中華小型豬急性心肌梗死后心肌炎癥模型的建立和驗(yàn)證

田毅，李巨波，張寶杰，魏紅星，張曉麗

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100029；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，國家心血管病中心，阜外醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，北京 100037；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，國家心血管病中心，阜外醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100037；*通訊作者 魏紅星 weihongxing@263.net

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后早期梗死區(qū)域可發(fā)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)，主要包括2個發(fā)展階段，第一階段的高峰在AMI后最初數(shù)小時到數(shù)天內(nèi)，以中性粒細(xì)胞浸潤為主，主導(dǎo)壞死心肌的清除；第二階段的高峰在AMI后3～10 d，以巨噬細(xì)胞浸潤為主，主導(dǎo)心肌修復(fù)[1-3]。近年研究表明AMI后的炎癥反應(yīng)，特別是第二階段的炎癥反應(yīng)與左心室重構(gòu)和預(yù)后有關(guān)[4-5]。因此，建立與人類接近的AMI 炎癥動物模型，通過分子顯像結(jié)合病理分析評估AMI后的炎癥反應(yīng)進(jìn)程，對于明確AMI后炎癥反應(yīng)的潛在病理生理學(xué)機(jī)制、建立精準(zhǔn)的臨床急性心肌梗死干預(yù)方法具有重要意義。

與小動物相比，大動物AMI后炎癥反應(yīng)更強(qiáng)烈，持續(xù)時間更長，更接近患者的AMI 炎癥反應(yīng)狀態(tài)[6]。在各種常見大動物中，豬的心臟解剖結(jié)構(gòu)及心率、凝血因子和纖溶活性等心臟生理指標(biāo)與人的心臟尤為接近，且在進(jìn)行AMI 建模過程中心肌梗死面積大小具有較高的可控性。

在炎癥反應(yīng)評價方面，由于活化后的炎癥細(xì)胞糖酵解速度和細(xì)胞膜表面的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（glucose transporters，GLUTs）數(shù)量增加，因此炎癥反應(yīng)部位葡萄糖代謝活性可以反映炎癥反應(yīng)的程度，18F-FDG PET/CT 作為無創(chuàng)的葡萄糖代謝顯像技術(shù)，能夠較好地評價炎癥反應(yīng)[7-9]。

本研究擬建立中華小型豬AMI 炎癥模型，并采用病理分析及18F-FDG PET/CT評價是否建模成功，以期提供用于AMI后炎癥反應(yīng)臨床轉(zhuǎn)化研究的模型建立和評價的可靠方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康中華小型豬15只[天津市百農(nóng)實(shí)驗(yàn)動物繁育科技有限公司（合格證號：No.12002600000321）]，6月齡，體重25～30 kg，雌雄不限，飼養(yǎng)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均為普通級。按簡單隨機(jī)抽樣法分為AMI組、正常對照組和假手術(shù)組，每組5只。實(shí)驗(yàn)豬建模后，待麻醉恢復(fù)正常后送回適宜恒定溫度和濕度的飼養(yǎng)間，每只飼養(yǎng)在固定的籠具中，每天給予2次適量的常規(guī)飼料喂養(yǎng)，通過自動飲水系統(tǒng)自動飲水。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)赫爾辛基宣言使用動物并對動物進(jìn)行護(hù)理。動物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號ZH16002。嚴(yán)格遵守《北京實(shí)驗(yàn)動物管理條例》及歐洲實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)護(hù)指南。

1.2 儀器 C 型臂X線機(jī)（OEC9900，通用電氣）；心電圖儀（BeneHeart R3A，深圳市邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；SPECT/CT（Symbia Intevo16，西門子）；冠狀動脈球囊擴(kuò)張導(dǎo)管（NC Trek RX Coronary Dilatation Catheter）等。

自制栓子：將球囊于1/2 處截斷，取直徑適合的凝膠海綿置入球囊前段內(nèi)，并檢查確定其穩(wěn)固性。凝膠海綿可于冠狀動脈內(nèi)吸收血液形成血栓，達(dá)到充分且永久地封堵冠狀動脈的效果。

1.3 動物模型制作 使用經(jīng)皮冠狀動脈球囊結(jié)合凝膠海綿聯(lián)合栓塞法制作AMI模型。具體操作步驟：實(shí)驗(yàn)豬禁食12 h后，肌注舒泰1.25 mg/kg 行誘導(dǎo)麻醉。于耳緣靜脈建立靜脈通路，行氣管插管，連接呼吸機(jī)及心電監(jiān)護(hù)儀，全程監(jiān)測心率、血壓、脈搏血氧、呼吸頻率等生命體征。通入異氟烷維持麻醉。將豬仰臥位置于實(shí)驗(yàn)臺上，給予肝素200 μl/kg 抗凝，右側(cè)腹股溝備皮，常規(guī)消毒后鋪巾，動脈穿刺后置入6F下肢鞘管。采用左前斜位（45°），在C 型臂X線機(jī)透視下經(jīng)鞘管將指引導(dǎo)管插入動脈，通過造影導(dǎo)絲導(dǎo)引指引導(dǎo)管至升主動脈，退出導(dǎo)絲，再次導(dǎo)引指引導(dǎo)管依次進(jìn)入左冠狀動脈竇、左主干、左前降支（left anterior descending artery，LAD）開口處，使導(dǎo)管開口與冠狀動脈開口同軸。注入碘普羅胺注射液行冠狀動脈造影，定位第一對角支，將指引導(dǎo)絲通過指引導(dǎo)管小心插入冠狀動脈左前降支遠(yuǎn)端，再沿導(dǎo)絲推送自制球囊至第一對角支以下約1～2 mm 處。退出導(dǎo)絲及球囊，留置前半部自制栓子于此位置。5 min后造影確認(rèn)阻斷血流后，再依次退出導(dǎo)管及鞘管，按壓主動脈止血后結(jié)束手術(shù)。假手術(shù)組除不使用栓子進(jìn)行血流阻斷外，其余操作均與AMI組一致。正常對照組不做特殊處理。

1.4 心肌灌注顯像 采用99Tcm-MIBI 心肌灌注顯像評價實(shí)驗(yàn)豬手術(shù)前后心肌血流灌注情況，驗(yàn)證AMI模型是否成功，并明確心肌梗死部位。采用Siemens Symbia T16 型雙探頭SPECT/CT 儀。顯像前禁食、禁水 12 h，常規(guī)麻醉實(shí)驗(yàn)豬后，經(jīng)耳緣靜脈注射99Tcm-MIBI 370 MBq，45 min后取仰臥位置于檢查床上，采集斷層圖像。采集條件：低能高分辨準(zhǔn)直器，兩探頭夾角90°，能峰140 keV，窗寬±20%，采集時間35 s/幀，6°/幀。采用Butterworth 濾波器（截止頻率0.35 cycles/cm 和階數(shù)5.0）進(jìn)行濾波反投影圖像重建，圖像矩陣大小128×128，放大倍數(shù)1.45。

1.518F-FDG 顯像 采用高脂低碳餐+禁食+肝素的方法抑制實(shí)驗(yàn)豬心肌生理性攝取[10]。顯像前1 d 給實(shí)驗(yàn)豬喂食高脂低碳餐，隨后禁食12 h。常規(guī)麻醉后，靜脈注射肝素50 IU/kg，15 min后靜脈注射18F-FDG 6～8 MBq/kg，1 h后仰臥位置于PET/CT檢查床（Siemens Biograph 64 型PET/CT 儀）。采集胸部CT用于衰減校正（CT 采集參數(shù)，管電壓120 kV、管電流10 mA）和解剖定位，隨后進(jìn)行心臟PET 采集，時長10 min。采用3D-OSEM（子集個數(shù)21，迭代次數(shù)2）方法對PET/CT圖像進(jìn)行重建。用MedEx 軟件對PET/CT圖像進(jìn)行定量分析。在心肌前壁（AMI組梗死區(qū)）勾畫感興趣區(qū)，獲取最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值（SUVmax）。假手術(shù)組和AMI組實(shí)驗(yàn)豬于術(shù)后第5天行PET/CT檢查（圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程。AMI組和假手術(shù)組分別于術(shù)前1 d 行99Tcm-MIBI 心肌灌注顯像，術(shù)后5 d 行99Tcm-MIBI 心肌灌注顯像和18F-FDG PET/CT 代謝顯像，正常對照組在AMI組和假手術(shù)組術(shù)后5 d 行 99Tcm-MIBI 心肌灌注顯像和 18F-FDG PET/CT 代謝顯像，顯像完成后即刻在麻醉狀態(tài)下處死實(shí)驗(yàn)豬

1.6 組織學(xué)分析 顯像完成后即刻在麻醉狀態(tài)下處死實(shí)驗(yàn)豬，快速取出心臟，并用生理鹽水沖洗。在左心室靠近中間的部位取前壁（AMI組梗死區(qū)）心肌組織，用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成5 μm 厚切片。用HE 染色和馬松染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變，采用免疫組化法鑒別CD68+巨噬細(xì)胞及GLUT-1、GLUT-3和GLUT-4 的表達(dá)。使用光學(xué)電子顯微鏡觀察切片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件，計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以±s表示。3組18F-FDG 攝取值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物模型驗(yàn)證 AMI組實(shí)驗(yàn)豬造模前后心電圖、血管造影及心肌灌注顯像見圖2。造模術(shù)前心電圖正常，術(shù)后心電圖顯示對應(yīng)胸部導(dǎo)聯(lián)均產(chǎn)生AMI 典型改變，包括前壁導(dǎo)聯(lián)ST 段弓背型抬高、對側(cè)心室壁導(dǎo)聯(lián)ST段壓低等。血管造影示術(shù)前冠狀動脈血流正常，術(shù)后前降支栓塞部位遠(yuǎn)端無造影劑通過。心肌灌注圖像顯示術(shù)前左心室各壁心肌示蹤劑分布均勻，未見示蹤劑攝取減低或缺損區(qū)，提示左心室各壁心肌血流灌注正常。術(shù)后圖像顯示前降支支配區(qū)域心尖和前壁呈示蹤劑攝取缺損區(qū)，提示左心室心尖和前壁心肌梗死。

HE 和馬松染色顯示正常對照組和假手術(shù)組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊。AMI組梗死區(qū)顯示大量心肌細(xì)胞壞死，細(xì)胞排列紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤及膠原蛋白沉積（圖3）。

圖2 AMI組實(shí)驗(yàn)豬球囊擴(kuò)張術(shù)前和術(shù)后心電圖、血管造影及心肌灌注顯像圖。術(shù)前心電圖正常（A），術(shù)后心電圖示前壁導(dǎo)聯(lián)ST 段弓背型抬高，對側(cè)心室壁導(dǎo)聯(lián)ST 段壓低（B）；血管造影示術(shù)前冠狀動脈血流正常（C）；術(shù)后前降支栓塞部位（箭）遠(yuǎn)端無造影劑通過（D）；心肌灌注圖像示術(shù)前左心室各壁心肌血流灌注正常（E）；術(shù)后心尖和前壁呈示蹤劑攝取缺損區(qū)，提示左心室心尖和前壁心肌梗死（箭，F(xiàn)）

2.218F-FDG 攝取 通過禁食聯(lián)合高脂低碳餐和靜脈注射肝素的方法，15只實(shí)驗(yàn)豬正常心肌的生理性攝取均被充分抑制。18F-FDG PET/CT圖像和對應(yīng)的半定量分析見圖4。PET/CT圖像示正常對照組和假手術(shù)組均未見明顯18F-FDG 攝取。AMI組心尖和前壁（圖2所示的血流灌注減低區(qū)）18F-FDG 攝取明顯增高。AMI組SUVmax為4.32±0.58，明顯高于正常對照組的1.10±0.10 及假手術(shù)組的1.08±0.08，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

2.3 巨噬細(xì)胞浸潤和GLUT表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，與正常對照組和假手術(shù)組比較，AMI組梗死區(qū)有大量CD68+巨噬細(xì)胞浸潤（圖5）。AMI組梗死區(qū)GLUT-1 和GLUT-3表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常對照組和假手術(shù)組。3組GLUT-4 均僅有微弱表達(dá)（圖6）。

圖3 實(shí)驗(yàn)豬HE（A～C）和馬松染色圖（D～F）。正常對照組和假手術(shù)組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤（×100，A、B）和膠原沉積（×100，D、E）；AMI組梗死區(qū)心肌細(xì)胞大片壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤（×100，C）和膠原沉積（×100，F(xiàn)）

圖4 實(shí)驗(yàn)豬 PET/CT圖（A）及SUVmax（B）比較。AMI組梗死區(qū)FDG 攝?。┟黠@高于正常對照組及假手術(shù)組，SUVmax 4.3

圖5 實(shí)驗(yàn)豬心肌組織CD68+免疫組化染色。正常對照組（×400，A）和假手術(shù)組（×400，B）未見巨噬細(xì)胞浸潤，AMI組梗死區(qū)大量巨噬細(xì)胞浸潤（×400，C）

3 討論

AMI 激發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥因子的釋放使大量炎癥細(xì)胞向梗死區(qū)募集浸潤。AMI后的炎癥反應(yīng)與左心室重構(gòu)和預(yù)后有關(guān)，其細(xì)胞類型、時間進(jìn)程、強(qiáng)度和范圍均影響組織修復(fù)過程，炎癥反應(yīng)過激或不足均會對左心室重構(gòu)和預(yù)后產(chǎn)生不良影響[11-12]。建立AMI 炎癥動物模型有助于研究炎癥反應(yīng)機(jī)制。本研究用中華小型豬建立AMI 炎癥反應(yīng)模型，并通過18F-FDG PET/CT評估炎癥反應(yīng)，為AMI 炎癥反應(yīng)相關(guān)的臨床轉(zhuǎn)化研究提供可靠的建模和評價方法。

AMI后的血液生化檢查僅能提供系統(tǒng)性炎癥信息，無法評估心臟局部的炎癥情況。CT檢查主要提供心臟和血管的解剖學(xué)信息，無法評價心臟局部的炎癥情況。近年較多研究使用18F-FDG PET顯像評價炎癥反應(yīng)，但由于正常心肌生理性攝取的不可預(yù)測性，給顯像前準(zhǔn)備和圖像解讀帶來很大挑戰(zhàn)。目前，部分抑制心肌生理性攝取的方法應(yīng)用于動物及臨床研究，如長時間禁食[13]、高脂低碳餐[14-15]或靜脈注射肝素[16-17]，這些方法在大多數(shù)臨床研究中均有效。然而，由于大多數(shù)麻醉劑會影響大鼠或小鼠心肌葡萄糖代謝，以致這些抑制心肌攝取的方法在小動物體內(nèi)效果不顯著[18]。因此，嚙齒類動物并非研究AMI后炎癥反應(yīng)的最佳選擇。Manabe 等[10]采用高脂低碳餐+禁食+肝素的組合方法抑制結(jié)節(jié)病患者的心肌生理性攝取，其有效抑制率高達(dá)100%。本研究采用相同的方法緩解了麻醉劑對心肌葡萄糖攝取的干擾，實(shí)驗(yàn)豬心肌生理性攝取的有效抑制率高達(dá)100%，獲得了良好的圖像質(zhì)量，為圖像解讀提供了便捷。

圖6 實(shí)驗(yàn)豬GLUT-1、GLUT-3 和GLUT-4 免疫組化染色。正常對照組（A、D）和假手術(shù)組（B、E）GLUT-1和GLUT-3表達(dá)微弱（×400）；AMI組梗死區(qū)有明顯的 GLUT-1 和GLUT-3表達(dá)（×400，C、F）；正常對照組、假手術(shù)組和AMI組GLUT-4均僅有微弱表達(dá)（×400，G～I(xiàn)）

炎癥細(xì)胞主要通過GLUT-1 和GLUT-3 攝取葡萄糖[18]。本研究免疫組化結(jié)果顯示梗死區(qū)有大量CD68+巨噬細(xì)胞聚集。與正常對照組和假手術(shù)組比較，梗死區(qū)GLUT-1 和GLUT-3表達(dá)強(qiáng)度明顯增加。PET/CT顯示梗死區(qū)18F-FDG 攝取明顯增加，免疫組化和PET結(jié)果表明梗死區(qū)18F-FDG 信號主要反映炎癥細(xì)胞的葡萄糖攝取。另外，正常心肌細(xì)胞主要表達(dá)GLUT-4，GLUT-4 由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位過程是限制心肌葡萄糖攝取的關(guān)鍵步驟。本研究中，3組GLUT-4 均僅有微弱表達(dá)。GLUTs 的表達(dá)驗(yàn)證了高脂低碳餐+禁食+肝素的方法抑制心肌生理性攝取的有效性，并在一定程度上揭示了心肌生理性攝取抑制的機(jī)制，也進(jìn)一步證實(shí)梗死區(qū)18F-FDG 信號與AMI后梗死區(qū)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。然而，本研究根據(jù)既往報道選擇AMI后的炎癥高峰時點(diǎn)進(jìn)行研究，并未對AMI后的炎癥反應(yīng)進(jìn)行動態(tài)觀察；另外，18F-FDG 信號雖然能夠反映炎癥水平，但其并非炎癥的特異性顯像劑。未來需要使用新型的炎癥細(xì)胞特異性顯像劑通過動態(tài)觀察，進(jìn)一步研究不同亞型炎癥細(xì)胞在AMI后不同階段的作用特點(diǎn)。

總之，本研究證明中華小型豬模型適用于AMI后炎癥反應(yīng)的評估和臨床前研究。18F-FDG PET/CT可以無創(chuàng)地評價AMI后心臟局部的炎癥反應(yīng)，并可在梗死大小、心臟幾何容積和功能之外提供有價值的信息。