枯草芽孢桿菌BA015對(duì)無乳鏈球菌的拮抗作用及其物質(zhì)分析

陸曉岑，杜明洋，周維佳，馬紅麗，黃璐熹，玉潔瑩，劉建男，郭思聰，趙小然，葉仕根

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連市海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

鏈球菌是一種條件性人畜共患病病原菌，可感染人類和幾乎所有海淡水魚類，可引起局部組織蜂窩織炎、心內(nèi)膜炎及化膿性腦膜炎等[1]。目前，發(fā)現(xiàn)的水生動(dòng)物致病性鏈球菌主要有無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae、海豚鏈球菌Streptococcusiniae和停乳鏈球菌Streptococcusdysgalactiae等種類。無乳鏈球菌又稱B群鏈球菌 (Group BStreptococcus)， 是鏈球菌中重要類型之一[2]。無乳鏈球菌除可感染人、牛、豬、狗外，還可感染海灣鯡Brevoortiapatronus、海鯰Ariusfelis、羅非魚Oreochromisniloticus、日本沼蝦Macrobrachiumnipponense、牛蛙Bullfrog等[3]。如無乳鏈球菌能夠引起新生兒敗血癥，血液中可分離培養(yǎng)出鏈球菌，感染后死亡率很高；感染無乳鏈球菌的羅非魚在泰國炎熱季節(jié)的死亡率高達(dá)95%，無論是在經(jīng)濟(jì)上還是在市場供應(yīng)方面都造成了重大損失[4]；2009、2010年在浙江養(yǎng)殖牛蛙地區(qū)發(fā)生一種新的無乳鏈球菌流行病，在蝌蚪和剛變態(tài)幼蛙中的發(fā)病率已超過了60%，該病死亡率也極高, 通常達(dá)60%以上[5]。

水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治方法主要有投喂抗生素和化學(xué)合成抗菌藥物、接種疫苗預(yù)防及使用微生態(tài)制劑調(diào)控等[6]。目前，抗菌藥物治療是中國水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病防治的主要手段之一。然而，長期大量使用抗菌藥物易導(dǎo)致藥物殘留、增加病原菌的耐藥性，甚至?xí)a(chǎn)生超級(jí)耐藥菌株。接種疫苗雖具有安全、特異及綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在效果不穩(wěn)定、操作不便等問題，且目前多數(shù)水生動(dòng)物疾病尚無疫苗可用。微生態(tài)制劑是在微生物理論指導(dǎo)下,對(duì)宿主有益的活性微生物及其代謝產(chǎn)物和促生長物質(zhì)的制劑，具有維持宿主微生態(tài)平衡、提高機(jī)體健康水平、拮抗病原及改善養(yǎng)殖水環(huán)境等多種作用，已在人類健康及多種水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控中表現(xiàn)出良好功效[7]。本研究中，以重要的水產(chǎn)病原菌——無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae為指示菌，以實(shí)驗(yàn)室分離、保存不同來源芽孢桿菌為備選菌株進(jìn)行病原拮抗菌株篩選及主要拮抗物質(zhì)分析，以期從微生態(tài)制劑防控的角度為水生動(dòng)物無乳鏈球菌病防治提供新的思路和參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

備選菌株：本試驗(yàn)所用21株芽孢桿菌分離自鹽堿地養(yǎng)殖池塘、海洋牧場或受贈(zèng)于研究所等地，保存在大連市海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱(-80 ℃)中。

指示菌：無乳鏈球菌(KCCM11957)，由韓國釜慶大學(xué)魚病預(yù)防實(shí)驗(yàn)室自牙鲆腸道分離鑒定并贈(zèng)予，保存于大連市海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱(-80 ℃)中。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的篩選與鑒定 拮抗菌的初篩方法參考李云等[8]的報(bào)道，采用雙層平板法。用接種針或滅菌牙簽將備選菌株點(diǎn)種于底層含NaCl質(zhì)量濃度為30 g/L的NA平板上，28 ℃下倒置培養(yǎng)。待備選菌株形成肉眼可見菌落后，在底層平板上倒入10 mL左右混有109CFU/mL無乳鏈球菌的半固體培養(yǎng)基(含30 g/L的NaCl和250 g/L瓊脂的NB)，于28 ℃培養(yǎng)6～8 h后，觀察并測量備選菌株的菌落和抑菌圈直徑。將有明顯抑菌活性的備選菌株進(jìn)行復(fù)篩。

拮抗菌的復(fù)篩方法參照Yang等[9]的報(bào)道，采用瓊脂擴(kuò)散法(打孔法)。挑取拮抗菌單菌落于液體培養(yǎng)基中，180 r/min恒溫28 ℃振蕩培養(yǎng)12 h獲得種子液。將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床中培養(yǎng)36 h。取發(fā)酵液于4 ℃、4 000 r/min下離心10 min，取上清液，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后得到拮抗菌去菌體發(fā)酵液(CFS)待用。在半固體培養(yǎng)基滅菌后約45 ℃時(shí)加入指示菌菌液，使指示菌終濃度為105～106CFU/mL后倒板。平板凝固后用直徑5 mm的打孔器打孔，加入35 μL的CFS，28 ℃培養(yǎng)12 h后觀察結(jié)果，并測量抑菌圈直徑。選取CFS抑菌效果最好的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)將篩選獲得的拮抗菌進(jìn)行生理生化鑒定。拮抗菌16S rDNA鑒定采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測序。測序結(jié)果在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，選擇相似度較高序列并使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹分支置信度用1 000次重復(fù)自舉檢驗(yàn)，在計(jì)算過程中，系統(tǒng)自動(dòng)省略不確定和缺失的位點(diǎn)。

1.2.2 抑菌物質(zhì)的純化及最小抑菌濃度(MIC)測定 采用硫酸銨沉淀法初步純化拮抗菌胞外抑菌物質(zhì)。將CFS于4 ℃時(shí)加入硫酸銨，使硫酸銨飽和度分別達(dá)到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，于4 ℃靜置過夜，以10 000 r/min離心30 min，收集沉淀。沉淀重懸于0.01 mol/L的PBS緩沖液后，置于相對(duì)分子質(zhì)量為1 000的透析袋透析24 h，測定經(jīng)不同飽和度硫酸銨沉淀后抑菌物質(zhì)的抑菌活性。選擇最適飽和度硫酸銨純化物質(zhì)經(jīng)Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析分段分離，用0.01 mol/L的PBS緩沖液洗脫，流速為0.5 mL/min，10 min為一組。經(jīng)指示菌檢測獲得抑菌活性最強(qiáng)的組分，取其進(jìn)行后續(xù)檢測。

取10個(gè)滅菌試管，編號(hào)1～10號(hào)，并加入NB肉湯1.0 mL。于1號(hào)管中加入1.0 mL抑菌活性最強(qiáng)組分溶液并在1～7號(hào)管中進(jìn)行倍比稀釋。1～7號(hào)管再加入100 μL指示菌。8號(hào)管不加抑菌物質(zhì)，9號(hào)管不加指示菌，10號(hào)管僅加1.0 mL NB肉湯。于28 ℃培養(yǎng)24 h后觀測結(jié)果。

1.2.3 抑菌物質(zhì)的MALDI-TOF-MS和LC-MSMS檢測 采用MALDI-TOF-MS(由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所完成)和LC-MSMS(由生工生物工程(上海)股份有限公司完成)法測定菌株抑菌物質(zhì)成分。

1.2.4 主要抑菌物質(zhì)的理化特性分析 物理因素對(duì)抑菌物質(zhì)的影響參照Wen等[10]的方法進(jìn)行。將純化的活性組分分別置于40、60、80、100、121 ℃溫度下孵育20 min，以熱處理前樣品作為對(duì)照，研究溫度對(duì)活性組分抑菌作用的影響。調(diào)節(jié)活性組分pH分別為2、4、6、8、10，處理30 min后調(diào)節(jié)pH至7，以處理前活性組分作為對(duì)照，研究pH對(duì)活性組分抑菌活性的影響。將活性組分置于20 W紫外燈下分別照射1、3、5 h，照射距離為15 cm，以未用紫外照射的抑菌物質(zhì)溶液作為對(duì)照組，研究紫外照射對(duì)活性組分抑菌活性的影響。

化學(xué)因素對(duì)抑菌物質(zhì)的影響參照張寶[11]的方法進(jìn)行。分別加入蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶，使酶的終質(zhì)量濃度為1 mg/mL(調(diào)節(jié)胃蛋白酶處理組pH為2)，于37 ℃條件下水浴處理2 h，然后置于100 ℃條件下金屬浴5 min，以未添加蛋白酶的抑菌物質(zhì)作為對(duì)照組，研究蛋白酶對(duì)活性組分抑菌活性的影響。向活性組分中分別加入等量的甲醇、乙醇和丙酮有機(jī)溶劑，置于室溫條件下1 h，以不添加有機(jī)溶劑的抑菌物質(zhì)作為對(duì)照組，研究有機(jī)溶劑對(duì)活性組分抑菌活性的影響。將活性組分的pH調(diào)節(jié)為2，于4 ℃條件下靜置12 h。在4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，收集沉淀。用甲醇抽提沉淀3次，得到拮抗菌的活性組分，利用薄層層析硅膠板進(jìn)行層析，用質(zhì)量濃度為5 g/L的茚三酮水溶液顯色并觀察結(jié)果。

從本次奇異變化的特征看，與地震前兆異常有一定的相似性(魏慶汝，2000)。另外，汶川地震前，全國地?zé)崤_(tái)網(wǎng)的256口觀測井，有40口觀測到了疑似異常，震前陡降異常有15口，占異?？倲?shù)的37.5%。這類異常出現(xiàn)時(shí)間與地震發(fā)生時(shí)間相差多為幾天至幾十天。雖然蘭考豫11井水溫、水位突降形態(tài)與某些疑似前兆異常類似，但此異常已持續(xù)長達(dá)一年，期間并沒有對(duì)應(yīng)的地震發(fā)生。因此，此異常為地震前兆異常的可能性很小。

2 結(jié)果與分析

2.1 無乳鏈球菌拮抗菌株篩選與鑒定結(jié)果

雙層平板法篩選結(jié)果顯示(圖1(a))，21株備選菌株中有19株有較明顯的抑菌活性(表1)，選取上述菌株進(jìn)行胞外產(chǎn)物的抑菌活性復(fù)篩試驗(yàn)(圖1(b))，結(jié)果表明，共有7株芽孢桿菌的胞外抑菌物質(zhì)對(duì)無乳鏈球菌產(chǎn)生抑菌活性，其中，菌株BA015的CFS對(duì)無乳鏈球菌的拮抗作用最強(qiáng)，抑菌直徑達(dá)到(29.2±0.8) mm，故選擇BA015進(jìn)行后續(xù)拮抗特性研究。

圖1 細(xì)菌篩選結(jié)果Fig.1 Results of screening of partial bacteria

生理生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，拮抗菌BA015與吲哚、硫化氫不發(fā)生反應(yīng)，與V.P、甘露糖、甘露醇反應(yīng)為陽性，除肌醇、棉子糖和精氨酸雙水解酶外與BacillussubtilisATCC 6051基本一致(表2)。16S rDNA序列分析顯示，BA015的16S rDNA序列與BacillussubtilisBEST7613(AP012495.1)的一致性達(dá)到99.9%?；?6S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，BA015與枯草芽孢桿菌聚為一支(圖2)。結(jié)合生理生化特性分析，鑒定菌株BA015為枯草芽孢桿菌。

表1 拮抗菌的抑菌活性Tab.1 Antibacterial activity of antagonistic bacteria

圖2 基于菌株BA015 16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strains based on BA015 16S rDNA

2.2 抑菌物質(zhì)純化及最小抑菌濃度

拮抗菌BA015的CFS經(jīng)不同飽和度硫酸銨純化后的抑菌活性結(jié)果顯示，采用80%飽和度硫酸銨沉淀提取的抑菌物質(zhì)對(duì)指示菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑可達(dá)22.8 mm(表3)。80%飽和度硫酸銨鹽析后的粗提物經(jīng)凝膠柱層析后共收集到15組抑菌物質(zhì)，其中第7、8組抑菌作用最強(qiáng),抑菌直徑分別為22.2、20.8 mm。后經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，活性組分的蛋白質(zhì)量濃度為103.8 μg/mL，抑菌物質(zhì)的MIC為3.2 μg/mL，未檢測到最小殺菌濃度(MBC)。

表2 拮抗菌BA015的生理生化特征

表3 不同飽和度硫酸銨鹽析的抑菌物質(zhì)的抑菌活性

2.3 MALDI-TOF-MS及LC-MSMS檢測結(jié)果

用80%飽和度硫酸銨沉淀的產(chǎn)物經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖3所示。在荷質(zhì)比(m/z)為1 054.48、1 068.47處有離子峰出現(xiàn)，這2個(gè)離子峰均對(duì)應(yīng)于Iturin B的分子質(zhì)量；在m/z值為1 031.45、1 045.50、1 053.47、1 067.47、1 055.47、1 069.48處有離子峰出現(xiàn)，這6個(gè)離子峰均對(duì)應(yīng)于Bacillomycin D的質(zhì)量；在m/z值為1 032.49處有離子峰出現(xiàn)，這個(gè)離子峰對(duì)應(yīng)于Surfactin B的質(zhì)量；在m/z值為1 505.69、1 519.65、1 525.68、1 539.65、1 553.65、1 543.64處有離子峰出現(xiàn)，這6個(gè)離子峰均對(duì)應(yīng)于Fengycin A的質(zhì)量(表4)[12-21]。

圖3 枯草芽孢桿菌BA015脂肽類物質(zhì)的MALDI-TOF-MS分析Fig.3 MALDI-TOF-MS analysis of lipopeptide fraction from Bacillus subtilis BA015

LC-MSMS檢測質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過UniProt蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索分析，比對(duì)酶切肽評(píng)分值較低，共檢測到21個(gè)可信蛋白比對(duì)結(jié)果，未見有抗菌活性的相關(guān)報(bào)道。

2.4 拮抗菌活性組分的主要特性

從表5可見：溫度處理試驗(yàn)顯示，芽孢桿菌活性組分熱穩(wěn)定性良好，不同溫度處理后各組的抑菌活性僅略有降低，但組間差異不明顯；pH處理試驗(yàn)顯示，芽孢桿菌活性組分對(duì)pH不敏感，pH適應(yīng)范圍廣，不同酸堿條件處理后各處理組的均保持良好；紫外照射處理試驗(yàn)顯示，芽孢桿菌活性組分對(duì)紫外不敏感，具有較好穩(wěn)定性，幾乎不受紫外照射影響；拮抗菌BA015活性組分可與茚三酮水溶液反應(yīng)顯紅色；蛋白酶處理試驗(yàn)顯示，芽孢桿菌活性組分抑菌活性對(duì)其不敏感，抑菌活性仍保持穩(wěn)定；有機(jī)溶劑處理試驗(yàn)顯示，芽孢桿菌活性組分抑菌活性對(duì)其不敏感，乙醇處理組與對(duì)照組相比，直徑大小僅損失約10%。

表4 活性組分的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析

表5 理化因素對(duì)活性組分抑菌活性的影響

3 討論

3.1 無乳鏈球菌拮抗菌篩選與鑒定

無乳鏈球菌宿主眾多、致病性高，可突破血腦屏障進(jìn)行繁殖[22]，已受到廣泛關(guān)注。本研究中以21株芽孢桿菌作為備選菌株，以無乳鏈球菌作為指示菌株，在初篩得到19株具有拮抗無乳鏈球菌作用的菌株基礎(chǔ)上，復(fù)篩中發(fā)現(xiàn)菌株BA015的去菌體發(fā)酵液對(duì)無乳鏈球菌抑制作用最強(qiáng)，經(jīng)鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌。BA015在初篩時(shí)抑菌活性與復(fù)篩時(shí)存在差異，這可能是由于菌株間相互作用機(jī)制復(fù)雜，胞外產(chǎn)物只是其中一個(gè)影響因素，這一現(xiàn)象也進(jìn)一步證實(shí)了微生物拮抗作用的復(fù)雜性。

本研究中拮抗菌的初篩與復(fù)篩均采用瓊脂擴(kuò)散法，瓊脂擴(kuò)散法是利用待檢測菌在瓊脂表面對(duì)指示菌的生長顯示抑制效果的一種定性篩選方法,因具有操作簡單、使用方便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，是目前較為常用的檢測方法，在篩選拮抗菌、測定抗生素效價(jià)、抑菌藥敏試驗(yàn)等方面都有廣泛應(yīng)用[23-25]。

3.2 抑菌物質(zhì)分析

BA015的去菌體發(fā)酵液采用80%飽和硫酸銨鹽析后的粗體物，經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析分離出的第7、8組活性組分抑菌作用最強(qiáng)。對(duì)其進(jìn)行LC-MSMS質(zhì)譜檢測，結(jié)果與蛋白質(zhì)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)并無抑菌相關(guān)的蛋白質(zhì)。經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)，有Iturin、Bacillomycin、Surfactin和Fengycin類脂肽同系物。后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證顯示，理化因素對(duì)柱層析后的第7、8組活性組分影響均不明顯，這一特點(diǎn)符合脂肽類物質(zhì)的特征，由此推斷，脂肽為BAO15的主要抑菌物質(zhì)。

本研究中使用的MALDI-TOF-MS和LC-MSMS是目前物質(zhì)組分鑒定工作中較多使用的方法。MALDI-TOF儀器是最容易操作的MS儀器，對(duì)肽的檢測也十分精確、靈敏[12]。因此，MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)常應(yīng)用于鑒定脂肽、基因分型分析、鑒定病原體、質(zhì)譜成像等[26-27]。使用LC-MSMS所建立的分析方法通常具有較短的分析時(shí)間、較高的監(jiān)測感度及較高的選擇性，適合應(yīng)用于微量分析物的定性確認(rèn)與定量分析方法的開發(fā)[28]。LC-MSMS常應(yīng)用于酒中物質(zhì)殘留、中藥活性成分測定、菌株產(chǎn)物鑒定等[29-30]。

3.3 脂肽及其在疾病防控中的應(yīng)用

脂肽一般是革蘭氏陽性芽孢桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[11]，作為一種細(xì)菌產(chǎn)生的由核糖體合成的抗菌肽，對(duì)相似或近緣菌株的生長有一定的抑制作用。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌脂肽一般具有抗真菌、抗細(xì)菌、抗支原體、抗病毒、抗血凝、抗腫瘤、抗昆蟲活性及表面活性劑的特性。其抑菌譜廣、穩(wěn)定性高，對(duì)熱、酶不敏感，能抗紫外照射[31]。因此，近年來對(duì)脂肽研究十分活躍，涉及許多領(lǐng)域。脂肽用于抗菌方面，如Sim等[32]將D-enantiomeric和脂肪酸共價(jià)添加到抗菌肽桿菌素中以增強(qiáng)其抗菌活性。在人類醫(yī)療方面,如Li等[33]用葡萄球菌Staphylococci中得到的脂肽激活β-連環(huán)蛋白抑制皮炎。由于抗菌脂肽具有區(qū)別于常規(guī)抗生素的全新抗菌機(jī)制，不僅不易產(chǎn)生耐藥性，而且對(duì)傳統(tǒng)藥物已具有耐藥性的菌株仍然有良好的抑菌或殺菌功效，因此，本文為尋找抑制動(dòng)物細(xì)菌感染、安全無殘留的抑菌物質(zhì)提供了新思路，使脂肽成為綠色安全、新型高效的水產(chǎn)抗菌藥物的研發(fā)方向。

4 結(jié)論

1) 拮抗菌BA015的去菌體發(fā)酵液經(jīng)80%飽和度硫酸銨沉淀后抑菌直徑可達(dá)22.8 mm，MIC為3.2 μg/mL，因此，菌株BA015及其去菌體發(fā)酵液對(duì)無乳鏈球菌具有較好的抑制效果。

2) MALDI-TOF-MS分析結(jié)果確定脂肽含有伊枯菌素(Iturin)、桿菌霉素(Bacillomycin)、表面活性素(Surfactin)、芬薺素(Fengycin)等，因此，BA015的主要抑菌物質(zhì)為脂肽。