牛胚胎早期發(fā)育中的表達模式及作用初探

王麗君,王勇勝,李 楠,朱虹麗,龐 媛,張 輝*

(1.陜西中醫(yī)藥大學,中國陜西 咸陽 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,中國陜西 咸陽 712000;3.西北農林科技大學,中國陜西 楊凌 712100)

巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一種在進化中高度保守的蛋白質,具有重要的生物學功能。研究發(fā)現,MIF在調控宿主炎癥反應和免疫應答[1～2]、細胞增殖和凋亡[3]、細胞氧化還原[4]、腫瘤的生長和新生腫瘤血管的形成中起著重要作用[3,5]。除此之外,MIF還在哺乳類動物生殖系統(tǒng)各器官和母胎界面均有表達[6],參與了生殖過程的多個環(huán)節(jié),包括胚胎早期發(fā)育、胚胎植入、胎盤發(fā)育和妊娠維持[7～11]。

MIF在早期胚胎發(fā)育中的作用目前研究較少,已有的研究發(fā)現MIF調控蟾蜍胚胎的神經發(fā)育[12],調控斑馬魚胚胎組織增殖和分化[13],參與雞胚晶狀體的早期分化[14]。MIF在哺乳動物早期胚胎發(fā)育中的作用研究更少,目前相關研究僅在小鼠卵母細胞和胚胎中檢測了MIF基因的表達水平[15],在其他哺乳動物物種上未見相關報道。小鼠中的研究發(fā)現MIF基因在卵母細胞、受精卵及早期胚胎發(fā)育的各個時期均有表達,2細胞期表達水平最高,這提示MIF可能在哺乳動物胚胎早期發(fā)育中起到重要的調節(jié)作用,但需要進一步的研究來證明。MIF蛋白具有氧化還原酶的特性,可以通過調控細胞還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)水平使細胞免受氧化應激[4]。保持氧化還原內穩(wěn)態(tài)對胚胎發(fā)育至關重要[16],胚胎氧化還原水平失調會引起發(fā)育阻滯、DNA損傷、基因表達改變和凋亡等[17]。因此,我們推測MIF可能通過調控GSH水平在哺乳動物胚胎早期發(fā)育中起到重要的調節(jié)作用。本實驗通過實時定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)、Western-blot和顯微注射的方法對MIF在牛胚胎早期發(fā)育中的表達模式和功能進行初探,為進一步闡明MIF蛋白在哺乳動物早期胚胎發(fā)育中的作用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

從西安市三橋定點屠宰場采集牛卵巢,用于收集卵母細胞。核移植供體細胞使用實驗室凍存的奶牛胎兒成纖維細胞。冷凍精子購自上海光明荷斯坦牧業(yè)公司。所用的試劑除特別指明外,均購自 Sigma公司(美國)。TCM199、DMEM 和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自 ThermoFisher公司(美國);G1.5/G2.5購自Vitrolife公司(瑞典);Cell TrackerTMBlue CMF2HC Dye熒光染色劑購自Invitrogen公司(美國);蛋白酶抑制劑購自羅氏公司(瑞士);PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自TaKaRa公司(日本);PVDF膜購自Millipore公司(美國);Western-blot所用Whatman濾紙購自Bio-Rad公司(美國);兔源抗MIF多克隆抗體(ab7207)和兔源抗GAPDH單克隆抗體(EPR168-84)購自Abcam公司(英國);HRP標記山羊抗兔IgG二抗、蛋白質裂解液RIPA、SDS-PAGE配膠所用的30%丙烯酰胺和TEMED購自上海碧云天生物技術有限公司。細胞凍存管和細胞培養(yǎng)皿購自 Nunc 公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞的收集和體外成熟

將采集的牛卵巢放入15～20℃生理鹽水中,6～8 h內運送回實驗室,清洗3次后抽吸法采集卵母細胞。將吸取的卵泡液與采卵液以2︰1的比例混合并置入無菌的60 mm玻璃平皿中,然后放到體視顯微鏡下收集卵母細胞。選取卵丘細胞包裹較好且胞質均勻的卵丘-卵母細胞復合體放入卵母細胞成熟培養(yǎng)液中,在5% CO2、飽和濕度的38.5℃培養(yǎng)箱中進行成熟培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)20 h后收集排出第一極體的MII期卵母細胞,準備進行后續(xù)實驗。

1.2.2 體外受精(in vitro fertilization,IVF)

將荷斯坦牛細管凍精置于38℃水浴中快速解凍,解凍的精子放入平衡好的精子獲能液的底部,將離心管45度傾斜,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～45 min,完成精子上游過程。上游結束后吸取中上層3～4 mL的液體,1 000 r/min離心10 min,保留離心管底部100～200 L的液體,充分混勻。選取形態(tài)良好的MII期卵母細胞,移入平衡好的受精液微滴中,然后將處理好的精子移入此微滴中,在5% CO2、飽和濕度的38.5℃培養(yǎng)箱中完成受精過程。受精24 h后選出受精成功的胚胎,用透明質酸酶溶液處理去除顆粒細胞。

1.2.3 體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)

核移植供體細胞使用實驗室凍存的一月齡荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞,解凍后進行細胞傳代,取3～5代細胞作為核供體細胞。核移植受體細胞選取形態(tài)質量良好的MII期卵母細胞。SCNT的方法如文獻[18]所述,用透明質酸酶溶液處理去除顆粒細胞,然后放入含有7.5 g/mL細胞松弛素B(cytochalasin B,CB)和10%FBS的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)中孵育15 min。準備外徑為120～150 m、內徑為20～30 m的核移植固定管和內徑約為20 m的核移植去核管。用含7.5 g/mL CB和10%FBS的PBS在35 mm平皿內制作4個100 μL操作微滴,將處理好的卵母細胞放入其中一個微滴中。取接觸抑制3 d的供體細胞,使用0.25%胰蛋白酶消化液消化后放入與卵母細胞相鄰的微滴中。用固定管固定卵母細胞,用去核管扎入卵母細胞透明帶下,吸取極體及極體周圍部分卵母細胞胞質。去核完成后,用去核管吸取直徑為15～20 m的供體細胞,將供體細胞注入去核的卵母細胞透明帶下。注核時要使供體細胞盡量接觸卵母細胞胞質面,不要黏附在透明帶上。將完成注核的核質復合體放入融合液中平衡3～5 min,然后使用微電極法進行電融合。用融合針撥動核質復合體,將融合針放在核質接觸面的垂直方向,微微壓住核質復合體,操作電融合儀進行電融合。電融合參數:30 V電壓,20 s脈沖時長,2次脈沖,間隔10 s。電融合后,將核質復合體放入成熟培養(yǎng)液,在5% CO2、飽和濕度的38.5℃培養(yǎng)箱中平衡2 h,然后挑選融合成功的重構胚,使用離子霉素聯(lián)合6-DMAP的方法進行胚胎激活。

1.2.4 胚胎體外培養(yǎng)

將排出第二極體的IVF胚胎和激活后的SCNT胚胎用培養(yǎng)液洗滌3次,然后移入提前平衡好的G1.5培養(yǎng)液中,培養(yǎng)72 h后將胚胎移入提前平衡好的G2.5培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。整個培養(yǎng)過程都在5% CO2、飽和濕度的38.5℃培養(yǎng)箱中完成。分別在受精后和激活后 24 h、48 h、72 h、120 h 和168 h取IVF和SCNT胚胎的2細胞期、4細胞期、8細胞期、桑葚胚期和囊胚期胚胎。

1.2.5 牛胚胎cDNA的制備

收集所需的不同時期的胚胎,用DEPC處理的PBS(DEPC-PBS)清洗3遍。清洗后將胚胎放入含10 μL胚胎微量裂解液的無RNA酶的PCR管中,輕彈管壁,使胚胎充分裂解。向裂解液中加入2 μL提前預混好的DNA酶Ⅰ,37℃處理30 min,75℃處理5 min,以充分降解裂解液中的DNA。將制備好的RNA進行反轉錄,按照反轉錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit,TaKaRa)說明書,加入 4 μL 5× PrimeScript buffer、1 μL PrimeScript RT enzyme mix、1 μL Random 6 mers和 1 μL Oligo dT primer,并用無RNA酶超純水補齊至20 μL。PCR反應條件:37℃15 min,85℃5 s,4℃終止反應。獲得的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 RT-PCR

按照RT-PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)說明書,配制 20 μL RT-PCR反應體系:10 μL 2× SYBR premix Ex Taq Ⅱ、上下游引物各 0.8 μL(20 pmol/mL)、模板 cDNA 2 μL、50× ROX reference dye 0.4 μL以及DEPC處理的超純水6 μL。每個樣品重復3次。加樣完成后,采用ABI公司的StepOnePlusTMReal-Time PCR儀進行RT-PCR。RT-PCR反應條件:95°C作用30 s,隨后95°C變性5 s,60°C退火并延伸30 s,該過程循環(huán)40次。在每個循環(huán)中,測量熒光,繪制熔解曲線,分析各基因的熔解曲線并用電泳鑒定PCR產物。采用2-ΔΔCt法[19]對目的基因mRNA表達水平進行相對定量分析。所用定量引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 Western-blot

選取50～100個卵母細胞或不同發(fā)育階段的胚胎用于Western-blot。首先,使用臺式酸溶液處理3 min左右去除胚胎的透明帶,清洗3遍后放入含有蛋白酶抑制劑的蛋白質裂解液(RIPA)中充分裂解,裂解后的蛋白質樣品在100℃水浴鍋中變性10 min。用濕轉法將蛋白質轉移到PVDF膜上,轉膜后將膜放入含10%脫脂奶粉的TBST液中室溫封閉2 h,隨后將膜轉入含有目的蛋白克隆抗體(兔源抗MIF多克隆抗體和兔源抗GAPDH單克隆抗體)的封閉液中,4℃過夜孵育。一抗孵育結束后用TBST洗膜3次,每次10 min。洗滌后的膜放入含有HRP標記山羊抗兔IgG二抗的封閉液中,室溫孵育2 h。孵育結束后用TBST洗膜3次,每次10 min。洗滌后的膜用化學底物發(fā)光法進行顯色,然后在暗室中曝光。使用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics,Silver Spring,美國)對圖像進行分析,以測量蛋白質條帶的灰度值。將圖片轉換為灰度并反向顏色,修正光密度(integrated optical density,IOD)后,選擇計算平均灰度所需要的條帶區(qū)域,計算IOD和區(qū)域面積值,總的IOD除以總面積(sum IOD/sum area)即為圖片的平均灰度。

1.2.8 顯微注射

利用顯微注射儀將10 pL抗MIF抗體或IgG溶液注入MII期卵母細胞胞質中。隨后將卵母細胞放入5% CO2、飽和濕度的38.5℃培養(yǎng)箱中孵育1～2 h,使抗體與母源MIF蛋白充分結合。然后進行IVF及胚胎培養(yǎng)。

1.2.9 胚胎GSH水平檢測

使用Cell TrackerTMBlue CMF2HC Dye(4-chloromethyl-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin)熒光染色劑檢測胚胎GSH含量。將收集的各個時期的胚胎放入含有0.2%聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)的PBS中清洗3次,然后放入含10 μmol/L Cell Tracker Blue的胚胎培養(yǎng)液中,38.5℃避光放置30 min。將胚胎再放入PBS-PVA中清洗3次,隨后在熒光顯微鏡下觀察并照相。激發(fā)光使用330～380 nm的紫外光,激發(fā)光打開后精確計時30 s,并使用成像系統(tǒng)進行拍照。

熒光信號采用配置了Nikon DS-Ril數碼相機的Nikon ECLIPSE Ti-S型熒光顯微鏡進行檢測,每組胚胎都采用相同的參數采集照片。以單個胚胎染色區(qū)域的平均熒光強度代表不同發(fā)育階段胚胎的GSH水平。使用Image-Pro Plus 6.0計算熒光強度:將圖片轉換為灰度并反向顏色,修正IOD后,選擇計算平均熒光強度所需要的核區(qū)域,計算IOD和區(qū)域面積值,總的IOD除以總面積即為圖片的熒光強度。

1.2.10 數據分析

每組實驗都至少重復3次,用SPSS 18.0(Chicago,IL)統(tǒng)計軟件進行數據的處理和分析。采用單因素方差分析(ANOVA),不同組間選擇方差齊性檢驗下的LSD檢驗進行統(tǒng)計學差異分析。數據均用均值±標準差(±s)表示,P<0.05被認為在統(tǒng)計學上具有顯著性差異。

2 結果

2.1 MIF在牛IVF和SCNT胚胎早期發(fā)育過程中的表達模式

為了研究MIF在胚胎早期發(fā)育過程中的表達模式,在牛MII期卵母細胞、IVF胚胎和SCNT胚胎早期發(fā)育過程的不同階段檢測了MIF mRNA(圖1)和蛋白質(圖2)的表達。MIF mRNA 在 MII期卵母細胞和胚胎早期發(fā)育過程中持續(xù)表達,但都維持較低的表達量。MIF mRNA在MII期卵母細胞中表達量極低,在IVF胚胎2細胞期表達較高,隨后降低,在桑椹胚期表達量最低,囊胚期再次升高。SCNT胚胎中MIF mRNA的表達模式與IVF胚胎相似,2細胞期表達較高,隨后降低,桑椹胚期表達量最低,囊胚期再次升高,但其表達量在2細胞期、4細胞期、8細胞期和囊胚期顯著高于IVF胚胎,在桑椹胚期差異不顯著。

圖1 MIF mRNA在MII期卵母細胞、IVF胚胎和SCNT胚胎中的相對表達量*P<0.05,表示同組數據差異顯著。Fig.1 Relative expression levels of MIF mRNA in MII oocytes,IVF embryos and SCNT embryos*P<0.05,means significant difference,compared with its parallel group.

圖2 MIF蛋白在MII期卵母細胞、IVF胚胎和SCNT胚胎中的表達分析(A)MIF蛋白在MII期卵母細胞和IVF胚胎中的Western-blot分析;(B)MIF蛋白在MII期卵母細胞和SCNT胚胎中的Westernblot分析;(C)MIF蛋白在MII期卵母細胞、IVF胚胎和SCNT胚胎中的相對表達量。*P<0.05,表示同組數據差異顯著。Fig.2 Expression patterns of MIF protein in bovine MII oocytes,IVF embryos,and SCNT embryos(A)Western-blot analysis of MIF protein in MII oocytes and IVF embryos at the 2-cell,4-cell,8-cell and blastocyst stages;(B)Western-blot analysis of MIF protein in MII oocytes and SCNT embryos at the 2-cell,4-cell,8-cell and blastocyst stages;(C)Relative amount of MIF protein in MII oocytes,IVF embryos,and SCNT embryos.*P<0.05,means significant difference,compared with its parallel group.

MIF蛋白在MII期卵母細胞中高表達,并在胚胎早期發(fā)育過程中持續(xù)表達,在IVF胚胎2細胞期到8細胞期的表達逐漸降低,囊胚期表達升高。MIF蛋白在SCNT胚胎早期發(fā)育各階段的表達模式與IVF胚胎相似,2細胞期到8細胞期的表達逐漸降低,囊胚期表達升高,但是MIF蛋白的表達量在SCNT胚胎早期發(fā)育各階段顯著低于IVF胚胎。

和IVF胚胎相比,SCNT胚胎生產過程中存在一個去核過程,該過程會去掉卵母細胞核及周圍約1/4的胞質。為確定是否是去核過程影響了SCNT胚胎中MIF蛋白的表達量,我們對去核和未去核卵母細胞中MIF的表達量進行了研究,發(fā)現與未去核MII期卵母細胞相比,去核后MII期卵母細胞中MIF蛋白的表達量顯著降低(圖3)。

圖3 MIF蛋白在未去核和去核MII期卵母細胞中的表達分析(A)MIF蛋白在未去核和去核MII期卵母細胞中的Western-blot分析;(B)MIF蛋白在未去核和去核MII期卵母細胞中的相對表達量(*P<0.05)。Fig.3 Expression patterns of MIF protein in unenucleated and enucleated bovine MII oocytes(A)Western-blot analysis of MIF protein in unenucleated and enucleated MII oocytes;(B)Relative amount of MIF protein in unenucleated and enucleated MII oocytes(*P<0.05).

2.2 干擾MIF的表達對牛胚胎早期發(fā)育率的影響

由于MIF mRNA在MII期卵母細胞和早期胚胎發(fā)育過程中表達量很低,使用microRNA干擾的方法不能有效降低MIF蛋白的表達量,因此本實驗選擇顯微注射MIF抗體的方法來干擾MIF蛋白的表達。為了研究MIF蛋白對胚胎早期發(fā)育的影響,我們統(tǒng)計了MIF抗體注射組IVF胚胎、IgG注射組IVF胚胎、對照組IVF胚胎和SCNT胚胎的早期發(fā)育率(表2),發(fā)現24 h卵裂率在4組中沒有顯著差異,但是MIF抗體注射組的囊胚率顯著低于其他3組(17.3%vs.35.3%,36.5%,33.1%,P<0.05),且MIF抗體注射組的囊胚細胞數也顯著低于其他 3 組(85.6±9.3 vs.106.8±11.4,110.2±10.5,114.4±11.2,P<0.05)。此外,MIF抗體注射組中更多的胚胎發(fā)生8細胞阻滯,8細胞阻滯率顯著高于其他3組(51.2%vs.32.8%,29.5%,35.6%,P<0.05)。

表2 干擾MIF對牛IVF胚胎早期發(fā)育率的影響Table 2 Effect of MIF inhibition on in vitro development of IVF bovine embryos

2.3 干擾MIF的表達對牛IVF胚胎GSH水平的影響

為了驗證MIF蛋白對IVF胚胎GSH水平的影響,我們檢測了MIF干擾組和對照組胚胎在2細胞期、4細胞期、8細胞期和囊胚期的GSH水平(圖4)。MIF干擾組胚胎的GSH水平在2細胞期和4細胞期顯著低于對照組,8細胞期和囊胚期差異不顯著。

圖4 干擾MIF對IVF胚胎早期發(fā)育不同時期GSH相對熒光強度的影響*P<0.05,表示同組數據差異顯著。Fig.4 Effect of MIF inhibition on the relative fluorescence intensity of GSH in anti-MIF-IVF embryos and noninjected IVF embryos at the 2-,4-,8-cell and blastocyst stages*P<0.05,means significant difference,compared with its parallel group.

2.4 改變牛IVF胚胎GSH水平對胚胎早期發(fā)育的影響

GSH在細胞內是通過γ-谷氨酰循環(huán)合成的,半胱氨酸是其合成過程中一個重要的活性氨基酸前體,在培養(yǎng)液中添加半胱氨酸可以顯著提高胚胎中的GSH水平,而在培養(yǎng)液中添加GSH合成酶抑制劑丁硫胺酸亞砜胺(buthionine sulfoximine,BSO),可以顯著降低胚胎中的GSH水平。為了研究胚胎GSH水平對早期發(fā)育率的影響,我們在胚胎培養(yǎng)液中添加0.1 mg/mL半胱氨酸或5 mmol/L BSO,以上調或下調牛IVF胚胎GSH水平,染色后計算熒光強度。圖5的結果顯示:與IVF對照組相比,添加半胱氨酸可以顯著提高牛2細胞期、4細胞期和囊胚期GSH水平,添加BSO則顯著降低牛2細胞期、4細胞期、8細胞期和囊胚期GSH水平;MIF干擾組胚胎的GSH水平在2細胞期和4細胞期顯著低于IVF對照組,在2細胞期、4細胞期、8細胞期和囊胚期顯著低于半胱氨酸處理組,但在2細胞期和8細胞期顯著高于BSO處理組;向MIF干擾組胚胎培養(yǎng)液中添加半胱氨酸顯著提高2細胞期和4細胞期GSH水平,但其GSH水平與IVF對照組無顯著差異。以上信息說明,干擾胚胎MIF的表達顯著降低胚胎早期GSH水平,添加半胱氨酸可以使胚胎GSH水平恢復到正常水平。

圖5 添加半胱氨酸或BSO對IVF胚胎早期發(fā)育不同時期GSH相對熒光強度的影響同一組內不同小寫字母(a,b,c,d)代表差異顯著(P<0.05)。Fig.5 Effect of cysteine or BSO on the relative fluorescence intensity of GSH in IVF embryos at the 2-,4-,8-cell and blastocyst stagesValues with different lowercase letters(a,b,c,d)within groups are significantly different(P<0.05).

進一步對不同GSH水平的各處理組IVF胚胎的早期發(fā)育率進行統(tǒng)計(表3),發(fā)現GSH水平最低的BSO處理組胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚細胞數都顯著低于對照組和其他處理組,8細胞阻滯率則顯著高于對照組和半胱氨酸處理組;GSH水平最高的半胱氨酸處理組胚胎的囊胚率顯著高于對照組和其他處理組,卵裂率和囊胚細胞數也高于對照組,但差異不顯著;向MIF干擾組胚胎培養(yǎng)液中添加半胱氨酸顯著提高了胚胎的囊胚率和囊胚細胞數,同時顯著降低了胚胎的8細胞阻滯率。上述結果說明,胚胎GSH水平和IVF胚胎早期發(fā)育率及囊胚細胞數呈正相關,與8細胞阻滯率呈負相關。

表3 改變GSH水平對牛IVF胚胎早期發(fā)育率的影響Table 3 Effect of GSH levels on in vitro development of IVF bovine embryos

3 討論

本實驗研究了MIF mRNA和蛋白質在牛IVF胚胎和SCNT胚胎早期發(fā)育過程中的表達模式,發(fā)現MIF mRNA在IVF胚胎和SCNT胚胎早期發(fā)育過程中都呈現較低水平的持續(xù)性表達(圖1)。這個結果與之前在小鼠上的研究結果[15]相似,Suzuki等[15]以小鼠卵母細胞和附植前胚胎為研究對象,分析了MIF的轉錄表達水平,發(fā)現MIF在卵母細胞、受精卵及胚胎早期發(fā)育過程中持續(xù)表達,且在2細胞期呈現高的表達水平。但是該研究未涉及MIF mRNA在SCNT胚胎早期發(fā)育過程中的表達和MIF蛋白的表達。我們的研究發(fā)現,MIF mRNA在SCNT胚胎中的表達模式與IVF胚胎一致,都呈現持續(xù)性表達,但是MIF mRNA在SCNT胚胎2細胞、4細胞、8細胞和囊胚期的表達顯著高于IVF胚胎(圖1);MIF蛋白在IVF胚胎和SCNT胚胎早期發(fā)育過程中都呈現持續(xù)性表達,但SCNT胚胎的表達量顯著低于IVF胚胎(圖2)。為確定是否是SCNT去核過程去掉的卵母細胞核及部分胞質影響了SCNT胚胎中MIF蛋白的表達量,我們對去核和未去核卵母細胞中MIF的表達量進行了研究,發(fā)現去核后MII期卵母細胞中MIF蛋白的表達量顯著低于未去核的MII期卵母細胞(圖3)。MIF mRNA在胚胎早期發(fā)育中維持較低的表達量,因此,去核過程丟失的部分MIF蛋白可能是SCNT胚胎MIF蛋白表達量顯著低于IVF胚胎的重要原因。

我們進一步干擾了MIF在牛IVF胚胎中的表達,以研究其在早期胚胎發(fā)育中的作用。研究結果顯示,干擾MIF顯著降低囊胚率和囊胚細胞總數,且更多的胚胎在8細胞期之前發(fā)生發(fā)育阻滯(表2)。囊胚細胞總數是衡量囊胚質量的重要參數。我們的結果說明,MIF在哺乳動物胚胎早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用,干擾MIF對囊胚質量和發(fā)育能力有顯著的負面影響。相關研究報道,抑制MIF在非洲爪蟾胚胎中的表達,胚胎的神經形成完全受阻,處于尾芽期的胚胎完全缺乏神經和中胚層組織,且頭尾結構也嚴重缺陷[12];抑制MIF在斑馬魚胚胎中的表達,斑馬魚胚胎顯示出畸形的眼睛、頂蓋和第四腦室區(qū)域的異常腫脹,以及未發(fā)育的頜軟骨和胸鰭[13]。這些結果和我們的結果都說明,MIF對胚胎發(fā)育非常重要,干擾MIF會引起胚胎發(fā)育的阻滯或異常。

GSH是機體內的一個天然的氧自由基清除劑,通過保持細胞內氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)定,使細胞免受氧化應激帶來的傷害。保持氧化還原內穩(wěn)態(tài)對胚胎發(fā)育至關重要[16],胚胎氧化還原水平失調會引起發(fā)育阻滯、DNA損傷、基因表達改變和凋亡等。研究證明,GSH在成熟卵母細胞中呈現高的表達水平,使受精卵和早期胚胎免受氧化損傷[20]。為了研究MIF是否通過調控GSH在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用,我們檢測了干擾MIF后胚胎的GSH水平,發(fā)現干擾MIF顯著降低了胚胎在2細胞期和4細胞期的GSH水平,8細胞期和囊胚期的GSH水平也低于正常胚胎(圖4)。這個結果與Koga等[21]的研究結果相似,在心臟中敲除MIF導致其GSH水平降低,氧化型谷胱甘肽(L-glutathione oxidized,GSSG)水平升高,氧化應激水平升高。細胞水平的研究也獲得相似結果,在過氧化氫(H2O2)等過氧化物的刺激下,細胞MIF蛋白水平升高[22],引起細胞GSH濃度的顯著提高[4]。

我們在胚胎培養(yǎng)液中添加半胱氨酸或BSO來改變胚胎GSH水平,發(fā)現胚胎GSH水平和胚胎早期發(fā)育率及囊胚細胞數呈正相關,與8細胞阻滯率呈負相關。向MIF干擾組胚胎培養(yǎng)液中添加半胱氨酸可以使胚胎GSH水平恢復到正常水平,且顯著提高胚胎的囊胚率和囊胚細胞數,同時顯著降低胚胎的8細胞阻滯率,使胚胎早期發(fā)育率恢復正常水平(圖5,表3)。這個結果與De Matos等[23]的研究結果一致,在體外培養(yǎng)牛胚胎時加入GSH可以降低胚胎阻滯率,提高胚胎質量。

綜上所述,干擾MIF的表達顯著降低牛IVF胚胎的體外發(fā)育能力和囊胚質量,降低早期胚胎GSH水平;提高MIF干擾組胚胎的GSH水平可以改善胚胎早期發(fā)育率和囊胚質量。我們的結果證明,MIF蛋白在牛IVF胚胎早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,通過調控胚胎GSH水平影響胚胎早期發(fā)育能力和囊胚質量。有趣的是,SCNT胚胎在去核過程中丟失大量MIF蛋白,導致SCNT胚胎早期發(fā)育過程中MIF蛋白的表達量顯著低于IVF胚胎。降低的MIF蛋白可能會引起胚胎GSH水平異常,進而引起一系列的發(fā)育異常。SCNT胚胎普遍存在的重編程異常也與胚胎異常的氧化還原水平有關。因此,去核過程中母源MIF蛋白的降低可能是SCNT胚胎重編程不完全和克隆效率低下的一個原因,但這需要進一步的研究來證明。