HER2靶向載HSV-TK基因納米泡誘導胃癌細胞凋亡的體外研究

辛瑩，周厚妊，張月，劉慧，黃馳，劉治軍*

1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院超聲科，遼寧沈陽 110004；2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽 110016；*通訊作者 劉治軍liuzj1@sj-hospital.org

納米泡作為腫瘤診療載體是近年研究熱點，可以特異性地靶向識別腫瘤部位，在超聲介導納米泡破壞（ultrasound-targeted nanobubble destruction，UTND）技術下使納米泡破裂，釋放攜帶的基因，實現(xiàn)腫瘤細胞的靶向治療[1-3]。然而，外源性基因進入細胞后會被核酸酶裂解，從而喪失功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胍丁胺（agmatine，AGM）-N,N-半胱氨酸雙丙烯酰胺（N,N′-cystamine bisacrylamide，CBA）與基因凝聚得到的基因載體復合物具有較高的細胞轉染率及良好的核定位效應[4-5]。HER2靶向載單純皰疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK）基因/AGM-CBA的全氟己烷納米泡（targeted HER2 AGM-CBA andHSV-TKgene-loaded perfluorohexane nanobubble，tHAHT NB）作為HSV-TK基因/AGM-CBA的載體，通過生物素-親和素法與HER2抗體Affibody連接，并包載具備相變能力的全氟己烷。本研究以人HER2陽性人胃癌細胞NCI-N87細胞株及HER2陰性人胃癌細胞MGC803細胞株作為材料，探討tHAHT NB的體外尋靶能力及核定位效應，以及聯(lián)合UTND技術抑制NCI-N87細胞生長活性和誘導其凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 二棕櫚酰磷脂酰膽堿（1,2-dipalmitoyl-snglycero-3-phosphocholine，DPPC）、生物素化聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（ 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]，Biotin-DSPE-PEG 2000）（西安瑞禧生物科技有限公司）；全氟己烷（perfluorohexane，PFH，上海氟科技）；生物素化的抗HER2 Affibody（Abcam）；單純皰疹病毒胸腺素激酶（HSV-TK）基因（Gama gene）；膽固醇（CH）及更昔洛韋（Sigma）；NCI-N87細胞株、MGC803細胞株（中國科學院細胞庫）；Annexin V、FITC凋亡檢測試劑盒（東仁化學科技有限公司）；MTT（大連美侖生物科技有限公司）。

1.1.2 儀器 聚碳酸酯膜擠出器（LiposoFast，AVESTIN）；RE-5203旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；低功率聚焦超聲實驗裝置（重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所）；流式細胞儀（FACS Calibur，BD）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon）；多功能酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 納米泡的制備

1.2.1 基因載體復合物的制備 本課題組前期采用AGM和CBA通過Michael加成法合成非病毒載體AGM-CBA[4]。以1∶9將AGM-CBA與HSV-TK質粒于37℃孵箱中孵育30 min，得到基因載體復合物。

1.2.2 納米泡的制備 采用薄膜水化法。將8.8 mg DPPC、3.0 mg CH和2.8 mg Biotin-DSPE-PEG 2000溶于無水乙醇中，在45℃、120 r/min下，于旋轉蒸發(fā)儀上旋蒸15 min，得到均勻的脂質膜。將2 ml PBS溶液緩慢加入含有脂質膜的瓶中，37℃、130 r/min水化15 min，得到脂質體懸液。加入80 μl PFH，在冰浴條件下采用聲振儀振蕩后，離心清洗，經(jīng)1 μm和400 nm聚碳酸酯膜擠出得到空白納米泡（perfluorohexane nanobubble，NB）。通過生物素-親和素法連接抗HER2分子Affibody，離心清洗后得到HER2靶向空白納米泡（targeted HER2 perfluorohexane nanobubble，tHER2 NB）。將制備的基因載體復合物溶于2 ml PBS溶液，加入含有脂質膜的西林瓶后同上述進行水化、清洗、擠出、連靶，得到HER2靶向載HSV-TK基因/AGM-CBA 的全氟己烷納米泡（targeted HER2 AGM-CBA andHSV-TKgene-loaded perfluorohexane nanobubble，tHAHT NB）。

1.3 細胞培養(yǎng)

1.3.1 細胞培養(yǎng) NCI-N87細胞接種于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，MGC803細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，傳代周期為3 d。

1.3.2 無低頻超聲輻照細胞轉染 將細胞以5×104個/孔接種于12孔板及共聚焦培養(yǎng)皿，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，過夜后棄去培養(yǎng)液，加入900 μl培養(yǎng)液及100 μl納米泡，對胃癌細胞進行轉染。

1.3.3 低頻超聲輻照下細胞轉染 胃癌細胞轉染后，經(jīng)體外超聲輻照（頻率650 kHz，強度1.5 W/cm，連續(xù)輻照30 s），4 h后更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育。觀察細胞活性及誘導凋亡作用時，按上述超聲處理24 h后加入200 μg/ml更昔洛韋（ganciclovir，GCV）100 μl，繼續(xù)孵育。

1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB的體外尋靶能力 利用DiI染色的tHAHT NB檢測其體外尋靶能力。將實驗分為NCI-N87組、MGC803組。按步驟1.3.2操作，孵育45 min后用4%多聚甲醛溶液固定，在激光共聚焦顯微鏡下對比觀察納米泡與NCI-N87細胞和MGC803細胞的靶向結合情況。采用ImageJ軟件對細胞熒光進行半定量化，并進行統(tǒng)計學分析。校正后累計光密度（IntDen）=（面積×平均灰度值）－（待測細胞面積×背景平均光密度）。

1.5 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB的核定位效應 利用DiI染色的HSV-TK基因驗證tHAHT NB在NCI-N87細胞中的核定位效應。按步驟1.3.3操作，孵育48 h后，PBS清洗3遍，用4%多聚甲醛溶液固定，棄去多聚甲醛，PBS清洗3遍，加入1 ml含10 μl Hochest的PBS，避光進行細胞核染色10 min，用PBS清洗3遍，使用激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞核定位情況。

1.6 細胞活性及凋亡情況

1.6.1 MTT法檢測不同處理組內NCI-N87細胞活性實驗分組為tHAHT NB+低頻超聲輻照組（tHAHT NB+US）、tHAHT NB組、tHER2 NB組、空白全氟己烷納米泡組（NB）、低頻超聲輻照組（US）、正常細胞組及空白組（不接種細胞，僅添加培養(yǎng)液），取對數(shù)生長期的NCI-N87細胞以104個/孔接種于96孔板內，各組經(jīng)處理后，每孔加入20 μl MTT，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內孵育4 h后棄去溶液，每孔加入150 μl DMSO，經(jīng)旋渦振蕩器振蕩10 min后，用酶標儀測定各孔吸光度（OD）值，根據(jù)公式（1）計算細胞活性。

1.6.2 流式細胞術檢測不同處理組內NCI-N87細胞凋亡情況 實驗分組及處理同MTT法，經(jīng)胰酶消化后取細胞懸液1000 r/min離心3 min，棄上清液，加入PBS溶液重懸細胞并洗滌3次，加入Annexin V結合液制成濃度為106個/ml的細胞懸液，取100 μl細胞懸液加入5 μl Annexin V，F(xiàn)ITC結合物和5 μl PI溶液，輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入400 μl Annexin V結合液，置入流式細胞儀進行分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.3.0軟件，細胞活性及細胞凋亡率以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Sidak檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 tHAHT NB與胃癌細胞的靶向結合情況 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB與NCI-N87細胞及MGC803細胞結合情況，NCI-N87細胞周圍可見大量紅色熒光，MGC803細胞周圍僅見少許紅色熒光（DiI標記的納米泡為紅色）（圖1A、B）。半定量分析結果顯示，與MGC803組相比，NCI-N87組累計熒光密度顯著增高（校正后IntDen=-0.24、1272.75），并且與細胞數(shù)目呈正相關（r=0.900，P＜0.01；圖1C），表明tHAHT NB具有良好的靶向能力。

圖1 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB與胃癌細胞體外尋靶實驗及細胞熒光半定量分析。MGC803組細胞周圍僅見少許紅色熒光（DiI染色，×200，A）；NCI-N87組細胞周圍可見大量紅色熒光（DiI染色，×200，B）；細胞熒光半定量分析示NCI-N87組校正后累計熒光密度與細胞數(shù)目呈正相關（C）

2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB的核定位效應 通過激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB的核定位情況發(fā)現(xiàn)，NCI-N87細胞的細胞核（藍色熒光）周圍有明顯的紅色熒光，且多聚集在細胞質及細胞核周圍（圖2）。

2.3 細胞增殖活性及凋亡情況 采用MTT法檢測細胞活性，Annexin V流式細胞儀檢測細胞凋亡率（圖3，表1），各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=139.2，P＜0.01）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，NB組與US組、tHER2 NB組與US組、NB組與tHER2 NB組間差異無統(tǒng)計學意義（t=1.70、2.16、0.46，P＞0.05）；與tHAHT NB組、tHER2 NB組、US組及NB組相比，tHAHT NB+US組細胞活性明顯減低，細胞凋亡率顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（MTT：t=11.48、18.09、18.55、20.25，P＜0.01；Annexin V：t=18.00、25.74、25.53、23.23，P＜0.01）。

圖2 激光共聚焦顯微鏡檢測tHAHT NB的核定位效應。細胞核染色顯示為藍色熒光（Hochest染色，×200，A）；HSV-TK基因染色顯示為紅色熒光（DiI染色，×200，B）；C為A和B的合并

圖3 細胞凋亡及細胞活性檢測。A～E分別為Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測tHAHT NB+US、tHAHT NB、tHER2 NB、NB、US組細胞凋亡情況；F為MTT法檢測不同處理組的細胞活性

表1 不同處理組對NCI-N87細胞活性及誘導凋亡的影響（±s，%）

表1 不同處理組對NCI-N87細胞活性及誘導凋亡的影響（±s，%）

注：與NB組比較，*P＜0.01，與tHAHT NB+US組比較，#P＜0.01

組別細胞活性細胞凋亡率tHAHT NB+US組 35.97±4.01* 54.3±3.5*tHAHT NB組20.7±3.1*#tHER2組 90.69±3.44# 6.2±0.7#70.70±8.00#NB組6.6±1.0#US組 97.21±2.04# 3.6±1.5#92.07±4.27#

3 討論

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)發(fā)現(xiàn)時已是晚期，尋找一種新的非侵入性治療方法具有重要意義[6-7]。自殺基因療法是目前腫瘤治療領域的研究熱點，其中HSV-TK基因/GCV系統(tǒng)較為成熟，HSV-TK基因表達后可將GCV代謝為丙氧鳥苷三磷酸形式，抑制DNA聚合酶或合并到新生DNA鏈中，終止DNA的復制，從而誘導腫瘤細胞凋亡[8-9]。HSV-TK/GCV系統(tǒng)具備兩種“旁觀者腫瘤細胞殺傷”機制：①局部“直接”旁觀者效應，經(jīng)縫隙連接轉移至未轉染的鄰近腫瘤細胞；②非局部全身免疫介導的旁觀者效應，在殺死表達HSV-TK的腫瘤細胞后，體內免疫狀態(tài)被激活，刺激細胞表面表達腫瘤特異性或相關抗原[10]。

缺乏安全高效的基因輸送系統(tǒng)是“自殺”基因治療的一大障礙[11]。納米泡作為腫瘤診療載體可以靶向識別腫瘤部位[12-13]，在UTND技術的空化作用及聲孔作用下可使外殼破裂，釋放基因及藥物，并增加血管內皮間隙和細胞膜通透性，從而彌補由于腫瘤異質性及增強滲透和保留（the enhanced permeability and retention，EPR）效應高度可變性引起的藥物及基因傳遞效率較低[14-15]。外源性基因進入細胞后，被核酸酶裂解而喪失功效，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，含胍基的可再生聚氨基胺類陽離子聚合物AGM-CBA可以凝聚和壓縮質粒DNA，保護其不被核酸酶降解，并在胍基的作用下促進細胞攝取和核定位效應，從而提高細胞轉染效率[16-17]。

本研究通過激光共聚焦顯微鏡和半定量分析發(fā)現(xiàn)，與MGC803細胞相比，NCI-N87細胞周圍可見大量紅色熒光，累計熒光密度顯著增高，并與細胞數(shù)目呈正相關，表明經(jīng)生物素-親和素法與HER2抗體Affibody連接的tHAHT NB具備靶向性，能夠特異性地識別并結合NCI-N87細胞。經(jīng)UTND技術處理后，HSV-TK基因多聚集于NCI-N87細胞的胞質及細胞核周圍，表明tHAHT NB具備核定位效應。MTT及Annexin V檢測發(fā)現(xiàn)，單純tHER2 NB、NB及US對細胞活性的影響及誘導凋亡的作用不顯著；tHAHT NB和tHAHT NB+US明顯減低了細胞增殖活性，并提高了細胞凋亡率；且tHAHT NB+US組較tHAHT NB組細胞活性顯著減低，細胞凋亡率明顯增高，表明UTND技術增強了tHAHT NB對細胞的增殖抑制及誘導凋亡的能力，其可能的機制為：①tHAHT NB在超聲輻照下通過空化效應使外殼坍塌，釋放HSV-TK基因/AGM-CBA；②在穩(wěn)定空化作用下tHAHT NB規(guī)律性機械擾動，改變細胞膜電位促進內吞作用；③在穩(wěn)定空化變?yōu)閼T性空化時，血管內皮細胞遭到破壞，擴散能力增強；④在慣性空化作用下細胞產(chǎn)生瞬態(tài)孔隙，促進細胞內大分子的攝取。

本研究表明，載HSV-TK基因的tHAHT NB聯(lián)合UTND技術能夠有效地抑制NCI-N87細胞的增殖活性，誘導細胞凋亡，但是未能深入研究UTND技術對促進基因轉染的機制，課題組將進一步研究UTND技術促進基因轉染的機制，并探討其是否會影響HSV-TK/GCV系統(tǒng)“旁觀者腫瘤細胞殺傷”機制。

總之，HER2靶向載HSV-TK基因/ACM-CBA的全氟己烷納米泡可以特異性地靶向識別NCI-N87細胞，并具備核定位效應，聯(lián)合UTND技術能夠有效地抑制NCI-N87細胞的增殖活性，顯著提高誘導細胞凋亡的作用。