側(cè)柏葉對(duì)家兔心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)及其膽堿能抗炎作用*

李 麗 高 波 劉梅芳

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826)

冠心病嚴(yán)重威脅人類健康，心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)是冠心病治療過程中面臨的一大挑戰(zhàn)，而尋求抵抗MIRI的藥物具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前認(rèn)為，MIRI的損傷機(jī)制與自由基損傷、鈣超載和炎性損傷等有關(guān)[1]。

我們的前期研究表明，側(cè)柏葉(Cacumen Biotae,CB)乙酸乙酯提取物具有抗氧化應(yīng)激、抗炎[2]等功效，因此我們推測(cè)CB乙酸乙酯提取物對(duì)MIRI有治療作用。本文以心率、收縮壓、血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-a)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、乙酰膽堿(acetyl choline,ACH)以及心肌組織總一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase,NOS)為檢測(cè)指標(biāo)，探討CB對(duì)家兔MIRI的保護(hù)效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康成年家兔32只，體重2～2.5kg，雌雄不限，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑

側(cè)柏葉取自濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院本草園，去枝干，留針尖葉。石油醚分析純(批號(hào)：20130419)購(gòu)自煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯(批號(hào)：20151214)購(gòu)自上海山蒲化工有限公司；LDH(批號(hào)：20170516)試劑盒、CK(批號(hào)：20170511)試劑盒、IL-6(批號(hào)：20170518)試劑盒、TNF-α(批號(hào)：20170518)試劑盒、ACH(批號(hào)：20170517)試劑盒以及NOS(批號(hào)：20170511)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 側(cè)柏葉乙酸乙酯萃取物制備

新鮮側(cè)柏葉200g，清洗陰干后，用粉碎機(jī)磨成粗粉，并以1∶10的比例連續(xù)3次加水煎煮，每次1.5h，合并煎液并用抽濾裝置過濾，并將濾液于60℃以下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，然后用分液漏斗按照1∶1的比例，先用石油醚萃取分層后取水層，再用同等比例的乙酸乙酯萃取，最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮為浸膏，得側(cè)柏葉乙酸乙酯萃取物，并置于4℃冰箱備用，用蒸餾水將側(cè)柏葉乙酸乙酯萃取物稀釋為1×103g/L的混懸液灌胃。

1.4 家兔MIRI模型制備

家兔被麻醉、仰臥位固定、氣管插管后，沿胸骨正中線右側(cè)旁開1～2cm處切開皮膚，鈍性分離皮下組織，暴露并剪斷3～5根肋骨，暴露心臟，剪開心包膜，提起右心耳，將連有縫合線的無創(chuàng)小圓彎針從右冠狀溝下方穿過，再用套有橡膠管的細(xì)鐵鉤勾住縫合線的兩端，并緩慢拉入橡膠管，之后再將家兔的肌肉和皮縫合，并將橡膠管暴露在外。輕拉縫合線，收緊橡皮管，用止血鉗同時(shí)鉗住縫合線和橡膠管30min，以此造成冠狀動(dòng)脈的缺血，松開止血鉗使心臟再灌注30min，以此制備家兔心肌缺血再灌注的模型。實(shí)驗(yàn)過程中，心電圖Ⅱ?qū)?lián)顯示ST段顯著抬高或壓低說明心肌缺血成功，放松縫合線后，心電圖Ⅱ?qū)?lián)顯示ST段或T波較前有回落，說明再灌注成功。

1.5 動(dòng)物分組及指標(biāo)測(cè)定

健康成年家兔32只隨機(jī)被分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、側(cè)柏葉乙酸乙酯提取物組以及側(cè)柏葉迷走神經(jīng)切斷組，每組各8只。各組動(dòng)物均按照?qǐng)D1所示的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行操作，心肌缺血30min再灌注30min后，頸總動(dòng)脈取血、取心臟后，分別進(jìn)行心肌切片TTC染色，再次確認(rèn)造模是否成功；心肌總NOS含量測(cè)定(比色法)、血清CK、LDH含量測(cè)定(比色法)、血清TNF-α、IL-6含量測(cè)定(ELISA法)以及血清ACH含量測(cè)定(微板法)，以觀察側(cè)柏葉對(duì)家兔MIRI的保護(hù)效應(yīng)及膽堿能抗炎通路在此過程中的作用。

注：TTC.氯化三苯基四氮唑

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 4組家兔動(dòng)脈收縮壓和心率變化比較

假手術(shù)組家兔手術(shù)前后收縮壓和心率無明顯變化(P>0.05)，除乙酸乙酯提取物組心肌缺血后收縮壓下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組家兔心肌缺血后收縮壓均明顯下降，心率減慢(P<0.05)，心肌缺血-再灌注后心率、收縮壓進(jìn)一步下降(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比，側(cè)柏葉乙酸乙酯提取物組心肌缺血-再灌注后心率和收縮壓的下降率(缺血前-再灌注后30min/缺血前)明顯降低(P<0.01)，但與側(cè)柏葉乙酸乙酯提取物組相比，側(cè)柏葉迷走神經(jīng)切斷組收縮壓和心率的下降率明顯升高(P<0.01)，如表1所示。

表1 4組家兔心肌缺血-再灌注前后心率及收縮壓的變化

2.2 4組家兔血清心肌酶的含量比較

與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組、側(cè)柏葉乙酸乙酯提取物組以及側(cè)柏葉迷走神經(jīng)切斷組血清CK、LDH含量明顯升高(P<0.01)，但與模型對(duì)照組相比，側(cè)柏葉乙酸乙酯提取物組和側(cè)柏葉迷走神經(jīng)切斷組明顯降低(P<0.01)，而側(cè)柏葉乙酸乙酯提取物組又明顯低于側(cè)柏葉迷走神經(jīng)切斷組(P<0.01)。見表2。

表2 4組家兔心率和收縮壓變化率以及血清LDH和CK含量比較

2.3 4組家兔血清Ach、TNF-α、IL-6及心肌組織總NOS的含量

與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組、側(cè)柏葉乙酸乙酯提取物組和側(cè)柏葉迷走神經(jīng)切斷組血清Ach、TNF-α、IL-6含量明顯升高(P<0.01)，心肌組織總NOS含量明顯降低(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比，側(cè)柏葉乙酸乙酯提取物組血清TNF-α、IL-6含量則明顯降低(P<0.01)，血清Ach和心肌組織總NOS含量明顯升高(P<0.01)。而側(cè)柏葉乙酸乙酯提取物組血清TNF-α、IL-6含量明顯低于側(cè)柏葉迷走神經(jīng)切斷組(P<0.01)，血清ACH以及心肌組織總NOS含量明顯高于側(cè)柏葉迷走神經(jīng)切斷組(P<0.01)。見表3。

表3 4組家兔血清Ach、TNF-α、IL-6水平和心肌組織NOS含量比較

3 討論

目前，冠心病發(fā)病率和死亡率逐年上升，且發(fā)病年輕化趨勢(shì)明顯[3-4]。冠狀動(dòng)脈再通是治療冠心病的主要方法，但冠狀動(dòng)脈再通后容易導(dǎo)致MIRI，所以尋求能對(duì)抗MIRI的藥物具有重要意義。我們的研究表明，側(cè)柏葉乙酸乙酯提取物能明顯減小家兔MIRI心率和收縮壓的降低率，顯著減弱血清心肌酶CK和LDH的升高，提示側(cè)柏葉對(duì)MIRI具有保護(hù)作用，這將對(duì)冠心病的治療提供重要的參考依據(jù)。

在人類及哺乳動(dòng)物，竇房結(jié)、右心房、右心室、房室結(jié)、左室后壁等均接受右冠狀動(dòng)脈的供血[5]，因此右冠狀動(dòng)脈供血不足可導(dǎo)致心率減慢和收縮壓降低。缺血-再灌注后可使心肌細(xì)胞水腫、胞膜和線粒體的損傷進(jìn)一步加劇[6]。這可能是導(dǎo)致心肌缺血-再灌注后心率與收縮壓進(jìn)一步降低的原因[7]。心肌內(nèi)存在大量的心肌酶，在心肌細(xì)胞膜通透性增加或心肌缺血性壞死時(shí)，大量的心肌酶釋放入血，引起血清中心肌酶升高，而血清心肌酶的升高程度在某種程度上與心肌細(xì)胞的損傷成正相關(guān)[8]。在本研究中，側(cè)柏葉能明顯降低家兔MIRI后血清CK和LDH水平，明顯減小心率和收縮壓的降低率，提示側(cè)柏葉對(duì)家兔心肌MIRI具有保護(hù)作用。

Bernik等[9]研究發(fā)現(xiàn)，刺激迷走神經(jīng)能明顯減輕大鼠心肌缺血-再灌注模型的炎癥反應(yīng)，而切斷迷走神經(jīng)后這種保護(hù)效應(yīng)消失。Li等[10]研究也發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌缺血-再灌注模型，給予a7煙堿型乙酰膽堿受體激動(dòng)劑后能明顯減少缺血心肌的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，降低心肌酶含量，減輕心肌的超微結(jié)構(gòu)損傷。以上結(jié)果提示，在一定程度上，迷走神經(jīng)活性增強(qiáng)能明顯減輕心肌MIRI。在本研究中，側(cè)柏葉能明顯減小心肌缺血-再灌注后收縮壓、心率的降低率，但在迷走神經(jīng)切斷后，側(cè)柏葉的以上保護(hù)作用明顯減弱，提示迷走神經(jīng)切斷后側(cè)柏葉對(duì)心肌MIRI的保護(hù)作用明顯減小，說明迷走神經(jīng)在此過程中作用關(guān)鍵。已有研究證實(shí)，迷走神經(jīng)釋放的乙酰膽堿通過結(jié)合免疫細(xì)胞表面的a7煙堿型乙酰膽堿受體阻斷NF-κB通路，抑制炎性因子及TNF-a和IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)。而大量釋放的TNF-α和IL-6等卻能激活NF-κB通路,下調(diào)NOS的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，加重心肌損傷。在本研究中，側(cè)柏葉能明顯降低心肌缺血-再灌注后血清TNF-α和IL-6水平，增加血清Ach及心肌組織NOS含量，提示側(cè)柏葉對(duì)MIRI的保護(hù)作用與膽堿能抗炎通路有關(guān)。而迷走神經(jīng)切斷后，側(cè)柏葉的以上作用明顯減弱，進(jìn)一步提示側(cè)柏葉對(duì)MIRI的保護(hù)作用與膽堿能抗炎通路有關(guān)。