HPLC法測(cè)定保健食品膠囊殼中合成著色劑含量

黃玉琴

（寧德市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，福建寧德 352100）

如今人們對(duì)于合成著色劑的添加認(rèn)知多是在飲料、果凍、熟肉制品中，在這些食品中，國(guó)家規(guī)定其能夠添加一定量的合成色素，但本文所探究的保健食品膠囊殼是否超范圍添加合成著色劑卻往往容易被人們所忽視。目前，保健食品的理化指標(biāo)檢測(cè)主要針對(duì)內(nèi)容物，涉及其包材即明膠空心膠囊的檢測(cè)較少。因此，對(duì)保健食品膠囊殼中合成著色劑進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可有效控制合成著色劑的濫用，對(duì)保障食品安全具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于是否添加或非法添加合成著色劑的檢測(cè)方法眾多，主要有高效液相色譜法[1-2]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3-5]、薄層色譜法、示波極譜法等[6]。高效液相色譜法由于儀器普及率高、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用。而其中最常見的方法是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中使用的聚酰胺吸附法以及液-液分配法[7-8]。此法的缺點(diǎn)是操作繁雜，在254 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，無法有效排除雜質(zhì)干擾。

本文采用水浸法提取和聚酰胺SPE固相萃取柱富集洗脫膠囊殼中合成著色劑，優(yōu)化高效液相色譜條件，使用各合成著色劑的特征波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，研究建立了一種用高效液相色譜法測(cè)定保健食品膠囊殼中7種合成著色劑含量的方法。采用該方法對(duì)13批明膠空心膠囊和4批保健食品膠囊殼進(jìn)行測(cè)定，均檢測(cè)出國(guó)標(biāo)允許使用的合成著色劑，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，為保健食品監(jiān)管提供建議。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

膠囊殼樣品來自市場(chǎng)購(gòu)買的13種有色空膠囊及4種有色保健食品膠囊殼。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，濃度1 mg/mL）；誘惑紅、赤蘚紅（北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司，濃度1 mg/mL）；甲醇（美國(guó)J.T.Baker，色譜純）；乙酸銨、無水乙醇、氨水（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；試驗(yàn)用水為超純水。

1.1.2 儀器

高效液相色譜儀（安捷倫1260，DAD檢測(cè)器）；色譜柱（安捷倫ZORBAX SB-C18， 250 mm×4.6 mm， 5 μm）；聚酰胺固相萃取柱（北京振翔科技有限公司，1 g/6 mL）；旋蒸儀（WZ-100SP，上海申生科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件、合成著色劑的特征波長(zhǎng)

色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18， 250 mm× 4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相：A甲醇，B乙酸銨（0.02 mol/L）；梯度洗脫程序：0～8 min，5% A；8～14 min，35% A；14.00～18.10 min，98% A；18.10～25.00 min，5% A；流速：1.00 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：檸檬黃428 nm、莧菜紅523 nm、胭脂紅510 nm、日落黃482 nm、誘惑紅510 nm、亮藍(lán)625 nm和赤蘚紅531 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品中間液和使用溶液的制備

（1）標(biāo)準(zhǔn)品中間液的配制。從檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)和赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液中各取2.0 mL于20 mL容量瓶中，加水定容，得到標(biāo)準(zhǔn)品中間液100 μg/mL。

（2）標(biāo)準(zhǔn)品使用溶液的配制。從標(biāo)準(zhǔn)品中間液中分別取0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL和10.0 mL于50 mL溶液瓶中，加水定容；分別得到1.0 μg/mL、 2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品使用溶液。

1.2.3 膠囊殼預(yù)處理

有色明膠空心膠囊13種（市購(gòu)），去除白色部分。膠囊殼帶顏色的保健食品4種（市購(gòu)），分別倒出硬膠囊內(nèi)容物，用棉簽粘無水乙醇，清凈膠囊殼內(nèi)表面內(nèi)容物。

1.2.4 樣品測(cè)定

取樣品約1 g，加入30 mL 60 ℃的熱水進(jìn)行溶解，取1.0 mL溶解液通過聚酰胺SPE固相萃取柱，柱子流速為5滴/min（活化：加入5 mL甲醇、5 mL水、5 mL pH=6的水），淋洗（10 mL水）、洗脫（加入15 mL氨水-乙醇2∶8洗脫），收集洗脫液，于60 ℃旋蒸至近干，用水定容至10 mL，過濾，取10 μL用于高效液相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 溶解溫度

針對(duì)膠囊殼在不同水溫下的溶解度不同，分別取50 ℃、60 ℃、70 ℃熱水進(jìn)行溶解。結(jié)果表明，當(dāng)水溫在50 ℃時(shí)，膠囊殼不能完全溶解，在60 ℃和70 ℃下，膠囊殼完全溶解。根據(jù)溫度越低能量損耗越低，將溶解溫度定為60 ℃。

2.1.2 稱樣量

各取3份樣品（1份稱0.5 g，1份稱1.0 g，1份稱 2.0 g），各加入30 mL 60 ℃熱水，取溶解液定容至10 mL，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果表明，稱樣量為0.5 g與2.0 g 時(shí)，各著色劑的回收率僅為60%～70%；而稱樣量在1 g的情況下，收率能夠達(dá)到80%以上，因此將稱樣量定為1 g。

2.1.3 梯度比例

參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB 5009.35—2016），洗脫比例設(shè)置如表1所示，其中第3組的流動(dòng)相比例，分離效果最佳，滿足試驗(yàn)要求。因此，本試驗(yàn)采用第3組的梯度洗脫比例。

表1 梯度洗脫比例表

2.1.4 波長(zhǎng)

使用254 nm波長(zhǎng)檢測(cè)得到的分離譜圖如圖1所示，其存在雜質(zhì)干擾而得不到良好的檢測(cè)結(jié)果；使用各合成著色劑特征波長(zhǎng)檢測(cè)得到的分離譜圖如圖2所示，其特征峰明顯，能排除雜質(zhì)干擾。因此，使用特征波長(zhǎng)檢測(cè)出的結(jié)果要比使用254 nm波長(zhǎng)檢測(cè)出的結(jié)果精確。

圖1 使用波長(zhǎng)為254 nm的分離譜圖

圖2 使用特征波長(zhǎng)的分離譜圖

2.1.5 試驗(yàn)時(shí)間

由于膠囊殼是食用級(jí)的明膠經(jīng)過處理制造而成的用于盛裝固體粉末、顆粒的卵狀空心外殼。經(jīng)過熱水溶解后冷卻，每過1 h觀察其凝固程度。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過12 h會(huì)重新凝固，因此實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)發(fā)生凝固，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果出現(xiàn)誤差。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性實(shí)驗(yàn)學(xué)驗(yàn)證

分別設(shè)置：1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL5個(gè)濃度點(diǎn)，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定。如表2所示，7種合成著色劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相對(duì)系數(shù)均大于0.999 0。

表2 各合成著色劑的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.2.2 精密度試驗(yàn)

根據(jù)所測(cè)濃度的峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差除以峰面積平均值得出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，可計(jì)算得出7種著色劑不同濃度、不同基質(zhì)的RSD值。由表3可知，該試驗(yàn)測(cè)得的RSD值均小于1%，表明具有較理想的精密度。

表3 各合成著色劑的RSD值

2.2.3 回收率試驗(yàn)

選取3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，每個(gè)濃度水平獨(dú)立測(cè)定3次。測(cè)定結(jié)果如表4所示，各標(biāo)準(zhǔn)品回收率為86.42%～96.70%，回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜1%，表明該方法的回收率符合測(cè)定要求，準(zhǔn)確度良好。

表4 各合成著色劑的回收率表

2.2.4 檢測(cè)限與定量限

以信噪比（S/N）=3，設(shè)定檢出限為0.5 mg/kg，經(jīng)試驗(yàn)檢測(cè)，可有效測(cè)出目標(biāo)物質(zhì)，結(jié)果如圖3所示。以信噪比（S/N）=10，設(shè)定量限為2.0 mg/kg，試驗(yàn)檢測(cè)效果良好，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）可知，7種合成著色劑的最大限量范圍為0.01～0.60 g/kg，本文測(cè)得的檢測(cè)限與定量限均低于最大限量范圍，證明方法可行。

圖3 檢測(cè)限為0.5 mg/kg時(shí)的色譜圖

圖4 定量限為2 mg/kg時(shí)的色譜圖

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1 g樣品，加入標(biāo)準(zhǔn)使用溶液5 μg/mL，依照1.2.4方法使用各合成著色劑特征波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，分別在0 h、4 h、8 h和12 h測(cè)得各組峰面積。由表5 可知，7種合成著色劑在12 h內(nèi)的峰面積保持穩(wěn)定，計(jì)算得到RSD均小于1%，表明樣品在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

表5 各合成著色劑不同進(jìn)樣時(shí)間內(nèi)峰面積的變化數(shù)據(jù)

2.3 結(jié)果測(cè)定

13批明膠空心膠囊（樣品編號(hào)1～13）和4批市面常見保健食品膠囊殼（樣品編號(hào)14～17）測(cè)定結(jié)果如表6所示，可以看出合成著色劑的含量范圍在0.02～5.90 g/kg，不同顏色的膠囊殼中含合成著色劑種類不同，含1種合成著色劑的有5批，含2種合成著色劑的有5批，含3種合成著色劑的有5批，含4種合成著色劑的有1批，含5種合成著色劑的有1批。對(duì)照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014），13批空膠囊中有9批合成著色劑超出標(biāo)準(zhǔn)范圍上限，4批市面常見保健食品膠囊殼中有3批合成著色劑超出標(biāo)準(zhǔn)范圍上限。

表6 13種明膠空心膠囊及4種保健食品膠囊殼測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究利用安捷倫1260型高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器）能夠?qū)崿F(xiàn)在不同時(shí)間段變換波長(zhǎng)進(jìn)行分段數(shù)據(jù)采集的特點(diǎn)，采用水浸法提取和聚酰胺SPE固相萃取柱富集洗脫膠囊殼中合成著色劑，優(yōu)化高效液相色譜條件，使用各合成著色劑的特征波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，研究建立了一種用高效液相色譜法測(cè)定保健食品膠囊殼中合成著色劑含量的檢測(cè)方法。7種合成著色劑分離效果良好，在1～20 μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相對(duì)系數(shù)均大于0.999 0，回收率為86.42%～96.70%，RSD均小于1%。檢出限為0.5 mg/kg，定量限為2.0 mg/kg。采用該方法對(duì)13批明膠空心膠囊和4批市面常見保健食品膠囊殼進(jìn)行合成著色劑含量檢測(cè)，均檢出國(guó)標(biāo)[8]允許使用的合成著色劑，該方法適用于保健食品膠囊殼中合成著色劑的測(cè)定。由于明膠空心膠囊廣泛用于包裝藥品或保健品，存在合成著色劑濫用的安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，國(guó)家應(yīng)建立一種科學(xué)的針對(duì)保健食品膠囊殼中合成著色劑的限量標(biāo)準(zhǔn)，并加強(qiáng)對(duì)保健食品膠囊殼中合成著色劑的檢測(cè)。